马杜拉放线菌属(actinomadura)色蛋白及相关物质的发酵及纯化的制作方法

专利名称：：马杜拉放线菌属(actinomadura)色蛋白及相关物质的发酵及纯化的制作方法
技术领域：
：本发明是关于产生及纯化由马杜拉放线菌属04c^ioma^rasp)21G792所产生的活性色蛋白的方法。所述色蛋白可用于研制医药组合物及治疗诸如癌症或细菌感染等疾病。背景技水烯二炔是由放线菌目(A"i加m);c"dw)成员产生的有效细胞毒性聚酮种类，其已用于治疗癌症。烯二炔药物的典型作用模式是通过单链及双链DNA裂解。DNA裂解通过由自烯二炔环的伯格曼(Bergman)型环芳构化产生的双自由基自脱氧核糖糖骨架夺氢诱导。当前已有两种烯二炔经批准用于临床治疗癌症与CD33单克隆抗体偶联的卡奇霉素(calicheamicin)(麦罗塔(Mylotarg)⑧，美国)及偶联聚(苯乙烯-共-马来酸)的新制癌菌素(neocarzinostatin)(日本)。可将烯二炔天然产物分成两个亚类。第一亚类的特征在于二环[7，3，0]十二垸二炔(即，九元)烯二炔核心或其前体，且第二亚类的特征在于二环[7，3,1]十三烷二炔(即，十元)烯二炔核心。九元烯二炔的实例包括新制癌菌素、C-1027、可达菌素(kedarcidin)、大分子霉素(macromomycin)、N1999A2及马杜拉霉素(madur叩eptin)。十元亚类的实例包括卡奇霉素、埃斯波霉素(esperamicin)、达内霉素(dynemicin)及纳美那霉素(namenamicin)。除N1999A2外，九元烯二炔不同于十元烯二炔的额外特征是所有九元烯二炔都以烯二炔-蛋白质复合物形式产生，其中烯二炔生色团通过非共价结合附接到无活性的脱辅基蛋白(ap叩rotein)上。为此，九元烯二炔通常被称为色蛋白。我们认为脱辅基蛋白起至关重要的作用，其稳定不稳定的九元烯二炔生色团并使细胞毒性生色团靶向递送至染色质。数种脱辅基蛋白的氨基酸序列已通过直接对脱辅基蛋白实施测序或通过自经克隆DNA序列推导氨基酸来确定。到目前为止，经识别的脱辅基蛋白是小的酸性蛋白(108-114个氨基酸，aa)，其通过移除32-34做氨基-末端前导肽自脱辅基蛋白前体产生。两种色蛋白(新制癌菌素及C-1027)的生物合成途径已经克隆及测序。在这些4情况下，编码脱辅基蛋白的基因与有关生色团生物合成所需要的基因簇集在一起。色蛋白复合物的脱辅基蛋白组份为定向改变药物特性提供了有吸引力的靶标。例如，若发现脱辅基蛋白氨基酸或核酸序列，则可使用既定分子生物学技术(例如位点定向诱变)改变脱辅基蛋白的生色团-结合基序以产生经合理改变的脱辅基蛋白，所述脱辅基蛋白与其天然生色团更强或更弱结合。而且，脱辅基蛋白的所述改变可能导致(例如)毒性降低的色蛋白或效能或稳定性增加的生色团。另外，对脱辅基蛋白实施大量处理可使脱辅基蛋白的结合特异性且因此作为与烯二炔生色团极为不同的分子的靶向药物递送媒剂的能力大大改变。同样，烯二炔生色团是修饰的靶标。一种改变生色团的方式是对参与其生物合成的基因进行处理。因此，需要新颖色蛋白及分离及定性参与其合成的基因及蛋白。此外，我们也期望有效产生及纯化色蛋白的方法。
发明内容本发明是关于由陆生放线菌马杜拉放线菌属21G792(NRRL30778)产生的高效能抗癌色蛋白。马杜拉放线菌属21G792色蛋白是包含九元烯二炔的脱辅基蛋白与生色团的非共价复合物。本发明提供马杜拉放线菌属21G792生色团的新颖异型体以及包含所述新颖异型体的色蛋白。具体来说，本发明提供包含具有以下结构的生色团的活性色蛋白及结构[l]及[2]在本文中或被分别称为生色团-b及生色团-C。在另一方面中，本发明提供可达成提高的色蛋白产量的发酵方法。所述发酵方法纳入经调配以使色蛋白产生最大化且使色蛋白不稳定性及降解最小化的培养基。在另一方面中，本发明提供纯化马杜拉放线菌属2〗G792色蛋白的方法。本发明揭示适于自大规模发酵获得色蛋白的规模可变的纯化方法。本发明也揭示分离色蛋白异型体的方法。本发明提供马杜拉放线菌属21G792色蛋白及脱辅基蛋白的基本上纯净形式以及包含所述色蛋白的医药组合物及投与所述色蛋白的方法。已显示色蛋白的某些异型体可用于治疗癌细胞及肿瘤。本发明进一步提供产生及纯化生物活性经改变的马杜拉放线菌属21G792色蛋白(包括脱辅基蛋白及生色团物质)的变体的方法。所述变体脱辅基蛋白可能具有经改变的生色团结合特性、经改变的靶特异性、或其组合。应了解，本发明提供产生大量脱辅基蛋白及色蛋白的方法。应进一步了解，本发明可达成识别能够产生烯二炔相关化合物的其它生物体或在(例如)能够产生烯二炔相关化合物(例如马杜拉放线菌属21G792)的生物体中识别参与色蛋白合成的基因。另外，应了解，本发明提供脱辅基蛋白的经修饰形式的产生，所述脱辅基蛋白的经修饰形式(例如)毒性降低、效能增加、或稳定性增加。也应了解，对马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白实施处理可使脱辅基蛋白的结合特异性且因此作为与21G792烯二炔生色团不同的生色团的靶向药物递送媒剂的能力得以改变。最后，应了解，可研制包含马杜拉放线菌属21G792色蛋白的医药组合物并将其投与给患有细菌感染或癌生长的哺乳动物(优选为人类)。图1是马杜拉放线菌属21G792色蛋白的HPLC色谱图。HPLC的分析条件如下。柱东曹哈斯(TosoHaas)DEAE5PW(10|im粒径，尺寸为7.5mmx7.5cm)。缓冲剂0-0.5M线性梯度NaCl与恒定0.05MTris-HCl(25min'流速为0.8ml/min)。图2是马杜拉放线菌属21G792色蛋白的UV光谱。图3是21G792脱辅基蛋白的HPLC色谱图。HPLC的分析条件如下。柱VYDAC蛋白质C4(300A，尺寸为3.0xl00mm)。溶剂存于H20中的10-30%乙腈与恒定0.05%TFA(6分钟，2ml/min)。图4是21G792脱辅基蛋白的UV光谱。图5显示脱辅基蛋白的分子量测定(12.92409kDa，通过基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)实施)。图6绘示马杜拉放线菌属21G792生色团物质(生色团-b、-c、及-d)的结构。图7提供21G792脱辅基蛋白前体及脱辅基蛋白的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。推定的核糖体结合位点加以边框线，且前导肽加以下划线。斜线标记表示前导肽及脱辅基蛋白的裂解位点。图8绘示马杜拉放线菌属21G792色蛋白基因簇的开放读码框。位于粘粒41417上的基因由^/箭头上方的实线表示。位于粘粒21gD上的那些通过由小破折号构成的虚线表示，且位于粘粒21gB上的那些通过由大破折号构成的虚线表示。用于识别每一粘粒的探针的位置由黑色杠铃表示。(P)及￡C0RI(E)限制位点经标记。图9绘示马杜拉放线菌属21G792生色团的酪氨酸衍生组份(3-[2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基]-3-羟基-丙酸)的合成途径。图10绘示w/77基因产物的结构域。缩合(C)、腺苷酰化(A)及肽-载体蛋白(PCP)结构域的核心基序加以边框线并予以标记。构成0《/7基因产物及C-1027生物合成途径的SgcC4的A结构域底物特异性密码的残基以粗体表示并加以下划线。相同残基用星号加以标记，冒号表示保守残基且分号表示半保守残基。图11绘示马杜拉放线菌属21G792生色团的马杜拉胺(madurosamine)(4-氨基-4-去氧-3-C-甲基-卩-吡喃核糖)组份的合成途径。图12绘示Orf38与dNDP-葡萄糖-4，6-脱水酶及UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶的比对。包括于比对中的葡萄糖-4,6-脱水酶序列是来自寝屋川链霉菌(&r印tomyc"ne戸gawaensis)伴刀球霉素(concanamycin)A基因簇的Orf5(AAZ94396)、来自粘土链霉菌(&r印fomyce:yflrg"/acei^)光辉霉素(m池ramycin)基因簇的MtmE(CAA71847)、及来自壮观链霉菌(Skeptomycw^e"aW"s)大观霉素(spectinomycin)基因簇的SpcE(AAD31797)。包括于比对中的葡萄糖醛酸脱羧酶序列是来自豌豆(P"歸加!'v,)的Uxsl(BAB40967)、来自拟南芥(/lm&V/c7/w;y^/Z""fl)的Uxs3(AAK70882)、来自拟南芥的Uxsl(AAK70880)、来自拟南芥的Uxs2(AAK70881)、来自小家鼠(Miwmiwcwhw)的Uxsl(AAK85410)及来自新型隐球菌(D7pf0c0cc附neo/omra"s)的Uxsl(AAK59981)。相同残基用星号加以标记，冒号表示保守残基且分号表示半保守残基。图13绘示马杜拉放线菌属21G792生色团的2-羟基-3，6-二甲基苯甲酸组份的合成途径。图14绘示Orf31与十芳酸-AMP连接酶的A4及A5核心基序之间区域的比对。结构锚标以黑色阴影。提出的羧酸结合口袋的组成标以灰色阴影。提出参与辨别DHBA与水杨酸间的激活的残基用数字符号表示。相同残基用星号加以标记，冒号表示保守残基且分号表示半保守残基。图15绘示产生马杜拉放线菌属21G792生色团的烯二炔核心的生物合成途径。图16绘示Orf5与SgcE及NcsE烯二炔PKS的结构域组织及比较。Aa，氨基酸；KS，酮合酶；AT，乙酰基转移酶；ACP，酰基载体蛋白；KR，酮还原酶；DH，脱水酶；TD，末端结构域。图17绘示马杜拉放线菌属21G792生色团的四种组份的组装途径。图18是显示马杜拉放线菌属21G792色蛋白在DEAE琼脂糖凝胶阴离子交换柱上的洗脱特性曲线的色谱图。图19是显示马杜拉放线菌属21G792色蛋白在苯基琼脂糖凝胶HP柱上的洗脱特性曲线的色谱图。图20是显示马杜拉放线菌属21G792色蛋白在超级葡聚糖(S叩erdex)75尺寸分级分离柱上的洗脱特性曲线的色谱图。图21显示超级葡聚糖75流份6的苯基5PW色谱图(在230nm处的吸光度)(图A)及色蛋白及脱辅基蛋白峰的吸收光谱(200-400nm)(图B)。图22显示超级葡聚糖75流份6的生物硅SEC125(BioSilSEC125)色谱图(图A)及共洗脱的色蛋白及脱辅基蛋白的吸收光谱(图B)。图23显示来自各纯化步骤的发酵液及相关柱流份的含色蛋白样品的SDS-PAGE分析。在还原条件下分离蛋白质并进行染色(考马斯(Coomassie))。在31与36.5kDa间移动的主要带确定为色蛋白。泳道1及18:MW标准物；泳道2:澄清发酵液(DEAE装载)；泳道3:DEAE0.25M池；泳道4:DEAE流份D1;泳道5:DEAE流份D2;泳道6:DEAE流份D3;泳道7:苯基琼脂糖凝胶池8;泳道8:苯基琼脂糖凝胶流份P9(色蛋白)；泳道9:苯基琼脂糖凝胶流份P10(色蛋白)；泳道10:苯基琼脂糖凝胶流份P11;泳道ll:苯基琼脂糖凝胶流份Pi4(脱辅基蛋白)；泳道12:苯基琼脂糖凝胶流份P15(脱辅基蛋白)；泳道13:超级葡聚糖75装载(2(^1);泳道14:超级葡聚糖流份S5;泳道15:超级葡聚糖流份S6;泳道16:超级葡聚糖流份S7;泳道17:超级葡聚糖流份S8。图24显示马杜拉放线菌属21G792色蛋白(流份S6)的SDS-PAGE分析，所述马杜拉放线菌属21G792色蛋白依序通过阴离子交换色谱法、疏水作用色谱法、及尺寸排除色谱法进行纯化。在37.0与28.9kDa间移动的主要带确定为色蛋白。泳道1及5:MW标准物；泳道2:色蛋白参考标准物；泳道3:超级葡聚糖75流份S6;泳道4:参考标准物与超级葡聚糖75流份S6的混合物。图25显示含有相关生色团异型体的色蛋白的分离。使用苯基琼脂糖凝胶HP来分离色蛋白制剂。峰B对应于包含生色团-b的色蛋白-b。峰A包括包含生色团-c及-d的色蛋白-c及-d。脱辅基蛋白自色蛋白物质单独洗脱出来。图26显示苯基琼脂糖凝胶池的烯二炔组成(图25的峰A及B)。图27是展示在大于100ng/ml色蛋白浓度下在p21-健全型及p21-缺陷型HCT116人类结肠癌细胞中发生的21G792色蛋白诱导的剂量依赖性DNA链断裂的图。图28是DNA裂解分析，其显示21G792色蛋白诱导的单链断裂及双链断裂，反应持续进行24小时，且DNA裂解不需要硫醇试剂。图29绘示组蛋白Hl被马杜拉放线菌属21G792色蛋白消化且DNA可抑制此消化。蛋白酶抑制剂是PMSF、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、及胃酶抑素A。脱辅基蛋白不具有活性。图30绘示组蛋白Hl、H2A、H2B、H3、及H4对被马杜拉放线菌属21G792色8蛋白消化的相对灵敏性。诸如髓磷脂碱性蛋白等碱性蛋白也易于裂解，但中性/酸性蛋白并不如此。图31绘示在经马杜拉放线菌属21G792色蛋白处理的细胞中组蛋白Hl减少，但在经博来霉素或卡奇霉素处理的细胞中并不如此。图32A是蛋白质免疫印迹，其显示将HCT116细胞暴露于多种浓度的色蛋白下导致p53/p21检査点激活。图32B绘示聚-ADP-核糖磷酸化酶(ParP)裂解时p53的丝氨酸-15氨基酸残基磷酸化。图33及34的一系列图显示在无胸腺(裸)小鼠中21G792色蛋白对抗经皮下注射的LoVo(结肠癌)、HCT116(结肠)、HT29(结肠)、LOX(黑色素瘤)、HN5(头及颈)、及PC-3(前列腺)细胞肿瘤的活体内效能。图35绘示HCT116细胞对经FITC标记的马杜拉放线菌属21G792色蛋白的摄取。图36绘示HCT116细胞对经FITC标记的马杜拉放线菌属21G792色蛋白及脱辅基蛋白的摄取。图37绘示经标记马杜拉放线菌属21G792色蛋白在浓度为其10倍多的未经标记色蛋白存在下的摄取。图38绘示能量偶合剂(叠氮化钠)或微管蛋白破坏剂(诺考达唑(nocodazole))对HCT116细胞摄取马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的影响。图39绘示单克隆抗体与马杜拉放线菌属21G792生色团衍生物的连接。具体实施例方式烯二炔抗生素由通常属于放线菌目的多种生物体产生，包括但不限于链霉菌属(S的ptom;yce力、小单孢菌属(M!'CTOmwuwpora)、及马杜拉放线菌属等属。本发明是关于由保存于美国农业研究菌种保藏中心(AgriculturaIResearchServiceCultureCollection)(NRRL，1815北方大学街(NorthUniversityStreet),皮奥里亚市(Peoria)，III.，61064)的马杜拉放线菌属21G792产生的新颖色蛋白。根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的条款实施保存。马杜拉放线菌属21G792的登记号为NRRL30778。在迄今为止已知的所述生物体中，马杜拉放线菌属21G792似乎与以ATCC39144保存的马杜拉放线菌属菌株最为相似(美国专利第4,546,084号)。如通过16SrDNA序列所评价，所述菌株是相关种类或亚种。本发明提供新颖色蛋白及生色团。已发现马杜拉放线菌属21G792产生多种相关生色团。所述生色团分别与脱辅基蛋白复合形成多种相关色蛋白。因此，本发明提供如图6所绘示的生色团-b、生色团-c、及生色团-d。至少生色团-b及生色团-c具有抗肿瘤及抗细菌活性。本发明提供发酵及培养马杜拉放线菌属21G792的方法。马杜拉放线菌属21G792的培养可在多种液体培养基中实施。可用于产生马杜拉放线菌属21G792色蛋白的培9养基包括可同化的碳来源，例如糊精、蔗糖、糖蜜、甘油等；可同化的氮来源，例如蛋白质、蛋白质水解物、多肽、氨基酸、玉米浆等；及无机阴离子及阳离子，例如钾、钠、铁、镁、铵、钙、硫酸根、碳酸根、磷酸根、氯离子等。诸如硼、钼、铜等痕量元素通常作为培养基其它组成的杂质提供。例如，常见的氮来源马顿J-l(MartoneJ-l)含有铁、镁、及其它痕量金属。已发现，包括某些卤化物盐会达成生长改良及色蛋白产生的显著增加。先前，已观察到包括碘化物盐对于含碘生色团的产生具有有益效果，但卤化物对不含碘的马杜拉放线菌属21G792生色团的产生的效果却未预料到。包括溴化物盐也达成生长及色蛋白产量的改良。然而，氯离子量的变化无明显影响。马杜拉放线菌属21G792的培养物可使用含有葡萄糖的复杂碳水化合物，例如糖蜜及水解淀粉。对于大规模发酵，为达成一致结果，我们期望使用包含确定碳来源的培养基。除葡萄糖之外，支持在管式发酵中生长及产生色蛋白的可用碳来源也包括蔗糖及麦特灵(maltrin)。不支持良好色蛋白产量的碳来源包括麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油、大豆油、及棉籽油。在大规模发酵中，葡萄糖是优选碳来源。在包括葡萄糖、蔗糖、及果糖的大规模发酵中，在发酵期间仅使用葡萄糖(即使蔗糖在管式发酵中也可同化)。对于马杜拉放线菌属21G792,可用的氮来源是蛋白胨。然而，对于药剂生产通常期望非动物衍生的氮来源。己对多种非动物氮来源进行测试，其中马可马顿J-l(MarcorMartoneJ-l)提供尤佳结果(参见实例)。产生相当产量的其它优选非动物氮来源包括马可马顿L-l、马可(Marcor)豆类蛋白胨、安伯芳4415(Amberferm4415)、哈赛T(HySoyT)。可用但产生较低产量的非动物氮来源的其它实例包括安伯芳4000、安伯芳4015、安美赛(Amisoy)、玉米水解物、小麦水解物(DMVInternational弁WGE80M)、及药用培养基(Pharmamedia)。当氮来源是大豆水解物(DMVInternational弁SE50MAF)或75%大豆水解物与25%小麦水解物的混合物时，未检测到产物。为获得具有生物活性的含蛋白质产物，避免可使隐藏或释放到发酵培养基中的蛋白质降解的应力极为重要。在通常涉及机械搅动或混合及通过喷雾器引入空气(或氧气)的大规模发酵中，需要谨慎选择防沫剂以提供优良产量。根据本发明，普朗尼克L-61、普朗克尔P2000(聚丙二醇)及安他罗克17-R2表面活性剂己经确定可用于产生脱辅基蛋白与生物活性分子的复合物。所述表面活性剂尤其可用于诸如马杜拉放线菌属21G792色蛋白、可达菌素、及C-1027等含有烯二炔的色蛋白。在所测试的表面活性剂中，普朗尼克L-61使马杜拉放线菌属21G792色蛋白的产量最高。所述色蛋白也可用普朗克尔P2000(聚丙二醇)及安他罗克17-R2产生，但量降低。几乎不产生色蛋白的表面活性剂是普朗尼克L-31、普朗尼克L-81、普朗尼克L-101、克勒劳尔(Clerol)FBA515B、克勒劳尔FBA265、克勒劳尔FBA975-US、克勒劳尔5074、及安他罗克BL-214。在本发明的特定实施例中，发酵培养基包含8.75g/L葡萄糖单水合物、0.01g/L10七水硫酸亚铁、0.02g/L七水硫酸镁、2.0g/L碳酸钙(密西西比(Mississippi)TMUme)、4.0g/L马可马顿J-1、2g/L三水乙酸钠、0.5g/L碘化钾、及0.5g/L普朗尼克L-61。在本发明的另一实施例中，发酵培养基包含8.75g/L葡萄糖单水合物、0.01g/L七水硫酸亚铁、0.02g/L七水硫酸镁、2.0g/L碳酸钙(密西西比TMLime)、4.0g/L马可马顿J-1、2g/L三水乙酸钠、0.5g/L溴化钠、及0.5g/L普朗尼克L-61。本发明也提供基本上纯净的蛋白质及多肽。本文所用的关于给定多肽的术语"基本上纯净"意指多肽基本上不含其它生物大分子。例如，基本上纯净的多肽以干燥重量计至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约95%、或约99%纯净。可通过所属
