专利名称：用于生产l-天门冬酰胺酶ⅱ的重组宿主的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产具有均一纯度的特异性重组大肠杆菌(E co//) L-天门 冬酰胺酶II的新载体、宿主细胞和方法。
相关领域描述
L-天门冬酰胺酶是一种将氨基酸L-天冬酰胺水解为L-天冬氨酸和氨的 酶，即，其是一种脱氨基酶。大肠杆菌含有天门冬酰胺酶的两种同工酶 L-天门冬酰胺酶I和L-天门冬酰胺酶II。 L-天门冬酰胺酶I位于胞质溶胶中， 对天冬酰胺的亲和性低。L-天门冬酰胺酶II位于周质，对L-天冬酰胺具有 高亲和性。
L-天门冬酰胺酶II可通过去除细胞外的天冬酰胺，用于治疗依赖L-天 冬酰胺进行蛋白合成的肺瘤或癌症。其在治疗白血病，例如急性淋巴细胞 白血病(acute lymphoblastic leukemia)中特别有效。L-天门冬酰胺酶通常与 其它抗肿瘤或抗癌治疗联合使用，尽管在某些临床情形下其可以单独使用。 L-天门冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌(五.co/Z)和软腐欧 文氏菌(五nWm'a carotowra )。在哺乳动物中，^f又在豚鼠(Cavioidea超科)和 某些阔鼻猴(New World monkey)中发现略高于痕量的L-天门冬酰胺酶II。
大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II为相同亚单位的四聚体，具有良好的&at 和Km。大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II(本领域也称啦支L-天冬酰胺酰胺水解酶， EC-2型、EC3.5丄1)可以商品名Elspar (Merck & Co. ，Inc.)从商业上获得， 也可从Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd获得。
L-天门冬酰胺酶II本身具有蛋白质疗法的通常不利因素，例如患者对 外源蛋白的高清除率，以及在用该酶治疗的患者体内可能诱导免疫应答。 为了克服这些缺点，已经开发了与聚乙二醇偶联的L-天门冬酰胺酶II衍生
4物,由Enzon Pharmaceuticals, Inc.以商品名pegaspargase或Oncaspar⑧推向市 场。Pegaspargase使用Merck提供的、从大肠杆菌提取的L-天门冬酰胺酶II 制备。Pegaspargase(也称单曱氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基L-天门冬酰胺酶) 具有基本上非抗原性、从循环中的清除速率下降的优点。
然而，尽管获得了这些成功，如果大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II蛋白能 够由重组宿主细胞使用合适的染色体外表达载体(例如质粒)生产，将会 更加有效和经济。这类表达载体可以被工程化，以使得蛋白的生产比天然 大肠杆菌菌抹更有效率。虽然这种重组制备具有可能的优点，据信迄今为 止并没有商用L-天门冬酰胺酶II的准确公开的多肽序列，也没有公开编码 该酶的多核香酸序列。例如，先前Maita等人，1980, //op; e >Se_y/eA Z.尸/zj^'o/. C7ze肌361(2), 105-117,以及Maita等人，1974， 乂所oc/ze附.76, 1351-1354 [Tokyo].净艮道了 L-天门冬酰胺酶II肽序列，然而，如下文中讨论的那样， 该早期工作有大量观"序错误。
L-天门冬酰胺酶II亚单位质粒表达的另一个可能障碍是存在编码L-天 门冬酰胺酶II亚单位的基因，该基因对于可能用作宿主细胞的大肠杆菌菌 抹染色体而言是天然的。这样，就担心从携带染色体外表达载体的Eco" 宿主细胞中收集的L-天门冬酰胺酶II可能包括代表L-天门冬酰胺酶不止一 种同工型的亚单位。由于为了临床和