技术领域：
的技术人员所习知的任何适当标准方法来测量纯度，例如，通过柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析。应了解，基本上纯净的蛋白质包括基本上纯净的色蛋白，所述色蛋白是脱辅基蛋白与烯二炔生色团的复合物。在本发明实施例中，通过阴离子交换色谱法自发酵培养基或马杜拉放线菌属21G792提取物中纯化色蛋白。所述方法可提供色蛋白的有效浓縮并移除(连同其它杂质一道)在发酵中产生的大多数不期望色素。在一个实施例中，阴离子交换树脂是DEAE琼脂糖凝胶FF。将含有色蛋白的色谱装载调节至pH8.3并应用到阴离子交换树脂。通过增加流动相的离子强度来洗脱色蛋白物质。在特定实施例中，用0.25MNaCl阶式梯度来洗脱色蛋白且在最初两个柱体积中回收大多数活性物质。视装载体积及柱尺寸而定，当自澄清发酵液中纯化色蛋白时，浓度可大于10倍。在本发明的另一实施例中，通过疏水作用色谱法来纯化马杜拉放线菌属21G792色蛋白。所述纯化方法将色蛋白与脱辅基蛋白分开，移除其它蛋白质及非蛋白质组份，并使色蛋白有效浓缩。此固体载体可为任何有机、无机或复合材料，其为适合于色谱法的经(例如)聚(烷二醇)(聚(丙二醇)、聚(乙二醇))、垸烃、烯烃、炔烃、芳基、1，4-丁二醇二縮水甘油醚或赋予载体疏水特征的其它分子衍生化的多孔、超多孔或无孔材料。在特定实例中，使用pH值约为8.2的苯基琼脂糖凝胶HP并用最终为100mMNaCl的梯度来洗脱色蛋白。依赖色蛋白与基质结合(例如，阴离子交换、疏水作用)的分级分离通常使用柱来实施，但或者可以分批过程实施。例如，作为离子交换柱色谱法的替代方案，可使用使色蛋白物质与诸如葡聚糖凝胶(S印hadex)A50等适宜阴离子交换剂结合的分批过程。在分批过程中，在室温搅拌下使含有色蛋白的溶液(例如，通过添加1/50体积1MTrispH8.3实施缓冲以便于储存的澄清发酵液)过夜分批吸收到于20mMTrispH8.3中平衡的葡聚糖凝胶A50浆液中。当溶液是澄清发酵液时，葡聚糖凝胶A50与澄清发酵液的可用体积比是1:15。在测定完全结合时，通过过滤收获葡聚糖凝胶并(例如)用12体积20mMTrispH8.3洗漆。在搅拌30min后用20mMTris，250mMNaClpH8.3以分批模式洗脱色蛋白物质。随后将滤液调节至适于下一纯化步骤的结合条件。例如，当下一步骤是结合苯基琼脂糖凝胶HP时，如本文中所例示，苯基琼脂糖凝胶HP的结合条件可通过添加固体硫酸铰至1.5M浓度及0.45pm过滤获得。在本发明的又一实施例中，马杜拉放线菌属21G792色蛋白是通过可移除高及低分子量蛋白质组份的尺寸排除色谱法来纯化。例如，凝胶过滤色谱法使用尺寸排除树脂以借助分子量分离各物质。其它手段包括但不限于用适宜排除膜的超滤及疏水技术。适宜基质包含丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)S-200、超级琼脂糖凝胶12(Superose12)、琼脂糖凝胶S-300、超级葡聚糖、三羟甲基丙烯酸(Trisacryl)、丙烯酰胺、葡聚糖凝胶或所属
技术领域：
的技术人员所习知的能够分级分离期望尺寸范围内样品的类似树脂。凝胶过滤可在约2'C至约25X:温度下实施。一般来说，对于色蛋白纯化，色谱步骤在室温下实施。适宜缓冲剂包含约0.1至约1.0M盐，优选为NaCl，pH值为约7至约8.5。在一个实施例中，色谱基质分离范围的下限为约3x103。在另一实施例中，色谱基质分离范围的上限为约106。在本发明的特定实施例中，尺寸排除基质是超级葡聚糖75，其分离范围为自约3x103至约7x105。当分离基质是超级葡聚糖75时，可使用20mMTris，100mMNaCipH8.2来分离色蛋白制剂。所属
技术领域：
的技术人员将能够优化与特定基质一起使用的缓冲剂。可根据需要汇集所收集的含有色蛋白的流份以(例如)使产量最大化或使杂质最少化。在优选实施例中，可依序使用两种或更多种纯化方法。视柱体积(CV)及所汇集的洗脱CV的数量而定，色蛋白的浓縮可在每一纯化步骤中达成。另一选择为或另外，可通过所属
技术领域：
的技术人员所习知的其它方法来浓縮色蛋白，例如硫酸铵沉淀、微浓縮、及诸如此类。根据本发明，可对一或多种色蛋白物质实施分离或纯化。在本发明实施例中，使用经选择利于色蛋白产量的发酵条件来生长马杜拉放线菌属21G792。一般来说，通过如上文所描绘的三步骤过程来纯化色蛋白物质。可通过疏水作用色谱法来分离色蛋白物质。在所提供的实例中，苯基琼脂糖凝胶色谱法产生两个色蛋白峰(含有三种色蛋白物质)。此外，脱辅基蛋白的相对量降低。色蛋白及生色团生物合成途径的组份或所述组份的前体(即，脱辅基蛋白前体)由称为色蛋白生物合成基因簇的一组邻近开放读码框(o^编码。因此，本发明提供编码马杜拉放线菌属21G792色蛋白生物合成基因簇的o/;f(参见表1)或其表达(即，经处理的)片段(例如，脱辅基蛋白；SEQIDNO:150)的经分离核酸。在一个实施例中，本发明提供具有编码以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO龍SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQ12IDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、或SEQIDNO:150。在优选实施例中，所述核酸包含以下核苷酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDN0:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。应了解，本发明核酸包括互补序列。表121G792色蛋白基因簇的开放读码框<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>Orf开始/终止(碱基对(bp))SEQIDNO长度(aa)SEQIDNOOrf开始/终止(bp)SEQIDNO长度(aa)SEQIDNOl承8971/747517498183762785/64128914479219268/1026319331203864131/651179332894210592/1149421300223965134/667539553996311498/1353423678244068054/668349740698413541/1453325330264168270/6929299340脂514530/20364271944284269375/70757101460102620369/2082729152304371889腦46103347104720824/2137531183324472452/72036105106821372/2276633464344572706/74379107557108923607/2285235251364675114/744221092301101024877/2386737336384775189/764001114031121125277/2593339218404877794/764601134441141225930/2758841552424978801/779681152771161327602/2869943365445078892/795331172131181428792/2957745261465180344/795441192661201529591/3028047229485280936/803461211%1221630631/303444995505381022/813511231091241730845/34207511120525481348/817761251421261834204/3581753537545582077/829551272921281935852/3749855548565682998/840111293371302037516/3889857460585784224/852821313521322139250/4057859442605885643/85434133691342240705/4228261525625987546/857681355921362343151/4265463165646087826/87647137591382443376/4476165461666187909/87832139251402544805/4603167408686288485/879821411671422646045/4719069381706388571/893501432591442747187/4841671409726489542/899761451441462849128/48430732327465结束[90573〗/89980147不完整148*-参与初级代谢14本发明提供在严格杂交条件下与以下序列特异性杂交(或特异性结合)的核酸SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDN0:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQlDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDN0:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDN(H45、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。本发明也涵盖与上述序列特异性结合以达到核酸密码简并性的核酸。所述核酸可具有足够长度以编码完整蛋白质(例如，完整o咲)或其片段。本发明也包括编码经修饰蛋白质的核酸。蛋白质修饰的实例包括但不限于与诸如抗体、抗体片段、受体配体及诸如此类等靶分子融合。所述核酸进一步包括探针及引物。在某些实施例中，探针或引物可为简并性的。此外，依照其使用，探针及引物可为单链或双链。探针及引物包括(例如)长度为至少约12个核苷酸、优选长度为至少约15个核苷酸、且最优选长度为至少约18个核苷酸的寡核苷酸，且进一步包括可使用本发明引物产生的PCR扩增产物。在严格条件下杂交是指在所述条件下探针优先与其靶子序列杂交且以较低程度或根本不与其它序列杂交。也应了解，在诸如南方及北方杂交等核酸杂交实验背景下的严格杂交及严格杂交洗涤条件是序列依赖性的，且在不同环境参数下有所不同。所属
技术领域：
的技术人员已熟知可调节杂交及洗涤溶液所含物及温度来获得严格杂交条件。严格性依赖于诸如所使用探针的尺寸及核苷酸含量等参数。参见萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆-实验室手册(MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第2版)第1-3巻，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港出版社，NY及一般阐述及实例的其它来源。核酸杂交的另一指导可见于提杰森(Tijssen)，1993，生物化学及分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章，杂交原理及核酸探针分析策略纵览(Overvievvofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays),爱思唯尔(Elsevier),N.Y。优选严格条件是容许探针和与探针大于约90%互补的序列杂交且不和小于约70%互补的序列杂交的条件。一般来说，高度严格杂交及洗涤条件经选择以在已确定15的离子强度及pH值下比特定序列的热熔点(TJ低约5°C。Tm是50%的靶序列与完全匹配探针杂交的温度(在己确定的离子强度及pH下)。对于特定探针来说，非常严格条件经选择以等于Tm。用于在南方或北方印迹法中在过滤器上具有多于100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的实例是50%甲酰胺加1mg肝素、在42'C下并实施杂交过夜。高度严格洗涤条件的实例是0.15MNaCl、在72。C下、约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65'C下实施0.2X标准柠檬酸盐(SSC)洗涤15分钟(参见，萨姆布鲁克等人，1989)。通常，高严格性洗涤之前为低严格性洗涤以除去背景探针信号。对于双链体(例如，具有多于100个核苷酸)来说，中度严格性洗涤的实例是在45'C下实施1XSSC洗涤15分钟。对于双链体(例如，具有多于100个核苷酸)来说，低严格性洗涤的实例是在40'C下实施4-6XSSC洗涤15分钟。通常来说，在特定杂交分析中信噪比是对于无关探针所观察到者的两倍(或更高)表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的多肽基本上一致，则这些核酸仍然基本上一致。当(例如)核酸的拷贝是利用遗传密码所允许的最大密码简并性产生时，可出现此种情况。因此，本发明的核苷酸序列包括与以下序列至少约70%、优选至少约80%、且更优选至少约90%—致的核苷酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:H、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149或其长度为至少约50个核苷酸、更优选至少约100个核苷酸的片段。本发明也是关于产生由生色团基因簇所编码的一或多种蛋白质的方法。所述蛋白质可通过在宿主细胞中表达一或多种包含以下序列的核酸来产生SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。例如，可将一或多种上述核酸与调节控制核酸可操作连接以影响表达并纳入到宿主细胞中的表达载体中。在本发明的一个实施例中，产生脱辅基蛋白或脱辅基蛋白前体。可用于本发明的控制元件包括启动子，其视情况含有启动子序列及核糖体结合位点。也期望其它调节序列，例如那些容许调节与宿主细胞生长有关的脱辅基蛋白或脱辅基蛋白前体的表达的调节序列。调节序列己为所属
技术领域：
的技术人员所习知，且实例包括使基因表达响应化学或物理刺激开启或关闭者，包括存在调节化合物。其它类型的调节元件也可存在于载体中，例如，增强子序列。多种表达载体已为所属
技术领域：
的技术人员所习知，例如，粘粒、PI、YAC、BAC、PAC、HAC。可选标记也可包括于重组表达载体中。我们已知可用于选择经转化细胞系的多种标记且通常包含当在适当选择培养基中培育细胞时其表达赋予经转化细胞可选表型的基因。所述标记包括(例如)赋予质粒抗生素抗性或灵敏性的基因。可将上述载体插入适于蛋白质表达的任何原核或真核细胞中。宿主细胞包括但不限于马杜拉放线菌属、链霉菌属、小单孢菌属、放线菌属、野野村菌属(Nonomurea)、假单胞菌属(&e"必mo朋s)、及诸如此类。优选宿主细胞是诸如马杜拉放线菌属、链霉菌属、及小单孢菌属等天然表达烯二炔的那些物种或菌株(例如细菌菌株)。(参见，例如，菲佛(Pfeifer)等人，2001，科学(Science)291，1790-2;马丁内斯(Martinez)等人，2004，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)70，2452-63)。在一个实施例中，所述蛋白质是在大肠杆菌(五.coh')中表达。表达产物的回收可按照所属
技术领域：
的技术人员所熟知的标准方法实施。因此，例如，可使蛋白质与合适标签一起表达以有助于分离(例如，HiS6标签)。其它标准蛋白质纯化技术也适宜且已为所属
技术领域：
的技术人员所熟知(参见，例如，夸德里(Quadri)等人，1998，生物化学(Biochemistry)37，1585-95;中野(Nakano)等人，1992,分子及普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)232，313-21)。当全部色蛋白基因簇经表达时，则回收色蛋白。通过选择某些or/来表达，可产生色蛋白相关化合物。例如，脱辅基蛋白前体可通过表达or/23来产生。我们也可使用包含以下序列的核酸分子或其片段作为探针SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDN0:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:4、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:紙SEQIDNO:lll、SEQIDNO:U3、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。所述探针可用于识别本发明核酸。我们可通过任何适宜方法来使用核苷酸序列作为探针，包括与在下文实例中所阐述的方法类似者。如本文所述，使用dNDP-葡萄糖-4,6-脱水酶(DH)探针来识别可能含有编码脱辅基蛋白或其它生色团相关蛋白的基因或基因簇的马杜拉放线菌属21G792基因组DNA的粘粒纯系。同样，可在其它生物体中使用本发明核酸来识别编码脱辅基蛋白及生色团相关蛋白(尤其九元环烯二炔生色团)的^/。所述生物体通常包括产生二级代谢物的生物体，例如，真菌、杆状菌、假单胞菌、粘细菌及蓝细菌。优选地，所述核酸可用于识别放线菌目(原核属分类学概要伯杰氏系统细菌学手册⑧(TaxonomicOutlineoftheProcaryoticGenera:Bergey'sManualofSystematicBacteriology),第2版)生物体的基因，所述放线菌目生物体包括但不限于放线菌属、链霉菌属或小单孢菌属等属的生物体。更优选地，核酸可用于识别马杜拉放线菌属种类及亚种的基因。本发明也提供基本上纯净的蛋白质及多肽。本文所用的关于给定多肽的术语"基本上纯净"意指多肽基本上不含其它生物大分子。例如，基本上纯净的多肽以干燥重量计至少75%、80%、85%、95%、或99%纯净。可通过所属
技术领域：
的技术人员所习知的任何适当标准方法来测量纯度，例如，通过柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析。应了解，基本上纯净的蛋白质包括其中脱辅基蛋白与烯二炔分子复合的色蛋白。所述附接可通过(例如)共价或非共价键(例如，氢键)达成。本发明蛋白质及多肽包括由马杜拉放线菌属21G792的色蛋白基因簇的o咲所编码者。在优选实施例中，所述蛋白质及多肽是包含以下序列者SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQ18IDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:l16、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:l46、SEQIDNO:148、或SEQIDNO:150。在特定优选实施例中，所述蛋白质是21G792脱辅基蛋白前体(SEQIDNO:64)或脱辅基蛋白(SEQIDNO:150)(图7)。表2中提供21G792脱辅基蛋白前体及脱辅基蛋白的氨基酸组成。表2马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的氨基酸组成氨基酸数量组成(％)Asp86.02Asn43.01Thr2317.29Ser96.77Glu53.76Gin64.51Pro86.02Gly1612.03Ala1712.78Val2115.79Cys21.50Met21.50lie3.76Leu21.50Tyr21.50Phe32.26也应了解，本发明蛋白质或多肽进一步包括那些具有与上述优选蛋白质及多肽基19本上相同的氨基酸序列者。在本文中将基本上相同的氨基酸序列定义为按照皮尔森(Pearson)及李普曼(Lipman)，1988，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)S5,2444-8通过FASTA搜索方法测定具有至少约70%、优选至少约80%、且最优选至少约90%同源性的序列，包括与以下序列至少约70%、优选至少约80%、且更优选至少约90%—致的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、或SEQIDNO:150。所述蛋白质与马杜拉放线菌属21G792蛋白质具有类似活性，尤其在存在保守氨基酸取代的情况下。保守氨基酸取代定义为凭借改变肽、多肽或蛋白质、或其片段的一或多个氨基酸而实施的氨基酸组成的改变。取代是关于具有一般相似特性(例如，酸性、碱性、芳香性、尺寸、带正电荷或负电荷、极性、非极性)的氨基酸，由此所述取代不会实质上改变相关肽、多肽或蛋白质的特征(例如，电荷、等电点、亲和性、亲合力、构象、溶解性)或活性。在包括但不限于以下的氨基酸群组内选择典型保守取代(1)疏水性..甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);(2)亲水性半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)-,(3)酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);(4)碱性组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R);(5)芳香性苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)及色氨酸(W);(6)影响链定向的残基gly、pro。因此，本发明也包含与21G792脱辅基蛋白具有相似氨基酸组成的脱辅基蛋白及多肽，其中氨基酸序列与SEQIDNO:64或SEQIDNO:150基本上相同，尤其在氨基酸取代为保守取代的情况下。本发明通过(例如)引入一或多种随机或靶向突变、缺失、或插入来改变马杜拉放线菌属21G792色蛋白基因簇的一或多个o《。如此，可对生色团、脱辅基蛋白或二者实施修饰以产生展示(例如)降低的毒性、增加的效能或增加的稳定性的色蛋白。已认识到某些烯二炔生色团在对所述生色团具有特异性的位点处裂解DNA。此外，多种色蛋白对组蛋白具有独特的蛋白水解活性。因此，对马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白及/或生色团实施处理也可提供具有经改变特异性的色蛋白。或者，可对脱辅基蛋白实施修饰以用作精选活性分子的载体或递送媒剂。本发明也提供可与另一生物分子连接的经修饰的马杜拉放线菌属21G792生色团或脱辅基蛋白/生色团复合物。在一个实施例中，所述生物分子提供生色团或色蛋白的特异性靶标。所述生物分子可为(例如)抗体或细胞表面分子或受体的其它配体。例如，可将编码经改变马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的核酸插入到表达载体中及宿主细胞中，在适于表达脱辅基蛋白的条件下对宿主细胞实施培养，并自宿主细胞或培养基回收脱辅基蛋白。优选地，宿主细胞能够产生烯二炔生色团或可与经改变脱辅基蛋白形成复合物的其它分子。所述细胞的实例包括多种产生抗生素的放线菌目生物体，尤其产生烯二炔的诸如马杜拉放线菌属及链霉菌属等生物体。宿主细胞进一步包括诸如大肠杆菌及酵母等常见宿主。当然，经改变的脱辅基蛋白可在马杜拉放线菌属21G792中得以表达。在一个实施例中，经改变的脱辅基蛋白会在宿主细胞中过表达。若在宿主细胞中存在任何其它内源性脱辅基蛋白，则经改变的脱辅基蛋白将以较高水平表达，其它脱辅基蛋白将低表达，或将经改变的脱辅基蛋白与标签一起表达以有助于所述纯化。在优选实施例中，通过同源重组使编码经改变脱辅基蛋白的核酸代替内源性脱辅基蛋白基因。如此，可随后将呈与烯二炔或其它分子(例如，活性剂)的复合物形式的经改变的脱辅基蛋白分离出来，并随后在(例如)癌细胞系下对所述复合物实施筛选以测定生物活性。在再一实施例中，a)在宿主细胞中表达经改变的脱辅基蛋白并在不与烯二炔或其它分子复合下回收，b)随后将经改变的脱辅基蛋白置于多种烯二炔或其它分子的影响下，c)利用可接受的技术来测定脱辅基蛋白是否与烯二炔或其它分子形成复合物，且视情况d)针对生物活性对复合物实施筛选。在再一实施例中，在宿主细胞中表达经改变的脱辅基蛋白并在不与烯二炔或其它分子复合下回收，随后将经改变的脱辅基蛋白置于多种烯二炔或其它分子的影响下，并针对生物活性对复合物实施筛选。在另一实例中，对编码经修饰生色团生物合成途径的核酸施表达。自马杜拉放线菌属21G792生物合成簇表达的多肽的功能可通过将ORF序列与已知蛋白质及序列基序进行比较来推导。(表3)表321G792色蛋白基因簇的ORF的推导功能ORF尺寸类似蛋白质登记号、(％—致14/%相似性)提出的功能<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>ORF尺寸类似蛋白质登记号、(％—致^/%相似性)提出的功能OrflO336转录调节蛋白，KasT，小金色链霉菌(streptomycesfa3SMgae"&)BAC53615,49/63StrR类转录调节子Orfll218推定的调节蛋白，SgcRl，球孢链霉菌(streptomycesg/o^/w赠)AAL06694，58/72未知Orfl2552氧化还原酶，NcsE9，制癌菌素链霉菌AAM78005,79/87氧化还原酶Orfl3365未知，SgcM，球孢链霉菌AAL06686，46/52未知Orfl4261未知，NcsEll，制癌菌素链霉菌AAM78004,61/73未知Orfl5229O-甲基转移酶，弗兰克菌属(Fra"^j)EANlpecZP—0573484,49/67o-甲基转移酶Orfl695NRPSPCP-结构域，NRPS7-5,阿维链霉菌MA-4680BAB69396，41/53芳基载体蛋白Orfl71120II型NRPSA结构域，SgcCl,球孢链霉菌AAL06681,41/49NRPS:C、A、PCPOrfl8537氨基变位酶，SgcC4，球孢链霉菌AAL06680，73/84氨基变位酶Orfl9548推定的卤化酶，弗兰克菌属Cc13ZP_00548729，62〃5卤化酶Orf20460II型NRPSC结构域，SgcC5，球孢链霉菌AAL06678,46/59II型NRPSC结构域Orf21442角鲨烯单加氧酶类蛋白，SgcD2，球孢链霉菌AAL06669,50/56单加氧酶Orf22525跨膜流出蛋白，SgcB，球孢链霉菌AAF13999,48/67跨膜流出蛋白Orf23165假定蛋白，阿维链霉菌MA-4680BAC71199，33/44脱辅基蛋白前体Orf24461腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧壬酸酯氨基转移酶，嗜热共生小杆菌BAD39928,43/58氨基转移酶Orf25408P450羟化酶，Cyp28，阿维链霉菌MA-4680BAC75180，45/59P450羟化酶Orf26381假定蛋白，天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)A3(2)CAC22728,33/46未知Orf27409推定的细胞色素P450氧化还原酶，变铅青链霉菌(streptomyceslividans)1326AAC25766,45/60P450氧化还原酶Orf28232保守的假定蛋白，克劳氏芽孢杆菌(5ac"toc/attwY)KSM-KI6AD63964,51/71未知Orf29466糖基转移酶，SgcA6，球孢链霉菌AAL06670，43/57糖基转移酶23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>ORF尺寸类似蛋白质登记号e，(％—致掛％相似性)提出的功能Orf49277保守的假定蛋白，嗜热子囊菌(77lemio&,a加ca)YXAAZ55273,51/64dNDP-糖差向异构酶Orf50213转录调节蛋白，慢生性大豆根瘤菌BAC49474，45/60TetR家族，转录调节子Orf51266推定的膜蛋白，天蓝色链霉菌A3(2)CAB61706,52/66未知Orf52196推定的TetR-家族转录调节子，天蓝色链霉菌A3(2)CAB71239,30/47TetR家族，转录调节子Orf53109转录调节子，百脉根中慢生根瘤菌BAB53793,50/70ArsR家族，转录调节子Orf54142保守的假定蛋白，茄科雷尔氏菌CAD17332，49/58未知Orf55292LysR家族调节蛋白，弗兰克菌属EANlpecZP—00571435，43/54LysR家族，转录调节子Orf56337A类P-内酰胺酶，Bla，星形诺卡菌AAG44836,46/58未知Orf57352假定蛋白，互营杆菌(Syn"o/;/zo/"c^rZP一00667098,26/40未知Orf5869无-未知Orf59592RNA指导的DNA聚合酶，弗兰克菌属EANlpecZP—00570947，70/80未知Orf6059无-未知Orf6125无-未知Orf62167推定的调节蛋白，天蓝色链霉菌A3(2)CAC44216,40/47调节子Orf63259保守的假定蛋白，天蓝色链霉菌A3(2)CAB62713，32/50未知Orf64144NUDIX水解酶，弗兰克菌属EANlpecZP一00572338,38/56DNA修复Orf65197b推定的结合蛋白依赖性膜内在蛋白质，白喉杆菌(CoJ7nefoacfriwmdi/她eriae)CAE50656,n/aABC转运蛋白a数量以氨基酸计bOrf不完整e给出最接近同系物的NCBI登记号*参与初级代谢与所述功能一致，提供会聚性生物合成途径来合成马杜拉放线菌属21G792烯二炔。分别产生复合物的四种主要组份(烯二炔核心、马杜拉胺、2-羟基-3，6-二甲基苯25甲酸、及3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-羟基-丙酸)并随后组装以形成最终生物活性产物。J-。-禽-3-秀碁4伊髯碁求萄-3-萄募尿度,#教仝教会成。为产生烯二炔的3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基)-3-羟基丙酸-衍生部分(图9)，首先借助or/7S基因产物将酪氨酸转化成p-酪氨酸。Orfl8显示与数种组氨酸及苯丙氨酸解氨酶具有高相似性，但与C-1027生物合成途径的SgcC4最为相似(73%—致性，84%相似性)，所述SgcC4催化卩-酪氨酸转化成(3-酪氨酸。(刘(Liu)等人，2002，科学，297，1170-73;范拉奈(VanLanen)等人，2005，美国化学会志(丄Am.C/iem.Soc)，127，11594-5)。然后，借助o/^7基因产物的腺苷酰化(A)结构域将P-酪氨酸激活成氨酰腺苷酸，并转移至邻近肽载体蛋白(PCP)的磷酸泛酰巯基乙胺基辅基的巯基上，形成p-酪氨酰基-S-Orfl7。Orfl7与一系列非核糖体肽合成酶(NRPS)相似。基于所推导氨基酸序列的序列分析，Orfl7包含三种功能结构域缩合(C)结构域、A结构域及PCP结构域(图10)。参见，康兹(Konz)及马哈耳(Marahiel)，1999，化学及生物学(C/iem.5!W.)，6，R39-R47。A结构域的底物特异性密码是自介于A4与A5A结构域结构基序之间的区域选取，显示特异性密码DPCQVMVIAK(表4)。表4也绘示来自C1027生物合成簇的SgcCl(查理斯(Challis)等人，2000，化学及生物学7，211-24)及来自短杆菌肽生物合成簇的GrsA(史塔克豪斯(Stachelhaus)等人，1999，化学及生物学，6，493-505)的底物及底物特异性密码。表4腺苷酰化结构域底物特异性密码的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>Orfl7与来自C-1027生物合成簇的SgcCl最为相似(41%—致性，49%相似性)。SgcCl编码由单独A结构域构成的II型非核糖体肽合成酶(NRPS)。此酶的活体外定性已显示，其在将P-酪氨酸装载于SgcC2上之前将)3-酪氨酸特异性激活，SgcC2是由单个PGP结构域构成的II型NRPS。(范拉奈等人，2005)。SgcCl与Orfl7的底物特异性密码的比较显示所述密码非常相似(Orfl7的DPCQVMVIAK相对于SgcCl的DPAQLMLIAK)。因为两种酶均激活相同底物，故此相似性并不令人惊奇。有趣的是，m/77的终止密码子与o/y7S的起始密码子重叠3bp，此表明这两种基因的表达可能经转译偶合。使所述基因的表达协调是所期望的，因为在表达但不同时表达可提供P-酪氨酸的or/M时会导致在不提供其预期底物下即产生基因产物。在经由硫酯键装载于Orfl7的PCP上后，由Orfl5对P-酪氨酰基-S-Orf17实施甲基化以得到3-氨基-3-(4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orf17。Orfl5显示与许多S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性O-甲基转移酶具有强相似性且具有与SAM依赖性甲基转移酶所共有的三种序列基序(基序l-WDVGTFTG，SEQIDNO:166;基序2-PAADLVFL，SEQIDNO:167;基序3-LLRPGGLLVA，SEQIDNO:168)。喀甘(Kagan)及克拉克(Clarke),(1994)生物化学与生物物理学档案04m祝oc/^m.fi/op/i}^.)，310，417-427。因为马杜拉放线菌属21G792烯二炔具有单个O-甲基，故Orfl5是最有可能催化此反应的酶。随后使此酶限定的中间体经由Orf39羟化产生3-氨基-3-(3-羟基-4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orfl7。普拉斯特(BlastP)分析表明Orf39是与造成酚类底物羟化的许多羟化酶相似的羟化酶。其与C-1027生物合成簇的SgcC突出地相似(73%—致性，82%相似性)，已在活体外显示其羟化经氯化的(3-酪氨酰基-S-PCP中间体。(刘等人，2002;范拉奈等人，2005)。羟化后，0///9基因产物使芳香环的<:-2位置氯化以产生3-氨基-3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orf17。Orfl9与数种参与二级代谢的烷基卤化酶同源，最显著地与来自C-1027生物合成簇的SgcC3同源(58%—致性，70%相似性)，已显示SgcC3对PCP结合的(3-酪氨酸实施氯化。(刘等人，2002;范拉奈等人，2005)。由于纳入到马杜拉放线菌属21G792烯二炔中的J3-酪氨酸衍生物具有羟基而非氨基，我们可预见3-氨基-3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orf17中间体的氨基经由氧化脱氨作用而被Orf21代替。普拉斯特(BlastP)分析揭示，Orf21显示与数种推定的FAD及NADPH依赖性单加氧酶/羟化酶具有相似性且结构域分析显示其含有与许多单加氧酶所共有的FAD结合结构域。此结构域为氨基酸氧化酶所共有，其中氧化脱氨作用已有许多记载，因此Orf21是实施所述转化的可能候选者。然而，注意到存在数种其它可潜在催化此反应的候选者甚为重要，所述其它候选者包括Orf42，其也与FAD及NADPH依赖性单加氧酶/羟化酶相似。另外，与P450羟化酶相似的两种Orf(Orf25及Orf27)存在于生物合成簇中且因为P450羟化酶也参与氧化脱氨反应，所以这些酶中的一种也可能催化此步骤。(李(Li)等人，2000，细菌学杂志G/,5""er/0/.)182，4087-95)氧化脱氨作用后，可能发生可能由Orf21或一种其它候选酶引入的酮的还原。能够催化此反应的最明显的酶是酮还原酶，其与那些用于聚酮生物合成的酶相似。对马杜拉放线菌属21G792烯二炔生物合成簇实施检查未识别出任何显示与酮还原酶类酶具有相似性的酶。所述簇中存在数种功能未知的可能催化所需还原的酶，或能够催化氧化脱氨作用的酶也可能催化此还原反应。或者，在当前生物合成途径外编码的酶可能催化此预期还原。在酮还原后，酪氨酸衍生物3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基)-3-羟基-丙基-S-Orf17准备纳入到马杜拉放线菌属21G792烯二炔复合物中。将马杜拉放线菌属21G792烯二炔的此组份纳入到最终产物中将在下文中予以论述。此合成途径并不视为限制性的，而是仅为阐释性的。使用此作为模型，所属
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的技术人员能够设计出产生马杜拉放线菌属21G792生色团的3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基)-3-羟基-丙基组份或此组份的衍生物的许多其它合成方案。与控i^^^r^^全^r会成。对马杜拉放线菌属21G792烯二炔生物合成途径进行27分析识别出五种可能参与马杜拉胺(4-氨基-4-去氧-3-C-甲基-(3-吡喃核糖)生物合成的基因(图ll)。马杜拉胺(MDA)生物合成的第一步骤(所有脱氧糖也如此)是由葡萄糖-dNDP合酶激活D-葡萄糖-l-磷酸盐(G-l-P)。特瑞泽(Trefzer)等人，1999,天然产物报告(Ato.Prod16,283-99。与数种葡萄糖-dNDP合酶同源的Orf43使G-l-P激活。基于Orf43与基因数据库(GenBank)数据库中其它蛋白质的序列同源性，Orf43可能催化形成dTDP或dUDP-葡萄糖。然后，与dNDP-糖脱氢酶高度同源的酶Orf37将伯醇氧化成酸，产生dNDP-D-葡萄糖醛酸酯。随后，可能的dNDP-葡萄糖醛酸脱羧酶Orf38将dNDP-D-葡萄糖醛酸酯转化成dNDP-木糖。基于马杜拉胺生物合成可能与包括4,6-脱氧葡萄糖中间体的dNDP-葡萄糖-4,6-脱水酶有关的预测使用自扩增的片段作为探针来识别含有马杜拉放线菌属21G792烯二炔生物合成簇的第一粘粒(参见实例)。然而，将UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶及TDP-葡萄糖-4,6-脱水酶氨基酸序列与Orf38的序列进行比较显示戴克(Decker)等人用以设计用于扩增葡萄糖-4，6-脱水酶基因的PCR引物的保守氨基酸基序也存在于Orf38及葡萄糖醛酸脱羧酶序列中(图12)。(戴克等人，1994，FEMS微生物学快报(FEMSM!'cra.L饥)，141,195-201)。因此，使用这些引物来扩增葡萄糖醛酸脱羧酶并不令人惊奇。另外，应注意0;^7的终止密码子与o/^S的起始密码子重叠，此表明所述w/可能经转译偶合。在dNDP-葡萄糖醛酸脱羧后，由Orf49对dNDP-D-木糖的C-3羟基实施差向异构化，产生dNDP-L-木糖。Orf49与来自嗜热子囊菌(登记号AAZ55273.1)的未经定性的蛋白质最为相似且其第二最密切相关的同系物是ovmX(409b—致性，53%相似性)，ovmX是推定的参与欧维德霉素(oviedomycin)生物合成的来自抗生链霉菌ATCC11891的NDP-糖差向异构酶。(龙目(Lombo)等人，2004，化学与生物化学(C/iemWodiem)5，1181-7)在差向异构化后，0^0基因产物使dNDP-L-木糖的3-碳甲基化。Orf40显示与多种NDP-己糖C-甲基转移酶具有显著相似性且具有多种SAM依赖性甲基转移酶所共有的三种序列基序(基序l-IVEIGCNDG，SEQIDNO:169;基序2-GPADVLYG，SEQIDNO:170;基序3-LLKPDGIFVF,SEQIDNO:171)。(喀甘及克拉克，1994生物化学与生物物理学档案，310，417-27)。因此，预期Orf40将实施此甲基化。尽管预期在马杜拉放线菌属21G792烯二炔的2-羟基-3，6-二甲基-苯甲酸(HDBA)部分的生物合成中将发生另一C-甲基化，但预期催化所述甲基化的C-甲基转移酶(Orf33)似乎与造成HDBA碳骨架产生的聚酮合酶形成小操纵子，因此，预计Orf40不会参与所述转化。经甲基化的dNTP-糖随后经历C-4氨基交换以形成dNTP-马杜拉胺。此反应可能是由与来自赐诺杀(spinosyn)生物合成簇的SpnR高度同源(559b—致性，68%相似性)的Orf36催化，已显示其在D-二磷酸核甘(D-forosamine)形成中实施脱氧糖中间体的C-4氨基交换。(赵(Zhao)等人，2005,美国化学会会志(JACS)，127，7692-3)将马杜拉放线菌属21G792烯二炔的马杜拉胺组份纳入到最终产物中将在下文中予以论述。28此合成途径并不视为限制性的，而是仅为阐释性的。使用此作为模型，所属
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的技术人员能够设计出产生马杜拉放线菌属21G792烯二炔的MDA组份或此组份的衍生物的许多其它合成方案。2-秀募3，6-二伊募苯伊度教#浙豸餘会成。马杜拉放线菌属21G792烯二炔的2-羟基-3，6-二甲基苯甲酸(HDBA)组份最有可能由两种基因产物合成Orf32及Orf33，Orf32是迭代I型聚酮合酶(PKS)，Orf33是SAM依赖性C-甲基转移酶(图13)。直至最近，用于芳香族聚酮生物合成的细菌范例仍要求迭代II型PKS。(沈(Shen)等人，2003，化学生物学新观点(Ozn".C7zem说'oZ.)7,285-95)。对马杜拉放线菌属21G792烯二炔生物合成簇实施检查未揭示存在任何与II型PKS同源的基因。然而，Orf32显示与NcsB(47%—致性，59%相似性)及与数种真菌来源的6-甲基水杨酸合酶具有显著相似性，NcsB是造成产生新制癌菌素的萘甲酸部分的迭代I型PKS。(刘等人,2005，化学及生物学，293-302)Orf32由I型PKS所共有的5种结构域组成，包括酮合酶(KS)、酰基转移酶(AT)、脱水酶(DH)、酮还原酶(KR)及酰基载体蛋白(ACP)。其通过迭代脱羧縮合继而在C-4处选择性酮还原及脱水及在C-2处酮还原自一个乙酰基-辅酶(coA)及三个丙二酰基coA催化形成线性丁烯酮(tetraketide)。随后初生的丁烯酮中间体经历非酶促分子内羟醛縮合以形成环化6-甲基水杨酸(6MSA)中间体。随后，o《B基因产物使6MSA中间体的C-3位置甲基化以形成HDBA。Orf33与包括N-、C-及O-甲基转移酶在内的多种SAM依赖性甲基转移酶相似。与其分类一致，Orf33具有多种SAM依赖性甲基转移酶所共有的三种序列基序(基序1-VLDLGGGDG，SEQIDNO:172;基序2-DGCDAILY,SEQIDNO:173;基序3-ALPEGGVCW，SEQIDNO:174)。(喀甘及克拉克，1994)。尽管存在于生物合成簇中的其它甲基转移酶可能催化此反应，但Orf33是Orf32的直接上游且似乎是致力于产生HDBA的小操纵子的一部分且因此是最有可能实施此反应的酶。自PKS释放环化聚酮不需要硫酯酶，大多数聚酮也是如此。更确切地，其经由烯酮途径释放，此与所报道的6-甲基水杨酸生物合成类似。斯宾塞(Spencer)及约旦(Jordan),(1992)生物化学期刊(5/oc/iem./.)，288，839-846。在自Orf32释放后，HDBA由or/7基因产物激活为芳基腺苷酸。Orf31与多种芳酸AMP-连接酶相似。此等类型酶经充分研究的实例来自于对含铁细胞生物合成的研究。在许多含铁细胞情况下，诸如水杨酸盐或2'，3'-二羟基苯甲酸盐等芳酸在含铁细胞非核糖体肽核心的组装中作为第一步骤经腺苷酰化(综述参见克罗萨(Crosa)及沃尔什(Walsh)，2002,微生物学及分子生物学评论(M!'craWo/iev.)，66，223-49)。除将芳酸激活成腺苷酸外，这些酶也将芳酸转移到所谓芳基载体蛋白(ArCP)的磷酸泛酰巯基乙胺基辅基的巯基上。参与含铁细胞细菌素(bacillibactin)生物合成的2'，3'-二羟基苯甲酸盐-AMP连接酶(DhbE)的晶体结构与其它腺苷酰化酶(包括NRPSGrsA腺苷酰化结构域及萤火虫萤光酶)晶体结构的比较揭示芳酸-激活结构域含有氨基酸激活结构域中不存在的特征序列。(梅(May)等人，2002，PAWS99,12120-5)。在DhbE中，通常存在于氨基酸-激活结构域中的所谓核心A4基序(YxFDxS)经序列基序HNYPLSSPG代替。在氨基酸-激活结构域中，无变化的Asp残基使氨基酸底物的p-氨基稳定，而在芳酸-激活结构域中，Asp残基经保守中性Asn代替，氢与DHBA或水杨酸的2'-羟基键合。(梅等人，2002)。因为HDBA具有2'-羟基，因此我们预期Orf31具有芳酸-激活A4基序。对Orf31序列实施检查揭示基序HNFPLASPG(SEQIDNO:175)与激活芳酸的酶一致(图14)。与NRPS的氨基酸-激活结构域一样(史塔克豪斯等人，1999，化学及生物学，6，493-505;査理斯等人，2000，化学及生物学7，211-24)，芳酸-激活结构域的底物特异性密码可自介于A4与A5核心基序之间的区域选取。(梅等人，2002)。表5显示Orf31底物特异性密码与其它芳酸-激活结构域的底物特异性密码的比较，所述其它芳酸-激活结构域参与以下二级代谢物的生物合成维吉霉素(virginiamycin)(VisB，登i己号BAB83672)、普那霉素(pristinamycin)(SnbA,登记号CAA67140)、分枝菌素(mycobactin)(MbtA，登记号CAB03759)、耶尔辛菌素(yersiniabactin)(YbtE，登记号AAC69591)、绿脓杆菌螯铁蛋白(pyochelin)(PchD，登记号AAD55799)、新制癌菌素(NcsB2，登记号AAM77987)、维瑞菌素(vibriobactin)(VibE，登记号007899)、乌尼菌素(vulnibactin)(Vval301，登记号BAC97327)、细菌素(DhbE，登记号AAC44632)、及粘球菌素(myxochdin)(MxcE,登记号AF299336)。按照GrsA苯丙氨酸-激活腺苷酰化结构域对位置进行编号(史塔克豪斯等人，1999)。提出参与辨别2',3'-二羟基苯甲酸(DHBA)与水杨酸间的激活的残基标记以星号。每一位置上与Orf31中所见残基匹配的残基加以灰色阴影。HPA,3-羟基2-吡啶甲酸。Orf31底物特异性密码与其它芳酸-激活酶及激活3-羟基2-吡啶甲酸的两种酶的密码的比较表明Orf31激活水杨酸或HDBA。(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在激活水杨酸或HDBA后，Orf31催化经激活的芳酸转移到与ArCP附接的磷酸泛酰巯基乙胺基辅基的巯基上，ArCP由ozy76编码。Orfl6是小蛋白(95aa)，其与参与二级代谢的许多PCP及ArCP相似(约30-40%—致)且其具有特征性4'-磷酸泛酰巯基乙胺附接基序，包括无变化的丝氨酸残基(GTFFQLRGQSI;SEQIDNO:176)。如下文所论述，在附接到ArCP后，水杨酸盐衍生物准备纳入到马杜拉放线菌属21G792烯二炔复合物中。此合成途径并不视为限制性的，而是仅为阐释性的。使用此作为模型，所属
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的技术人员能够设计出产生马杜拉放线菌属21G792生色团的2-羟基-3,6-二甲基苯甲酸组份或此组份的衍生物的许多其它合成方案。;^T炎^V/:,^r主^^^成。已在马杜拉放线菌属21G792烯二炔生物合成簇中识别出至少十四种基因，其推导功能支持其在于图15中所描绘的马杜拉放线菌属21G792烯二炔核心生物合成中的作用。OW5编码迭代I型PKS，所述迭代I型PKS显示与烯二炔PKS具有端对端序列同源性，烯二炔PKS参与新制癌菌素(NcsE)、C-1027(SgcE)及卡奇霉素(CalE8)的生物合成。(刘等人，2005;刘等人，2002;阿勒特(Ahlert)等人，2002，科学，297，1173-76)。与先前所识别的烯二炔PKS—样，Orf5由6个结构域构成KS、AT、ACP、KR、DH、及所谓"末端结构域"(TD)(图16)。TD显示与4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同源。因此，己提出TD通过用4'-磷酸泛酰巯基乙胺转译后修饰ACP激活位点丝氨酸来催化烯二炔PKS自体激活。(杂坡勒斯(Zaz叩olous)等人，2003，自然生物技术(WamM历o^/0，21，187-90)。预期Orf5会自一个乙酰基辅酶A及7个丙二酰基辅酶A以迭代方式产生初生线性聚不饱和聚酮中间体。所述线性中间体可能自Orf5释放及/或由Orf6环化，其显示与在所有烯二炔生物合成簇中发现的一组硫酯酶蛋白具有相似性。同上。基于其与假单胞菌属菌株CBS-3的4-羟基苯甲酰基-辅酶A硫酯酶同源，预测此组蛋白质起硫酯酶作用。同上。借助数种基因产物(Orf1-4、7、8、11、12、14)对聚酮中间体实施进一步处理以提供烯二炔核心(图15)。此等基因产物在烯二炔生物合成簇中高度保守。除Orf5及6外，Orfl-4的同系物可见于迄今所研究的所有烯二炔生物合成途径中(同上)，而Orf7、8、11、12及14的同系物为9-元烯二炔C-1027及新制癌菌素生物合成簇所共有。(刘等人，2005;刘等人，2002)。Orf1-4、11及14与已知功能的任何蛋白质都不同源，而Orf7、8及12与多种氧化还原酶类似。有趣地，大多数这些基因的表达可能是共调节的，因为与or/77及0//72—样o^-S似乎经转译偶合(例如o/^2的终止密码子与orf3的起始密码子重叠，且的终止密码子与w/4的起始密码子重叠等)。借助最少数量的可能参与自烯二炔核心的C13-C14环氧化物产生末端酰胺的三种基因产物Orf30、Orf41及Orf24对烯二炔核心(图15)进一步实施修饰。。^0编码可能的环氧化物水解酶，o;/47编码醇脱氢酶且o;:/24编码氨基转移酶。随后用其它生色团组份对经充分修饰的烯二炔核心部分实施装饰以产生活性代谢物。此合成途径并不视为限制性的，而是仅为阐释性的。使用此作为模型，所属
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的技术人员能够设计出产生马杜拉放线菌属21G792生色团的烯二炔核心或此组份的衍生物的许多其它合成方案。与控:fe^遂^^27G792主经虔鄉遂发。马杜拉放线菌属21G792烯二炔的生物合成仿效当前烯二炔生物合成的范例，其要求使用会聚性策略来组装分子复合物的各组份。(刘等人，2005;刘等人，2002;阿勒特等人，2002)。在产生各组份后，将它们系统地附接到烯二炔核心上以最终提供如图17中所描绘的最终分子。烯二炔核心与3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基-苯基)-3-羟基-丙基-部分的附接可能由Orfl7的縮合结构域催化。此反应由Orfl7催化与通常归因于NRPS縮合结构域的一般肽键形成活性一致。用于经由醚键形成将3-(2-氯-3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-羟基-丙基-部分的芳香环附接到烯二炔核心的机制尚不清楚，然而，其可能与C5-C6环氧化物的打开同时发生及/或与编码马杜拉放线菌属21G792烯二炔生物合成簇中所含有的or/的一或多种P450或单加氧酶有关。经由O-配糖键将马杜拉胺部分与烯二炔核心偶合。or/29基因产物催化此转移，已显示o^29与多种参与天然产物生物合成的糖基转移酶具有强序列相似性。Orf29与来自C-1027生物合成途径的SgcA6最为相似(43%—致性，57%相似性)，已提出SgcA6催化C-1027烯二炔核心糖基化。(刘等人，2002)。最后，Orf20(I型NRPS縮合结构域)以与非核糖体肽生物合成中的肽键形成类似的反应将来自Orfl6的磷酸泛酰巯基乙胺臂的HDBA-部分转移到马杜拉胺的氨基上。使用此作为模型，所属
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的技术人员能够设计出产生马杜拉放线菌属21G792生色团(尤其生色团-b及生色团-c)以及生色团衍生物的许多其它合成方案。本发明提供包含马杜拉放线菌属21G792生色团的生物合成组份的新颖生物合成途径，其中一或多种组份已突变、或经来自不同烯二炔生色团生物合成途径的组份取代或补充，由此产生马杜拉放线菌属21G792生色团的变体。利用标准分子遗传学技术，可将上文提供的各c^f或or/组合进行处理以产生马杜拉放线菌属21G792生色团及/或色蛋白的新颖生物活性类似物。在一个优选实施例中，将新颖生色团与马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白共表达。在另一实施例中，将马杜拉放线菌属21G792生色团与马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的变体共表达。在再一实施例中，将新颖生色团与马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的变体共表达。在本发明实施例中，使马杜拉放线菌属21G792中的0^/5失活可产生缺少O-甲基的类似物，所述O-甲基通常可见于分子的p-酪氨酰基部分上。(参见，例如，图10)此改变留下羟基而非O-甲基(参见下文R1)。提供羟基取代的一个原因是可使用其作为用于通过标准合成化学技术对类似物实施进一步化学衍生化的化学把手。同样，32由编码的卤化酶失活防止与PCP结合的(3-酪氨酸氯化，结果Cl不存在于马杜拉放线菌属21G79类似物中(参见下文R2)。下文所示的RS基团通常为CH3且可通过使o/^O产物失活将其改变成H，所述产物使dNDP-L-木糖的3-碳甲基化。马杜拉放线菌属21G792生色团的W基团是CH.(指定R5)，其中W在酰胺氮处与糖部分连接。导致产生缺少HDBA部分的烯二炔类似物的or"2失活(参见，例如，图13、17)或失活导致R5由NH2取代。此外，可对R"部分实施修饰。例如，通过使w/l失活获得(指定R6)。在另一实施例中，如上文使w/2失活，并使用突变体来产生马杜拉放线菌属21G792烯二炔类似物文库，其中HDBA部分经其它芳酸代替。通过向o/^2突变体中加入存于发酵液中的多种天然方酸、N-乙酰基半胱胺连接芳酸、或与诸如巯基乙酸甲33酯等其它硫酯载体连接的芳酸来引入芳酸。(参见，例如，雅克布森(Jacobsen)等人，(1997)科学277，367-9)。可使与向马杜拉放线菌属21G792分子复合物中添加组份有关的每一o"各自及与其它o;/组合经突变以产生用于生物测试的马杜拉放线菌属21G792烯二炔类似物的大文库。因此，本发明提供具有下式的化合物.-其中Ri是OH或OCH3;R2是C1或H;R3是CH3或H;且R4选自NH2、R5、及R6。此外，通过在补充有特定天然方酸、N-乙酰基半胱胺连接芳酸、或与诸如巯基乙酸甲酯等其它硫酯载体连接的芳酸的发酵液中对or/32突变体进行培养可产生烯二炔类似物，其中R4是其中R"是H、CH3、OH、OCH3、Cl、C3H7、或N02;112'是H、CH2、NH2、OH、F、OCH3、F、Cl、N02、OC2H5、或NC2H6;113'是H、CH3、Cl、CH3、NH2、OH、F、COH、OCH3、Cl、OC2H5、或N02;且r4'是OH或OCH3。在其它实施例中，可将来自不同二级代谢途径的一或多种oz/引入到马杜拉放线菌属21G792中。可通过同源重组或通过位点特异性整合将选出的or/引入到宿主染色体中，所述位点特异性整合由(例如)噬菌体!'m/加P功能体(例如pSET152或类似载体)介导。或者，可将选出的oW引入到自复制载体中。表达后，基因产物可继续修饰马杜拉放线菌属21G792生色团。例如，可将来自C-1027生物合成基因簇的绍cA、化o47、绍c42、"cA3、化cA4、化cA5及绍c46引入到一或多种马杜拉胺生物合成o//已经失活的马杜拉放线菌属21G792菌株中以产生包含C-1027脱氧氨基糖或其衍生物而非马杜拉胺的马杜拉放线菌属21G792烯二炔类似物。本发明也提供将来自马杜拉放线菌属21G792的色蛋白生物合成簇的基因引入到其它产生二级代谢物的微生物中以对所述生物体产生的同种二级代谢物实施修饰。例如，通过提供表达所述生色团生物合成途径的宿主可产生不同烯二炔生色团(例如，C-1027生色团)的类似物，且宿主中一或多种组份已经由马杜拉放线菌属21G792的色蛋白生物合成途径替代或补充。除制造马杜拉放线菌属21G792色蛋白的类似物外，我们也可通过使负调节子失活以及通过增加表达水平或正调节子的基因复制数目来提高发酵效价。马杜拉放线菌属21G792生物合成簇含有至少八个o^(0《9、/0、46、50、52、55、62及d)，其基于与基因数据库(GenBank)数据库中所含有序列同源识别为推定的转录调节子。可以系统方式对这些调节子的功能进行测试以确定哪些调节子是正调节子及哪些是负调节子。基于所述发现，我们可对一或多种这些基因进行合理改变以提高马杜拉放线菌属21G792色蛋白的发酵效价。一般来说，产生毒性二级代谢物的生物体具有一或多种赋予产生生物体自身抗性的基因。这些基因的产物通常通过化学修饰、隔绝或转运毒性代谢物赋予抗性。在一些情况下，代谢物的靶标天生对代谢物不灵敏，或靶标经修饰以使其对代谢物不灵敏。马杜拉放线菌属21G792生物合成簇含有至少两个基因产物可能与自身抗性有关的35or/。据推测，编码马杜拉放线菌属21G792复合物的脱辅基蛋白组份的与隔绝活性生色团由此遮蔽产生生物体的DNA以不被生色团裂解有关。^y22基因产物编码与许多跨膜流出蛋白相似的蛋白质，且与来自C-1027生物合成途径的SgcB最为相似，已提出SgcB在C-1027生色团-脱辅基蛋白复合物中作为流出泵(刘等人，(2005)化学及生物学，293-302)。利用or/22及or/2丄我们可潜在地赋予马杜拉放线菌属21G792色蛋白抗性。在一个实施例中，可将这些or/引入到经选择以异源方式表达马杜拉放线菌属21G792生物合成途径的细胞中，由此使所述细胞产生大量马杜拉放线菌属21G792色蛋白，同时对其毒性效应具有免疫性。在另一实施例中，可将这些or/引入到经选择用于马杜拉放线菌属21G792生物转化的供体细胞中。否则在生物转化发生之前所述细胞可能被马杜拉放线菌属21G792的极度毒性杀死。全部马杜拉放线菌属21G792生物合成簇或所选部分可在诸如细菌等异源性宿主中表达。可用细菌的实例包括(例如)链霉菌属、马杜拉放线菌属、野野村菌属(Nonomurea)、小单孢菌属、埃希氏杆菌属(Escherichia)、及假单胞菌属等属的成员。(参见，例如，菲佛等人，2001;马丁内斯等人，2004)生物合成簇也可在诸如酵母等真核宿主中以异源方式表达。在一个实施例中，马杜拉放线菌属21G792生物合成簇较佳在己经修饰以产生大量二级代谢物由此使得与使用马杜拉放线菌属21G792通常所达成的马杜拉放线菌属21G792色蛋白产生量相比量增加的生物体中表达。(参见，例如，罗德里格斯(Rodriguez)等人，2003,工业微生物学及生物技术期刊(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)30，480-8)。在另一实施例中，马杜拉放线菌属21G792生物合成簇较佳在尤其易受遗传操作影响的生物体中表达以加快马杜拉放线菌属21G792色蛋白类似物产生。(参见，例如，宾特利(Bentley)等人，2002，自然(Nature)417，141-7;比尼(Binnie)等人，1997，生物技术动向(TrendsBiotechnol.)15，315_20)。所属
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的技术人员已知多种可用于转移编码全部或部分马杜拉放线菌属21G792色蛋白生物合成途径的重组DNA的方法。可利用多种可用于在多种宿主中转移及表达所述DNA的宿主质粒(例如，链霉菌属的plJlOl(基尔瑟(Kieser)等人'1982，分子及普通遗传学185:223-8)、放线菌属的pJRD215(杨(Yeung)等人，1994，细菌学杂志176:4173-6)。用于转移所述载体的方法包括偶联、电穿孔及原生质体转化。也可使用能够在大肠杆菌中复制并自大肠杆菌接合转移到诸如链霉菌属等革兰氏阳性细菌物种的穿梭载体。(参见，例如，马泽迪尔(Mazodier)等人，1989,细菌学杂志171:3583-5;基尔瑟等人，2000，实用链霉菌属遗传学(PracticalStreptomycesgenetics.)实验室手册。约翰英纳斯基金会(JohnlnnesFoundation),诺维奇(Norwich)，大不列颠联合王国(UnitedKingdom))。我们期望制备包含色蛋白的医药组合物，其中所述色蛋白包含本发明脱辅基蛋白与生色团(优选为由马杜拉放线菌属21G792产生的生色团)的复合物。优选地，多肽经由非共价键附接到生色团上。通常来说，制备医药组合物需要制备基本上不含致热原以及可能对人类或动物产生危害的任何其它杂质的医药组合物。我们也期望使用36适当缓冲剂来使复合物稳定并使其被靶细胞摄取。本发明水性组合物包括有效量色蛋白，其进一步分散于医药上可接受的载剂或水性介质中。所述组合物也称为接种物。视情况而定，短语"医药上或药理学上可接受的"是指在投与给动物或人类时不会产生有害、过敏性或其它不利反应的组合物。本文所用的"医药上可接受的载剂"包括任何及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌及抗真菌剂、等渗及吸收延迟剂及诸如此类。将所述介质和药剂用于医药上具有活性的物质己为所属
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的技术人员所熟知。除任何常用介质或药剂与所述色蛋白不相容的情况以外，本发明涵盖所述介质和药剂在治疗性组合物中的用途。也可将包括抗细菌剂或抗肿瘤剂在内的补充性活性成份纳入到组合物中。在本发明实施例中，本发明生色团是通过(例如)胞饮作用被细胞吸收。在另一实施例中，对生色团实施修饰以使其靶向于特定细胞或细胞类型。在一个所述实施例中，可使用单克隆抗体或其它蛋白质性质的载体作为寻耙单元将色蛋白以聚合物或偶联物形式递送到靶组织。已知多种基于聚合物的递送系统及抗体偶联物递送系统且当前已用于与天然存在C-1027烯二炔有关的化学疗法策略中。在本发明中，色蛋白可经(例如)化学修饰以形成可用作疗法(尤其化学疗法)的偶联聚(苯乙烯-共-马来酸)的色蛋白。(参见，例如，前田(MflWfl)及绀野(Konno)，1997，新制癌菌素抗癌症药物的过去、现在及将来(Neocarzinostatin:thePast,Present,andFutureofanAnticancerDrug),前田(H.Maeda)，江户(K.Edo)，石田(N.Ishida)编辑，施普林格(Springer-Verlag)，纽约(NewYork)，第227-267页)。含有疏水性及亲水性片段二者的聚合微胶粒是最近研制的以提高化学治疗剂的治疗指数的新型药物递送系统(橫山等人，1990，癌症研究(CancerRes.)50:1693-700;卡巴诺夫(Kabanov)等人，1989，欧洲生物化学学会联合会快报(FEBSLett.)258:343-5)。可控制微胶粒的尺寸以使微胶粒颗粒较正常组织更能透过肿瘤组织中的血管，此是提高渗透及潴留(EPF)效应的缘故(前田，2001，酶调节进展(AdvEnzymeRegul.)41:189-207)。此有利于药物在肿瘤组织中分布且因此预期会提高活体内功效。可通过与嵌段共聚物溶液混合将21G792色蛋白以非共价方式纳入到经专门设计的微胶粒中。所得药物的代谢稳定性可显著提高(横山等人，1991，癌症研究(CancerRes.)51:3229-36)，此潜在地有利于在癌症化学疗法中递送21G792色蛋白。可通过使用化学交联剂或其它有关方法使色蛋白(即，脱辅基蛋白或生色团)与蛋白质偶联以递送到细胞或病原体。已使21G792色蛋白中的生色团与叠氮化钠及仲胺反应以得到一系列衍生物。此等衍生物在C-5上含有叠氮或仲氨基以代替天然生色团中的羟基。可利用在一个末端具有氨基且另一末端具有羧基的交联剂来连接单克隆抗体及生色团以形成用于靶向药物递送的生色团-抗体偶联物。拟代替C-5羟基的交联剂的氨基经设计以使所述偶联物可在肿瘤组织中于更酸性条件下水解回生色团。实例性连接绘示于图30中。另外，可使色蛋白与单克隆抗体偶联以形成单克隆抗体(MAb)-色蛋白偶联物。对抗原具有高亲和性、优选对恶性细胞表面上的抗原决定簇具有特异性的抗体是耙向部分的自然选择。预期色蛋白到肿瘤细胞的抗体介导的特异性递送不仅提高其抗肿瘤功效，而且也防止由正常组织非靶向摄取，由此提高其治疗指数。可用于本发明的所述抗体载体的实例包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、其生物活性片段及其基因或酶促工程对应物。优选地，在诸如癌症等增生性病症中，所述抗体对准在靶细胞及/或组织上表达的细胞表面抗原。抗-CD33单克隆抗体是用于此方法的有用Mab的例证且可在多种背景下实现色蛋白到癌组织的靶向，包括在患有急性髓样白血病的患者中。(参见，例如，西弗斯(Sievers)等人，1999,血液(Blood)93，3678-84)可用单克隆抗体偶联物的另一实例阐述于PCT公开案第WO03/029623号中，其中，例如，抗-CD22单克隆蛋白与烯二炔偶联以靶向递送到B-淋巴细胞。如先前所述，数种MAb-C-1027偶联物作为有希望的抗癌药物正在评估中。(布鲁克纳(Brukner),2000,肿瘤学新观点(Curr.OpinionOncologic),内分泌及药物代谢研究(Endocrine&Met.Invest.Drugs)2，344)。除抗体载体外，其它蛋白质性质的载体包括激素、生长因子、抗体模拟物、及其基因或酶促工程对应物，其在下文中很少提及或以"载体"群组提及。载体的本质特性是其识别与不期望细胞有关的抗原或受体并与其结合并随后被内在化的能力。可应用于本发明中的载体的实例揭示于美国专利第5,053,394号及第5,773,001号中，其全文并入本文中。可用于本发明的优选载体是抗体及抗体模拟物。多种非免疫球蛋白蛋白支架己用于产生与具有抗体特异性的抗原表位结合的抗体模拟物(PCT公开案第WO00/34784号)。例如，"微抗体"支架与免疫球蛋白折叠有关，已通过从单克隆抗体的重链可变结构域中删去三股P链对其实施设计(特拉蒙塔诺等人，1994,分子识别期刊(J.Mol.Recognit.)7:9-24)。此蛋白包括61个残基且可用于提供两个高变环。使此两个环随机化并针对抗原结合实施产物选择，但由于溶解性问题迄今此框架的功用似乎有点受限。用于展示环的另一框架是淀粉酶抑肽，此蛋白质特异性抑制哺乳动物(x-淀粉酶且为通过两个二硫键结合在一起的74残基六链(3-折叠三明治结构(麦康奈尔(McConnell)及胡斯(Hoess)，1995，分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)250:460-70)。此支架包括三个环，但迄今这些环中仅两个环已实施随机化潜力检査。其它蛋白质已经测试作为框架且已用于展示a螺旋表面上的随机化残基(诺德等人，1997，天然生物技术(Nat.Biotechnol.)15，772-7;诺德等人，1995，蛋白质工程(ProteinEng.)8，601-8)、介于a螺旋束中的a螺旋之间的环(顾(Ku)及舒尔茨(Schultz)，1995，美国国家科学院院干iJ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，6552-6)、及受二硫键束缚的环，例如小蛋白酶抑制剂上的环(马克兰德(Markland)等人，1996,生物化学(Biochemistry)35，8045-57;马克兰德等人，1996,生物化学35，8058-67;勒特根(Rottgen)及柯林斯(Collins)，1995，基因(Gene)164，243-50;王(Wang)等人，1995，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)270，12250-6)。可通过化学交联或借助诸如应用重组DNA技术等基因融合使靶向分子与色蛋白共价结合。在后一种方法中，可使脱辅基蛋白的C-末端或N-末端与细胞耙向蛋白质分子的N-末端或C-末端融合。当细胞靶向分子是抗体时，脱辅基蛋白的N-末端优选与抗体轻链及/或重链的c-末端融合。对于化学交联，一些常见蛋白质-抗体交联剂是琥珀酸酯及其它二羧酸、戊二醛及其它二醛。其它所述交联剂已为所属
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的技术人员所熟知。治疗性组合物溶液可在适宜与表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇、其混合物及油中制备。在普通储存及使用条件下，此等制剂含有防腐剂以防止微生物生长。本发明治疗性组合物较佳以呈液体溶液或悬浮液形式的可注射组合物形式投与；也可制备适于在注射之前存于液体中形成溶液或悬浮液的固体形式。也可对所述制剂实施乳化。用于所述目的的典型组合物包含医药上可接受的载剂。例如，所述组合物可含有10mg、25mg、50mg或至多约100mg人类血清白蛋白/毫升磷酸盐缓冲盐水。其它医药上可接受的载剂包括水性溶液、无毒性赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂及诸如此类。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇性/水性溶液、盐水溶液、诸如氯化钠等非经肠媒剂、林格氏(Ringer's)右旋糖等。静脉内媒剂包括流体及营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂及惰性气体。按照熟知参数对医药组合物的各种组份的pH值及准确浓度实施调节。其它调配物也适于经口投与。经口调配物包括诸如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及诸如此类等典型赋形剂。所述组合物可釆取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释调配物或粉剂形式。当途径是局部途径时，可呈乳霜、软膏、油膏或喷雾剂形式。本发明治疗性组合物可包括经典医药制剂。本发明治疗性组合物的投与可经由任何常见途径达成，只要可经由此途径达到靶组织即可。此途径包括经口、鼻、口腔、直肠、阴道、或局部投与。局部投与尤其有利于治疗皮肤癌以防止化学疗法引起的脱发或其它真皮过增生性病症。或者，可通过正位、真皮内、皮下、肌内、腹膜腔内或静脉注射进行投与。所述组合物通常以包括生理学上可接受的载剂、缓冲剂或其它赋形剂的医药上可接受的组合物形式投与。对于治疗肺部病状来说，优选途径是以气溶胶递送到肺中。气溶胶的体积介于约0.01ml与0.5ml之间。同样，对于治疗结肠有关疾病来说，优选方法是经由灌肠剂。灌肠剂的体积介于约1ml与100ml之间。基于预定目标来确定治疗性组合物的有效量。术语"单位剂量"或"剂量"是指适用于个体的物理分散单元，每一单元含有经计算可与其投与(即，适当途径及治疗方案)一起产生上文所述期望反应的预定量治疗性组合物。拟投与的量(根据治疗次数及单位剂量来说)视所期望的保护而定。治疗性组合物的准确量也取决于执业医师的判断且为各个体所特有。影响剂量的39因素包括患者的身体及临床状态、投与途径、治疗的预期目标(症状减轻对治愈)及特定治疗性物质的效能、稳定性及毒性。在本申请案全文中，参考了多个公开案，其以名称或数字方式置于圆括号中。这些公开案的全部揭示内容皆以引用方式并入本申请案中以更完整地阐述本发明所涉及技术的发展水平。实例应了解并预料到，所属
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的技术人员可对本发明原理实施改变且所述修改意欲包括于本发明范围内。阐述以下本发明实例以进一步阐释本发明且不应理解为以任何方式限制本发明。实例1色蛋白及脱辅基蛋白的分离及定性实例1-种子培养马杜拉放线菌属21G792以自在ATCC培养基172中培育72小时的细胞制备的冷冻全细胞(冷冻营养菌丝体，FVM)形式保存(右旋糖1%、可溶性淀粉2%、酵母提取物0.5%、及N-Z胺A型0.5呢、CaCO30.1%pH7.3)。添加甘油至20%并将细胞在-150。C下冷冻。制备pH值为6.9的含有以下的种子培养基1.0%右旋糖、2.0%可溶性淀粉、0.5%酵母提取物、0.5%N-Z胺A型(谢菲尔德(Sheffield))、及0.1%CaC03。在25mmx150mm玻璃培养管中，用在ATCC琼脂培养基#172(ATCC培养基手册，第1版，1984)中培养的马杜拉放线菌属21G792细胞来接种7ml种子培养基及两种玻璃珠粒。在培育72小时后使用来自琼脂培养物的足量接种物来提供混杂种子。将初级种子管在28°C、250rpm下使用偏心距离为2英寸的陀螺旋转摇瓶培育72小时。随后使用初级种子(约14%接种物)来接种含有50ml培养基#172的250ml埃伦迈尔烧瓶(Erlenmeyerflask)。将这些二级种子烧瓶在28。C、250卬m下使用陀螺旋转摇瓶(2"偏心距离)培育48小时。实例2实例2-发酵制备pH值为6.9的含有以下的发酵物产生培养基2.0%蔗糖、0.5%糖蜜、0.5%CaC03、0.2%蛋白胨、0.002%硫酸镁-71120、0.001%硫酸亚铁-71120、0.05%溴化钠、及0.2%乙酸钠。使六十个250ml埃伦迈尔烧瓶的每一个具有50ml发酵物产生培养基并用2ml(4.0呢)二级种子发酵物接种并在28。C、250rpm下使用陀螺旋转摇瓶(2"偏心距离)进行培育。随后使所述发酵继续进行约72至96小时并收获以用于进一步处理。将组合全发酵液(60x50ml)在3800rpm下离心30分钟。随后将上清液冻干并将残留粉末悬浮于少量体积(例如，300ml)H20中。离心后，随后在4'C下于黑暗中将褐色溶液装载到含有存于H20中的6L葡聚糖凝胶G75的玻璃柱上。所收集流份均40为40ml并在生物化学诱导分析(BIA)中予以测试。随后合并最具效能的流份(15份，总共600ml)并冻干。随后将浅灰色粉末溶解于H20(4ml)中并通过HPLC分析含有两种主要峰，一种峰对应于脱辅基蛋白且另一种峰对应于色蛋白。使上文溶液在具有流速为4ml/min的缓冲系统(0-0.5M线性梯度NaCl加0.05MTris-HCl，30min)的东曹哈斯(TosoHaas)DEAE5PW柱(13nm粒径，尺寸为21.5mmxl5cm)上经受制备型HPLC色谱法。采集脱辅基蛋白与色蛋白的各自峰，用皮尔斯透析卡(PierceDialysisCassette)(7000MWCO)脱盐，并冻干。随后借助相同制备型HPLC条件再次纯化所得脱辅基蛋白及色蛋白粉末、脱盐并冻干。通过分析型HPLC来分析色蛋白(浅灰色粉末，10.5mg)及脱辅基蛋白(白色粉末，19.8mg)的最终产物(分别为图1及3)。色蛋白及脱辅基蛋白的紫外吸收(UV)光谱显示于图2及4中。经MALDI-MS测定脱辅基蛋白的分子量为12.92409kDa。MALDI谱显示于图5中。实例3实例3-接种物使用以下组份来制备1公升用于试验规模发酵的无菌接种物培养基5.0g/L植物蛋白胨(BBL)、5.0g/L酵母提取物(细菌用(Bacto))、40g/L可溶性淀粉、20g/L葡萄糖、1.28g/L七水硫酸镁、0.025MMOPS。在将约1mL种子培养物转移到无菌烧瓶中之后，将其置于摇瓶上并在30。C及200rpm下培育。在培育48至72小时后将烧瓶的全部所含物以无菌方式转移到发酵罐中。实例4实例4-试验规模发酵使用马杜拉放线菌属菌株21G792作为产生微生物在100L试验型发酵罐中实施色蛋白发酵。用至多65L纯净水制备以下培养基葡萄糖单水合物，2.75g/L;七水硫酸亚铁，0.01g/L;七水硫酸镁，0.02g/L;碳酸钙(密西西比TMLime)，2.0g/L;马可马顿J-1，4.0g/L;三水乙酸钠，2g/L;碘化钾，0.5g/L;普朗尼克L-61，0.5g/L。用硫酸将培养基溶液的pH值调节至7.0。随后对培养基实施灭菌并冷却至发酵温度，然后将额外量的葡萄糖单水合物(约6g/L)及l公升接种物转移到发酵罐中。将发酵温度控制在合适值(30。C)上以支持细胞生长及产生并在合适搅动、压力、及通风下实施以使溶解氧保持在饱和值的20%以上。在此实例中，控制在250rpm、5psig、及301pm下发酵。在第4天收获批料。收获时色蛋白的浓度为152mg/L。通过在容纳1L离心瓶的离心机中离心使所收获的醪液澄清。所用离心条件是7000rpm、2(TC、及每循环20分钟。收集上清液以用于进一步产物回收。实例5实例5-试验规模发酵在以下培养基中实施使用马杜拉放线菌属菌株21G792的色蛋白发酵葡萄糖单41水合物，8.75g/L;七水硫酸亚铁，0.01g/L;七水硫酸镁，0.02g/L;碳酸l^(密西西比TMLime)，2.0g/L;马可马顿J-1，4.0g/L;三水乙酸钠'2g/L;溴化钠，0.5g/L;普朗尼克L-61，0.5g/L。在第70小时收获批料且产生约60mg/L色蛋白。实例6实例6-色蛋白分析此分析方法使色蛋白与发酵液的UV吸收组份分开并解析成色蛋白及脱辅基蛋白形式。仪器是装备有2996PDA检测器、千年(Millennium)色谱控制及分析软件的沃特斯联盟2695(WatersAlliance2695)。柱是由东曹(TOSOH)生物科学或色谱科(SUPELCO)提供的TSK苯基5PW(10pm直径颗粒，7.5x75mm)。流动相为A:1.5M硫酸铵、20mMTrispH7.8-8.3，B:20mMTris100mMNaClpH7.8-8.3。运行时间为30min，流速为lmL/min。在230nm处检测，收集200-400nm范围的谱，带宽为4.8nm。梯度洗脱规划如下0-3min保持100%A、3-23min线性变化到100%B、23-24线性变化到100%A、24-30保持100%A。注射体积为100(aL或更小。除0.45pm过滤外，过程中的样品不实施进一步净化而应用。通过与参考标准物保留时间及谱进行比较识别色蛋白及脱辅基蛋白峰。色蛋白的典型保留时间为18min且脱辅基蛋白的典型保留时间为20min。如下实施完整色蛋白峰的定量mg/mL色蛋白=稀释系数(Dilfactor)*(组份面积j^V*secx7.55xl0—6ng/pV*sec)/注射体积(pl)实例7实例7-色蛋白分析此分析方法基于分子尺寸使色蛋白与发酵液的其它UV吸收组份及其它杂质蛋白质分开。色蛋白与脱辅基蛋白形成共洗脱物。仪器是具有2996PDA检测器及千年(Millennium)色谱控制及分析软件的沃特斯联盟2695(WatersAlliance2695)。柱是由巴拉德(BioRad)提供的生物硅SEC125(BioSilSEC125)，7.8x300mm。流动相是A:20mMTris100mMNaClpH7.8-8.3。在230nm处检测，在200-400nm范围收集谱，带宽为4.8nm。运行时间为20min，流速为1mL/min。洗脱为等度洗脱。注射体积为100pL或更小。除0.45pm过滤外，过程中的样品不实施进一步净化而应用。通过与参考标准物保留时间及谱进行比较识别色蛋白峰。色蛋白的典型保留时间是7.8min。如下实施完整色蛋白峰的定量mg/mL色蛋白=稀释系数*(组份面积^V*secx7.55x10-6ng/^V*sec)/注射体积(nl)实例8实例8-生物化学诱导分析生物化学诱导分析识别在大肠杆菌BR513-80中诱导SOS反应的DNA损伤剂。BR513-80含有XPL启动子与tocZ基因的转译融合物。在暴露于DNA损伤剂后作为SOS反应的一部分被激活的人PL启动子促使卩-半乳糖苷酶合成。通过使与固蓝RR盐反应产生红/紫色的6-溴-2-萘基-(3-D-吡喃半乳糖苷(BNG)裂解来检测(3-半乳糖苷酶活性。使用LBE(细菌用胰蛋白胨(BactoTryptone)10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、1MTris碱5mL/L)或含有15g/L琼脂、0.2%葡萄糖及经1/125稀释的"E"溶液的等效物来制备固体培养基的基底层。("E"溶液含有5g七水硫酸镁、50g拧檬酸单水合物、250g磷酸氢二钾、及87.5g磷酸铵钠，按照顺序将其稀释到1L去离子H20中)每块丹麦能肯(Nunc)生物分析板使用约170ml基底层培养基或每150mm陪替氏培养皿(petridish)使用约50mL基底层培养基。将BR513-80过夜培养物以1:20稀释于LBE发酵液或等效物中，并在600nm处测量经稀释培养物的吸光度。计算未经稀释培养物的吸光度，并用此值除5.7以获得培养物体积(以mL计)以用作接种物/40mL软琼脂。一般来说，此体积为约0.9-1.3mL。将所计算的培养物体积在软琼脂中打旋，均匀倾倒在基底层上(每块丹麦能肯生物分析板40ml或每150mm陪替氏培养皿20mL)，并使其固化至少10-15分钟。将所分析的样品及标准物以10pL分液直接施加到软琼脂上覆层的表面上。可用标准物包括10、5、2.5、及0.31pg/mL的博来霉素、及1000、100、10、1及O.lng/mL的卡奇霉素Y'i。将分析板在约37'C下培育约3h以诱导SOS反应。通过将87mg固蓝RR盐及13mgBNG溶解于2mLDMSO中并与40mL熔化的1%软琼脂混合制备染料/底物上覆层。在培育阶段后，将40mL染料/底物混合物(20mL用于150mm表面皿)均匀倾倒在BIA板的表面上，并使其固化。在于室温下15-20分钟后或在约37'C下10min后评分诱导反应。以下例示评分等级20-25mm红/紫诱导区，有或无透明中心区域；3+圆形15-20mm红/紫诱导区，有或无透明中心区域；2+圆形10-15mm红/紫诱导区，有或无透明中心区域；7+淡红色区，有或无透明中心区域；+/-小泛红区，有或无透明中心区域；r毒性区(透明区域，其中细菌已杀死或无颜色改变)；AW无红/紫诱导区；无透明毒性区。实例9实例9-色蛋白纯化此实例提供用于分离约90%纯净8"活性色蛋白的规模可变纯化方法。通过505-凝胶电泳迁移率、UV光谱及HPLC保留时间使用尺寸排除及疏水作用分析柱二者对通过此方法分离的化合物进行分析。未针对色蛋白产生对发酵条件进行优化。使用由DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换色谱法、苯基琼脂糖凝胶HP疏水作用色谱法及超级葡聚糖75尺寸排除色谱法组成的规模可变3-步骤程序来纯化来自350ml澄清发酵液的色蛋白。步骤产率分别为约61%、69%及82%，导致约90%纯净的色蛋白的总过程回收率为30%，其余材料为无活性脱辅基蛋白。DEAE琼脂糖凝胶FF阴离子交换色谱法-通过将7mL1MTrispH8.3添加到350mL澄清发酵液中制备色谱装载。随后将装载施加到用流速为10mL/min的5柱体积43(CV)20mMTrispH8.3平衡的5mL哈特拉(HiTrap)DEAE琼脂糖凝胶FF柱中。在230、280及310nm处检测吸光度。收集单一流份的柱流出物。用20mMTrispH8.3洗漆柱直至吸光度达到基线。通过使在10CV流份中流动相变到0.25MNaCl,20mMTrispH8.3来洗脱色蛋白物质(以2CV的5种流份收集；参见表6，流份D1-D5)。使用1MNaCl，20mMTrispH8.3洗涤柱实施第二洗脱步骤。图18显示洗脱特性曲线。苯基琼脂糖凝胶HP色谱法-通过将10.6g硫酸铵添加到47.5mL来自第一步骤的保存的洗脱物中以使硫酸铵浓度为1.5M来制备色谱装载。经计算装载体积(在添加硫酸铵后)为53.7ml。在添加硫酸铵后使用1mL1MTrispH8.3将装载的pH值自7.8升到8.06。借助0.45jam尼龙注射器式过滤器(直径为2.3cm)容易地对澄清褐色溶液实施过滤并以5mL/min将52.7mL施加到5mL哈特拉(HiTrap)苯基琼脂糖凝胶HP柱上。所述柱先前已用5CV1.5M硫酸铵，20mMTrispH8.2平衡。在230、280及310nm处检测吸光度。在20CV线性梯度洗脱到100mMNaCl，20mMTrispH8.2时发生色蛋白与脱辅基蛋白的分离。在整个梯度期间收集单一CV流份并将通过UV吸光度选择为色蛋白峰的两种流份汇集(在表6中表示为P9-P10)。色蛋白在脱辅基蛋白之前洗脱出来且两个峰间隔2CV。图19显示洗脱特性曲线。超级葡聚糖75色谱法-将硫酸铵添加到9.5ml苯基琼脂糖凝胶池中以达到80%浓度(560g固体/L苯基琼脂糖凝胶池)。将添加硫酸铵后所形成的沉淀俘获于直径为1英寸的0.45nm尼龙注射器式过滤器上并通过用1mL20mMTris，100mMNaClpH8.2反复萃取固体来回收。将0.8mL萃取物部分施加到已用2CV40mMTris200mMNaCl平衡的超级葡聚糖75柱上并用1mL所收集流份在1.5CV中洗脱。在0.5mL/min流速下在230、280及310nm处检测吸光度。色蛋白池(3ml)选择为表示为表6中S6-S8的三种流份。图20显示洗脱特性曲线。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表7色蛋白的过程中回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>对过程中取样的回收率实施校正。使用超级葡聚糖流份S6、S7及S8的池计算总产率。每一纯化步骤中及总过程的所回收色蛋白的量显示于表7中。通过两种HPLC技术(苯基5PW及生物硅SEC125(BioSilSEC125))在流份S6上分析最终纯度(图20)。含有10%脱辅基蛋白的色蛋白制剂的结果显示于图21及22中。也通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE证实每一阶段的纯度。(图23及24)。对于最终池观察到单条带(图24，泳道3)。实例10实例10-生色团物质的分离及结构说明。制备含有卤化物的马杜拉放线菌属21G792的发酵培养物。通过依序应用DEAE琼脂糖凝胶FF、苯基琼脂糖凝胶FF、及超级葡聚糖75色谱柱并自其收集活性流份来自澄清发酵液获得色蛋白。在苯基琼脂糖凝胶步骤期间使用由1.5M硫酸铵及经安排的终止于O.lMNaCl的20CV梯度构成的结合缓冲剂来将色蛋白分成活性流份峰A及B及无活性脱辅基蛋白峰(图25)。在色谱法中识别出三种峰(图25)并汇集对应于每种峰的流份。通过反相色谱法使用杰普特(Jupiter)C4300A4.6x250mm柱(菲罗门(Phenomenex))来分析存在于每一种流份中的烯二炔生色团。此方法依赖于使用乙腈有机改性剂自色蛋白溶液的脱辅基蛋白载体组份在线萃取烯二炔(图26)。峰A产生两种生色团物质(生色团-c及生色团-d)，而峰B产生单一生色团物质(生色团-b)。分离出所有三种生色团物质并收集其HRMS及NMR数据。所提出的结构进一步通过高分辨率MS/MS碎片数据加以证实。(图6)。生色团-c及-d是由双自由基环芳构化随后质子化及脱水(失去水)而产生的生色团-b的潜在降解产物。为证实生色团-c及-d不是分离期间产生的人造物，也对粗活性流份混合物实施LC-NMR。来自LC-NMR的NMR数据与所提出的结构符合。实例11马杜拉放线菌属21G792基因簇实例11-马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的DNA分离及测序。基于对阐述于霍普伍德(Hopwood)等人，(1985)，链霉菌属的遗传操作(Ge""/cmam'戸to!'o似o/^wptomycw.).实验室手册.诺维奇约翰英纳斯基金会中的程序进行改进自马杜拉放线菌属21G792中分离出基因组DNA。将约1ml冷冻菌丝体甘油原液接种到含有10mlMYM培养基(4g/l麦芽糖、4g/l酵母提取物、10g/l麦芽提取物、pH7.0)及2-6mm玻璃珠粒的25mmx150mm种子管中。使培养物在28。C及200卬m下生长5天。随后通过在3000xg下离心10min将细胞制成团粒。弃除上清液并将团粒悬浮于300pl含有5mg/ml溶菌酶及0.1mg/ml核糖核酸酶的T5(rE2C)(Tris50mM-EDTA-20mM)中并在37。C下同时每隔15min轻轻加以混合培育1hr。随后添加50|al10%SDS并使样品充分混合。然后，添加85pl5mMNaCI并再次充分混合样品。随后用400nl苯酚/氯仿/异戊醇(50/49/l)萃取样品。在使样品充分形成漩涡后，在室温下于10,000xg下离心20min。在离心后，移除水性相并将其置于新微量离心管中。向样品中添加等体积室温异丙醇并通过颠倒充分混合。使样品在室温下静置5min。随后在4。C下于12,000xg下离心30min。小心地倾倒出管中的异丙醇并用1ml冷70%乙醇冲洗DNA团粒。在于冰中静置5min后，倾倒出管中的70%乙醇并将DNA空气干燥IO分钟。将DNA溶解于0.3ml无菌水中。通过琼脂糖凝胶凝胶电泳来评价DNA的完整性及浓度。X"^^/f朦，质粒及小规模粘粒DNA制备使用质粒少量制备试剂盒(QiaprepSpinMiniPrepKit)(凯杰(Qiagen)公司，瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州(CA)，美国)按照制造商说明书来实施质粒DNA及小规模粘粒DNA的制备。粘粒使用凯杰大构建试剂盒(QiagenLargeConstructKit)(凯杰公司，瓦伦西亚，加利福尼亚州，美国)按照制造商说明书来分离粘粒DNA。使用pWEB粘粒克隆试剂盒(震中技术公司(EpicentreTechnologies),麦迪逊46(Madison),威斯康星州(WI)，美国)按照制造商说明书来构建马杜拉放线菌属21G792基因组文库。大致文库构建方案如下。通过使基因组DNA通过汉密尔顿(Hamilton)HPLC/GC注射器将10昭基因组DNA随意剪切成30-45kb片段。剪切后，使用试剂盒中所含有的末端修复酶混合物对片段DNA实施末端修复以产生钝端片段。随后将经剪切及末端修复的DNA分离在1%低熔点琼脂糖凝胶凝胶上，使用线性T7DNA(约40Kb)作为分子量标记。自凝胶上切割下与T7DNA尺寸近似相等的基因组DNA并自琼脂糖凝胶洗脱DNA。随后将经纯化的DNA连接到pWEB载体上。连接后，使用pWEB粘粒克隆试剂盒提供的梅克普拉斯X包装提取物(MaxPlaxLambdaPackagingExtracts)将所连接的插入DNA包装到X噬菌体颗粒中。随后对噬菌体提取物实施滴定以测定菌落形成单位/毫升。在测定噬菌体提取物的效价后，使用适当量提取物来感染大肠杆菌EPI100宿主细胞并将受感染的细胞铺板于含有50|ig/ml卡那霉素(kanamycin)的笛福柯露瑞(DifcoLuria)琼脂板上以使细胞密度为约200个菌落/板。JT库,选嚴够及方法，抓Z)P-薪薪夢-《6-厲/大艨嚴^游产主。通常来说，产生特定抗生素所需要的基因簇集在产生生物体基因组中。此外，脱辅基蛋白基因具有与编码参与对应生色团的生物合成途径的蛋白质的基因簇集的优先权(刘等人，2002，科学297:1170-3)。马杜拉放线菌属21G792产生的生色团含有与烯二炔核心附接的氨基糖4-氨基-4-去氧-3-C-甲基-3-吡喃核糖。因为预计dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶(DH)催化此糖生物合成中的步骤，所以使用DH探针来分离生物合成簇。为产生DH探针，使用聚合酶链反应(PCR)来自马杜拉放线菌属21G792的基因组DNA扩增DH基因片段。用于预计约500bpDH基因片段的引物(脱水l:5'-CSGGSGSSGCSGGSTTCATSGG(SEQIDNO:152)及脱水2:5'-GGGWRCTGGYRSGGSCCGTAGTTG(SEQIDNO:153))与阐述于戴克等人，1996，FEMS微生物学快报141，195-201中的那些引物相同。使用起跳(JumpStart)REDTaq预混合PCR反应混合物(西格玛-阿德里奇(Sigma-Aldrich)公司，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))按照制造商说明书来实施PCR。所用引物的最终浓度为0.5。在巴美特梯度温控循环器(BiometraTgradientthermocycler)上实施PCR。起始变性温度为96。C，持续4min。随后实施如下30个循环变性温度96°C(45sec)、退火温度66°C(45sec)、延展温度72。C(3min)。最后，最终延展温度为72°C，持续10min。使用TOPOTA克隆试剂盒(英杰(Iiwitrogen)公司，卡尔斯班(Carlsbad)，加利福尼亚州)遵照制造商建议将约500bp扩增子克隆到pCR2.1中。使用一部分(2.5pl)克隆反应物来转化大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司，卡尔斯班，加利福尼亚州)，随后将其铺板于含有50ng/ml卡那霉素、40ng/mlX-gal及0.2mMIPTG的笛福柯露瑞(DifcoLuria)琼脂板上以便实施重组纯系的蓝/白筛选。挑选二十个白色菌落并分离其质粒DNA。对这些纯系进行测序揭示已克隆两种不同DH基因片段。推导氨基酸序列的比较揭示一种DH片段(质粒p34598中所含有的)和与卡奇霉素生物合成有关的DH最为相似。因为卡奇霉素结构含有2种氨基糖，所以预测p34598中所含有的DH片段也可能与氨基糖产生有关，且因此将其选作用于色蛋白基因簇的探针。^";T^"^V使用p34598DH片段通过菌落杂交对马杜拉放线菌属21G792基因组文库进行筛选。如萨姆布鲁克及拉塞尔(Russell)(2001)，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual),冷泉港实验室出版社(第3版)所述将重组菌落DNA转移到尼坦超电荷(NytranSuPerCharge)尼龙膜圆盘(施莱西尔及舒尔氏生物科学(Schleicher&SchuellBioScience)公司，基恩(Keene)，新罕布什尔州(NH))上。使用PCR及引物脱水1及脱水2来制备DH探针以扩增p34598插入片段。通过琼脂糖凝胶电泳来分离所扩增的PCR产物并自琼脂糖凝胶分离530bp片段。随后用[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol阿莫仙生物科学(AmershamBioscience),皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(NJ))使用麦加引物DNA标记试剂盒(MegaprimeDNALabelingkit)按照制造商说明书(阿莫仙生物科学，皮斯卡塔韦，新泽西州)对此片段进行标记。将其上固定DNA样品的尼龙膜在6XSSC中洗涤，随后置于含有预加热(65t:)预杂交溶液(6XSSC/5X丹哈德(Denhardt's)试剂/0.5呢(w/v)SDS及100昭/ml经变性剪切的鲱鱼精DNA)的杂交瓶中并"预杂交"2h。随后添加经变性探针，并在65'C下继续杂交过夜。第二天，用预加热的(65'C)2XSSC/0.1呢SDS(洗涤溶液1)洗涤一次，持续lh并用预加热的(65。C)lXSSC/0.1呢SDS(洗涤溶液2)洗涤一次，持续1h。随后将尼龙膜包裹于保鲜膜(Saranwrap)中并暴露于柯达髙速X射线胶片洗片器AR膜(KodakX-omatARfilm)中4h。使用柯达高速X射线胶片洗片器2000A处理器来使所暴露的膜显像。二十二个菌落似乎与探针杂交。挑选出这些菌落并使其在含有50吗/ml卡那霉素的笛福柯露瑞(DifcoLuria)发酵液中生长。自培养物中纯化粘粒DNA并用A^I切割。通过琼脂糖凝胶电泳分离限制酶切消化物并将DNA转移到如萨姆布鲁克及拉塞尔(2001)所述的尼坦超电荷(NytranSuPerCharge)尼龙膜上。使用与用于菌落杂交的条件相同的条件再次使用p34598插入片段作为探针来用探针探测此膜。九种粘粒与探针阳性杂交。与探针杂交的粘粒及片段的大致尺寸为21gB:15-20kb，21gC:15-20kb，21gD:8-12kb,21gF:15-20kb，21gG:3-4kb，21gl:1.2-2.5kb，21gK:15-20kb，21gL:2.5-3kb，21gV:2-2.5kb。^f弄;^^"贫^^;^^^z夯^V利用艾德曼(Edman)蛋白质测序来测定脱辅基蛋白的最初38个氨基酸残基N-末端DTVTVNYDDVGYPSDIAVTIDAPATAGVGDTATFEVSV(SEQIDNO:154)。为最后确定哪些粘粒含有脱辅基蛋白基因序列，使用基于脱辅基蛋白N-末端的38个氨基酸(aa)序列的4-12残基的简并寡核苷酸作为探针来实施杂交实验。具体来说，寡核苷酸序列为5'-ACSGTSAACTACGACGACGTSGGNTAC(SEQIDNO:155)。将与DH探针杂交的粘粒用I消化并转移到尼坦超电荷(NytranSuPerCharge)尼龙膜上。使用激酶最大5'末端标记试剂盒(KinaseMax5'End-LabelingKit)按照制造商建议(安彼翁(Ambion)公司，奥斯汀(Austin)，德克萨斯州(TX))用[，"P]dATP(6000Ci/mmol;阿莫仙生物科学，皮斯卡塔韦，新泽西州)对寡核苷酸实施末端标记。使用48努科威旋转柱(NucAwaySpinColumn)试剂盒按照制造商指示(安彼翁公司，奥斯汀，德克萨斯州)移除未纳入的放射性核苷酸。将携带DNA的尼龙膜在5(TC下于含有6XSSC、5X丹哈德试剂、0.05%焦磷酸钠、0.5%SDS及100pg/ml经剪切及变性的鲑鱼精DNA的溶液中"预杂交"3h。在此步骤后，用7ml含有6XSSC、0.5%磷酸钠、IX丹哈德试剂及100|ig/ml酵母tRNA的预加热(5(TC)杂交溶液代替预杂交溶液。将经标记的探针添加到此溶液中并将杂交物在5(TC下培育22h。然后，弃除杂交溶液并用20ml室温TMACL洗涤缓冲剂(3MTMACL，50mMTris，0.2%SDS)短暂冲洗所述膜。随后用额外50ml预加热(67。C)TMACL洗涤缓冲剂在67'C下将其洗涤55min。对于最后洗涤，用50ml预加热(5(TC)洗涤溶液1在5(TC下将所述膜洗涤10min。随后将所述膜包裹于保鲜膜中并暴露于柯达高速X射线胶片洗片器AR膜中24h。粘粒21gD、21gG及21gK与探针杂交。在含有21gD及21gKDNA的泳道中观察到约4.5kb信号，而在含有21gGDNA的泳道中则观察到约5.2kb信号。为证实此杂交结果，使用21gD粘粒DNA作为模板及所设计的简并PCR引物来实施PCR以自脱辅基蛋白扩增98bp片段。使用自脱辅基蛋白的36aa序列推导的逆转译DNA序列来设计PCR引物CP-FWD3(5'陽ACSGTSAAYTAYGAYGAYGT;SEQIDNO:156)及CP-REV4(5'-ACYTCRAASGTSGCSGTRTC;SEQIDNO:157)。使用起跳(JumpStart)REDTaq预混合PCR反应混合物(西格玛-阿德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)按照制造商说明书来实施PCR。所用引物的最终浓度为2.0(iM。在巴美特梯度温控循环器上实施PCR。起始变性温度为96。C，持续4min。随后实施如下5个循环变性温度96°C(45sec)、退火温度4(TC(45sec)、延展温度72°C(2min)。接下来的30个循环如下变性温度96。C(30sec)、退火温度55.7-72.0。C(45sec;在此范围内测试8个温度)、延展温度72。C(2min)。最后，最终延展温度为72。C，持续10min。由所述条件可产生数条带；然而，使用退火温度55.7。C、58.6。C及61.4。C可产生约100bp的强烈带。使用TOPOTA克隆试剂盒(英杰公司，卡尔斯班，加利福尼亚州)遵照制造商建议将约100bp扩增子克隆到pCR2.1中。使用一部分(2.5pl)克隆反应物来转化大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司，卡尔斯班，加利福尼亚州)，随后将其铺板于含有50|ng/ml卡那霉素、40ng/mlX-gal及0.2mMIPTG的笛福柯露瑞(DifcoLuria)琼脂板上以便实施重组纯系的蓝/白筛选。挑选十个白色菌落并分离其质粒DNA。对这些纯系进行测序揭示4种纯系(p35546、p35547、p35550、p35554)所含有的DNA的推导氨基酸序列与36朋脱辅基蛋白片段的氨基酸序列准确匹配，由此证实粘粒21gD中含有编码脱辅基蛋白的基因。搭教2"Z)0完,應薪著歪AZW/4^^效说欽。为测定编码脱辅基蛋白的基因的全序列，自上文所扩增98bpPCR产物的DNA序列设计测序引物。使用粘粒21gD作为模板使用以下引物来实施起始轮测序ApoSeqCodel:5'-GGCTACCCGTCGGACATCG(SEQIDNO:158);ApoSeqCode2:5'-GGACATCGCCGTGACCATCG(SEQIDNO:159);ApoSeqCompl:5'-CCGGCGCGTCGATGGTCAC(SEQIDNO:160);ApoS叫Comp2:5'-CTCGAAGGTGGCGGTGTC(SEQIDNO:161)。第一轮测序产生约1440bp序列。使用密码优先性程序，识别出小的498bp开放读码框(ORF)。将此0《的推导氨基酸序列与马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白的部分氨基酸序列(由艾德曼蛋白质测序测定)进行比较证实ORF确实编码脱辅基蛋白，因为两条氨基酸序列相同。另外，推导氨基酸序列的分子量12926Da与通过高分辨率MALDIMS所测定的脱辅基蛋白的分子量12924.09良好吻合。而且，脱辅基蛋白的DNA序列通过使用编码脱辅基蛋白的orf侧翼的引物对两条DNA链实施扩展测序而进一步证实(指定aseA)。含有前导肽及脱辅基蛋白的脱辅基蛋白前体的推导氨基酸序列提供于SEQIDNO:64中。编码脱辅基蛋白前体的核苷酸序列提供于SEQIDNO:63中。脱辅基蛋白的推导氨基酸序列提供于SEQIDNO:150中。编码脱辅基蛋白的核苷酸序列提供于SEQIDNO:149中。最后，图7中所提供的图阐述脱辅基蛋白前体的DNA序列、对应氨基酸序列、推定的上游核糖体结合位点、及前导肽及脱辅基蛋白之间的分裂位点。实例12实例12-马杜拉放线菌属21G792色蛋白生物合成簇的剩余部分的DNA分离及测序与控投威錄朦虜27G792潔薪基歪A基房嚴游远^^^游磁定。如下所述确定与存在于粘粒21gD中的马杜拉放线菌属21G792脱辅基蛋白基因簇部分邻近的序列。我们认为这些序列与粘粒21gD—起基本上组成马杜拉放线菌属21G792色蛋白的全部生物合成簇-即所述基因负责色蛋白组装。开放读码框的位置标示于表1中。所编码蛋白质的功能通过与基因数据库(GenBank)保存序列进行比较来推导(表3)。开放读码框的排列描述于图8中。首先，通过使用引物21gDprlFWD(5'-GCTCGTCGGGTTCTTCTAC;SEQIDNO:162)及21gDprlREV(5'-GACTTCGCGATAGCTCTC;SEQIDNO:163)自含有部分II型肽合成酶縮合结构域(oW仏图7)的粘粒的末端扩增904bp片段自粘粒21gD产生探针。使用KOD聚合酶(诺瓦杰(Novagen))与5%DMSO按照制造商建议实施PCR扩增。所用引物的浓度为0.5mM。使用粘粒21gD作为模板DNA。循环条件如下96°C2min1个循环，随后96°C1min、61.2°C1min、及72°C2min30个循环，随后72。C10minl个循环。通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR反应并如先前所述自琼脂糖凝胶洗脱出904bp带。如先前对于4，6-脱水酶探针所述使用904bp扩增子来用探针探测马杜拉放线菌属21G792基因组粘粒文库。对与探针杂交的38个菌落进行培养(5ml含有50昭/ml卡那霉素的笛福柯露瑞(DifcoLuria)发酵液)并纯化粘粒DNA。使用pWEB载体中所含有的测序引物位点对所纯化的粘粒进行末端测序。DNA序列分析表明一种粘粒(41417)与粘粒21gD重叠1184bp。随后对整个粘粒41417进行测序，确定开放读码框，并推导所编码蛋白质的功能。通过对先前确定为与在p34598中所克隆的推定的dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶片段(用于识别粘粒21gD)杂交的粘粒进行筛选确定粘粒21gD另一末端远侧的生物合成簇部分。使用经设计以自粘粒21gD的5'末端扩增1043bp产物(产物对应于完整生物合成簇的核苷酸70,572至71,614)的PCR引物对所述粘粒进行筛选。使用引物21gDendFWD(5'-GCGACGAAGGACCCGAAGG;SEQIDNO:164)及21gDendREV(5'-CACGCTGGCCCGCCCCTTC;SEQIDNO:165)使用10-100ng每种粘粒作为模板在标准25^PCR反应物(KOD热启动(KODHotStart)聚合酶；诺瓦杰，圣迭戈(SanDiego)，加利福尼亚州，美国)与0.5pM每种引物中筛选每种粘粒。支持预期1043bpDNA片段扩增的唯一粘粒是21gB及21gC。对这些粘粒进行末端测序揭示粘粒21gB与粘粒21gD重叠17,411个核苷酸，而粘粒21gC与粘粒21gD重叠22,7%个核苷酸。由于粘粒21gB与己知簇序列重叠较少，且由此表示其具有较大潜力产生相比粘粒21gC来说较长的序列扩展，因此选择其来测序。测序揭示粘粒21gB含有33,133bp插入片段，表示18,442bp序列扩展，此使所测序碱基对的总数量达到90,573(图8)。如先前，对粘粒进行测序，确定开放读码框，并推导所编码蛋白质的功能。实例1321G792色蛋白的生物特性实例13-活体外抗肿瘤活性。p53/p21检查点检查基因组的完整性并在DNA损伤事件中阻断细胞周期进程。由p21基因缺失引起的检查点破坏不能达成响应DNA损伤的阻滞，最终导致经由凋亡而使细胞死亡。由于丢失此检查点是癌细胞的标志，所以可以使用其中一对细胞系(p21十/十)具有完整p21基因且一个成员(p21-/-)缺失p21基因的等基因对细胞系通过识别优先诱导p21-缺陷型细胞凋亡的分子来筛选潜在的抗肿瘤化合物。将马杜拉放线菌属21G792色蛋白添加到等基因对细胞系(p21+Z+及p21-A)中。如表8中所示，色蛋白对于p21-A细胞具有高选择性，因为其IC5o值为p21+/+细胞IC5o值的13倍多。而且，如表9中所示，色蛋白在人类肿瘤细胞系组中显示极佳效能，因为其ICso值介于l至47ng/ml范围内。然而，单独脱辅基蛋白没有活性。表821-/-细胞对马杜拉放线菌属21G792色蛋白的灵敏性等基因细胞系p21+/+p21-/-选择性比IC50(吗/ml)90+327+213平均值+SD，n=3表9马杜拉放线菌属21G792色蛋白对抗人类肿瘤细胞系的效能肿瘤细胞系组织IC50(ng/ml)DUM结肠8HCT116结肠1HT29结肠851<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>实例14实例14-由色蛋白诱导的DNA损伤。使用自特威杰(Trevigen)公司获得的COMET分析来检测DNA损伤。将HCT116p21+/+及-/-细胞置于多种量210792色蛋白及米托蒽醌(11^(3加01^)的影响下。如图27中所示，在大于100ng/ml浓度下色蛋白诱导的剂量依赖性DNA链断裂发生在p21-健全型及p21-缺陷型细胞二者中。实例15实例15-由色蛋白诱导的DNA裂解。将超螺旋结构0X174DNA与多种浓度的21G792色蛋白一起培育并通过凝胶电泳进行分析。观察到，色蛋白诱导单链断裂及双链断裂，反应持续进行超过24小时，且与卡奇霉素不同DNA裂解不需要还原剂(二硫苏糖醇，DTT)。凝胶电泳显示于图28中。带缺口的是指DNA中的单链断裂且线性是指双链断裂。实例16实例16-色蛋白消化组蛋白Hl。先前已显示色蛋白烯二炔能裂解组蛋白(泽因(Zein)等人，1993，美国国家科学院院刊90，8009-12;泽因等人，1995，化学及生物学(Chem&Biol)2，451-5;泽因等人，1995，生物化学34，11591-7)，但此活性具有争议(何伊都(Heyd)等人，2000，细菌学杂志182，1812-8)，推测是由于脱辅基蛋白的蛋白水解活性所致。在50mMTris-Cl,pH7.5中于37。C下将组蛋白Hl与多种浓度的色蛋白一起培育过夜。(图29)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)随后用吉尔扣德(GdCode)蓝(皮尔斯生物技术(PierceBiotechnology)公司，罗克福德(Rockford)，伊利诺斯州(IL))对凝胶进行染色来评价组蛋白消化。添加DNA可抑制组蛋白H1消化，表明DNA裂解所需要的相同机制(例如，基于自由基的机制)也与蛋白质消化有关。与此一致，添加自由基清除剂、30mM谷胱甘肽或N-乙酰基半胱氨酸(未显示)可抑制组蛋白消化，但蛋白酶抑制剂不能抑制。卡奇霉素是含有烯二炔的非蛋白质，其不能裂解组蛋白Hl,表明此活性需要完整生色团-蛋白质复合物。实例17实例17-色蛋白消化的特异性。色蛋白消化组蛋白的优先顺序是H1〉H2A〉H2B〉H3〉H4(图30)。色蛋白也可裂解诸如髓磷脂碱性蛋白等碱性蛋白，但不能裂解中性/酸性蛋白(例如牛血清白蛋白)。此可解释组蛋白裂解活性需要生色团的脱辅基蛋白组份酸性脱辅基蛋白可通过静电作用将生色团递送到组蛋白及其它碱性蛋白，此使得生色团能够通过基于自由基的机制裂解碱性蛋白。实例18实例18-在HeLa细胞中由色蛋白消化组蛋白Hl。为研究色蛋白能否在完整细胞中消化组蛋白，将HeLa细胞与化合物在37T:下一起培育过夜。通过SDS-PAGE及使用抗-组蛋白Hl抗体的蛋白质免疫印迹(圣克鲁斯(SantaCruz)生物技术)对细胞裂解物进行分析。与色蛋白一起培育细胞使得细胞中的组蛋白HI减少(图31)。用博来霉素(另一种DNA损伤剂)或用卡奇霉素均未观察到效果。此表明色蛋白能够在完整细胞内消化组蛋白。此活性可通过消化染色质中的组蛋白使DNA更易裂解而促进抗肿瘤效果。此似乎是色蛋白烯二炔的特有活性。实例19实例19-Gl/S检査点的色蛋白诱导。使HCT116(p21十/十及p21-A)细胞暴露于多种浓度的色蛋白中。如图32A中所示，对于所测试的所有浓度，暴露于色蛋白中导致p53检查点激活。仅在？21+/+细胞中观察到p21蛋白质诱导。马杜拉放线菌属21G792色蛋白激活DNA损伤检查点可通过论证p53中丝氨酸-15氨基酸残基的磷酸化予以证实，已知其对于p53蛋白的转录激活甚为重要(图32B)。而且，裂解聚ADP核糖磷酸化酶(PARP)显示(图23B)'当用马杜拉放线菌属21G792色蛋白处理时，与？21+/+细胞相比优先在p21-A细胞中观察到凋亡诱导。此与在p21-/-细胞中IC50值较低一致。实例20实例20-色蛋白物质的活性。在两个实验中，在HCT116结肠癌细胞及80S14细胞(HCT116的p21-A变体)中测定峰"A"(包含生色团-c及-d的色蛋白)、峰"B"(包含生色团-b的色蛋白)及包含所有生色团异型体的色蛋白制剂的活性。色蛋白c的效能(色蛋白-d不具有显著活性)始终为色蛋白b效能的约三分之一。对于色蛋白-b及-c二者来说，与p21+"细胞相比优先在？21-/-细胞中观察到凋亡诱导；参见表10。53表10色蛋白制剂的活性实验1实验2IC50(ng/ml)比IC50(!^g/ml)比生色团制剂HCTU6p21+/+80S14p21-/-HCT116p21+/+80S14p21-A未分离的0.0590.01440.0440駕9b0.1720駕40.2100.0336c0.0640掘40遍0.0116未分离的l細0.02443未分离的0.0970細12实例21实例21-活体内抗肿瘤活性将人类肿瘤细胞系或片段LoVo(结肠癌)、HCT116(结肠)、HT29(结肠)、LOX(黑色素瘤)、HN5(头及颈)、及PC-3(前列腺)移植到无胸腺(裸)小鼠的皮肤下并使其形成肿瘤块。当肿瘤尺寸达到90-200mg时，将盐水对照媒剂或在盐水中调配的多种浓度马杜拉放线菌属21G792色蛋白经静脉内投与给小鼠。小鼠在第5及9天接受随后剂量并观察相对肿瘤生长。结果显示于图33及图34中的曲线图中。观察到接受色蛋白的小鼠肿瘤生长抑制可高达80%。实例22实例22-色蛋白的毒性。毒理学研究表明，除骨髓抑制外，马杜拉放线菌属21G792色蛋白在裸小鼠中耐受性良好。具体来说，在第l、5、及9天将盐水对照媒剂或多种剂量的色蛋白经静脉内投与给六只裸小鼠。小鼠的显微镜研究显示接受色蛋白的所有小鼠皆展示骨髓坏死，接受色蛋白最多的小鼠展示最严重损伤。临床病理学实验揭示接受色蛋白最多的小鼠展示白细胞及淋巴细胞数量最少。然而，在肠、神经、脊髓、肝或注射位点处皆未观察到有害效果。显微镜检査发现及临床病理学概述提供于表11及12中。表11显微镜检査发现概述组治疗剂量(mg/kg)骨髓坏死31媒剂00/6221G79236/6(1,7)321G79266/6(3)a:具有损伤的数量/所检査的总数量(X):平均损伤严重性，其中0=WNL、1=轻微、2=弱、3=中度、4=明显、5=严重54表12临床病理学<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>实例23实例23-由P-GP(MDR-1)转运色蛋白人类PGP(MDR1)是能够将许多药物转运跨过细胞膜的ATP依赖性流出泵。己将此蛋白质的高水平表达与肿瘤的多药耐药性联系起来。如表13中所示，马杜拉放线菌属21G792色蛋白是较差的MDR1底物，且表达临床相关水平MDR1的细胞(KB-8-5细胞)对所述复合物仍具有灵敏性。明显地，不具有蛋白质组份的卡奇霉素是MDR1的良好底物。色蛋白的蛋白质组份可能保护生色团免于由MDR1介导的药物流出，且可能造成在通常表达MDR1的结肠细胞系中具有有益的抗肿瘤效果。表13马杜拉放线菌属21G792生色团及卡奇霉素対-抗P-GP表达细胞的IC5o值IC50(ng/ml)a细胞系P-GP水平21G792卡奇霉素KB-103KB-8-5+621KB-V-1+++142>謂0:两个独立实验的平均值实例24实例24-在HCT116细胞中摄取经FITC标记的色蛋白为确定色蛋白以何种机制进入细胞并发挥其生物活性，使用EZ-标记萤光标记试剂盒(皮尔斯生物技术)按照制造商建议用萤光标签(FITC)来标记色蛋白。标记时未观察到生物活性失去。通过荧光显微术来研究HCT116结肠癌细胞对经标记物质的摄取。与细胞的最佳培育时间是3-6小时。大多数标记出现在细胞质中，尽管在细胞核中也观察到弱染色(图35)。尽管核蓄积量较低，但考虑到复合物效能，此量很可能足以提供生物活性。实例25实例25-在HCT116细胞中摄取经FITC标记的脱辅基蛋白及色蛋白为确定生色团与脱辅基蛋白的完整复合物是否为细胞及核进入所需，用FITC标记色蛋白及脱辅基蛋白。通过荧光显微术来研究经标记物质的摄取。脱辅基蛋白及色蛋白二者的摄取相似。(图36)表明细胞进入并不依赖于完整生色团-蛋白质复合物。实例26实例26-经FITC标记的色蛋白的摄取与未经标记复合物竞争为确定色蛋白进入到细胞中是否受可饱和(例如细胞表面受体依赖性)过程介导，在不存在或存在IO倍过量未经标记试剂(分别为未经标记的色蛋白或脱辅基蛋白)下一起培育HCT116细胞与经FITC标记的色蛋白(图37，右图)或脱辅基蛋白(图37，左图)。通过荧光显微术(左)或流式细胞术(右)分析细胞。未观察到标记竞争，此表明经标记物质的摄取不是受体介导的过程。而且，在流式细胞术直方图中观察到单一峰，表明所有细胞皆相同摄取经标记试剂。直方图中的数字是平均通道数量(FITC荧光)。实例27实例27-能量耗竭及微管破坏对HCT116细胞摄取经FITC标记的脱辅基蛋白的影响。上文实验表明色蛋白进入到细胞不是受体介导的过程。蛋白质复合物可借以进入细胞的其它手段是胞饮作用，其中细胞表面上的细胞质膜小凹陷箍起以形成在细胞的细胞质内游离的胞饮泡。由于胞饮作用是需要功能性微管蛋白细胞支架网状结构的能量依赖性过程，因此我们可以解释叠氮化钠(能量偶合剂)及诺考达唑(破坏微管蛋白细胞支架的试剂)对细胞摄取的影响。在不存在或存在叠氮化钠或诺考达唑下用经FITC标记的脱辅基蛋白处理HCT116细胞。两种处理均抑制标记摄取(图38)。显示诺考达唑的浓度(100nM)足以破坏微管(右图)。这些数据表明脱辅基蛋白的摄取是使用微管网状结构的能量依赖性过程。由于所述数据似乎排除受体介导的过程的可能性，所以最有可能涉及胞饮作用。本申请案与2006年6月21日申请的美国临时专利申请案第60/815,697号有关，出于各种目的将其全文以引用方式并入本文中。5权利要求1、一种发酵培养物，其包含产生色蛋白的放线菌(actinomycete)、选自溴化物及碘化物的卤化物、及选自普朗尼克L-61(PluronicL-61)、普朗克尔P2000(PluracolP2000)(聚丙二醇)及安他罗克17-R2(Antarox17-R2)的表面活性剂。2、如权利要求1所述的发酵培养物，其中所述放线菌是马杜拉放线菌属(AcZ/omadMrasp.)21G792。3、如权利要求l所述的发酵培养物，其中所述表面活性剂是普朗尼克L-61。4、如权利要求l所述的发酵培养物，其中所述放线菌是马杜拉放线菌属21G792且所述表面活性剂是普朗尼克L-61。5、如权利要求1至4中任一项或多项权利要求所述的发酵培养物，其中普朗尼克L-61以约0.1至10gm/L的量存在。6、如权利要求1至4中任一项或多项权利要求所述的发酵培养物，其中普朗尼克L-61以约5gm/L存在。7、如权利要求1至6中任一项或多项权利要求所述的发酵培养物，其中所述卤化物以约1-15mM的浓度存在。8、如权利要求1至6中任一项或多项权利要求所述的发酵培养物，其中所述卤化物以约3-5mM的浓度存在。9、一种产生色蛋白的方法，其包含在包含卤化物及表面活性剂的培养基中使马杜拉放线菌属21G792发酵，所述卤化物选自溴化物及碘化物，所述表面活性剂选自普朗尼克L-61、普朗克尔P2000(聚丙二醇)及安他罗克17-R2。10、一种纯化马杜拉放线菌属21G792色蛋白的方法，其包含获得包含所述马杜拉放线菌属21G792色蛋白的流体，及使所述流体与下述中的一或多种接触(a)阴离子交换色谱基质、(b)疏水作用色谱基质、或(c)尺寸排除色谱基质，及回收所述经纯化色蛋白。11、一种纯化马杜拉放线菌属21G792色蛋白的方法，其包含(a)获得包含所述马杜拉放线菌属21G792色蛋白的流体，(b)使所述流体与阴离子交换色谱基质接触，(c)使所述流体与疏水作用色谱基质接触，(d)使所述流体与尺寸排除色谱基质接触，及(e)回收所述经纯化色蛋白。12、如权利要求10或11所述的方法，其中所回收的所述色蛋白纯度以总蛋白质计是约80%或更髙。13、如权利要求10或11所述的方法，其中所回收的所述色蛋白纯度以总蛋白质计是约卯％或更高。14、如权利要求11所述的方法，其中所述阴离子交换色谱基质是DEAE琼脂糖凝胶。15、如权利要求11或12所述的方法，其中所述疏水作用色谱基质是苯基琼脂糖凝胶。如权利要求ll、12、或13所述的方法，其中所述尺寸排除色谱基质的分离范围是自约3xl()3至约7x105。16、一种经纯化生色团，其具有下式17、一种经纯化色蛋白，其包含如权利要求16所述的生色团。18、一种医药组合物，其包含如权利要求16所述的经纯化生色团。19、一种医药组合物，其包含如权利要求n所述的经纯化色蛋白。20、一种医药组合物，其包含可通过如权利要求9、10或11所述的方法获得的经纯化色蛋白。全文摘要本发明提供产生及纯化由马杜拉放线菌属(Actinomadurasp.)21G792所产生的活性色蛋白的方法。所述色蛋白可用于研制医药组合物及治疗诸如癌症或细菌感染等疾病。文档编号A61K47/48GK101484189SQ200780022758公开日2009年7月15日申请日期2007年6月21日优先权日2006年6月21日发明者尤金·约瑟夫·维杜纳斯,帕梅拉·休·芬克·沙博诺,洛德斯·珍妮特·戈登,平蔡,蔡国真,贾斯廷·基思·莫兰申请人:惠氏公司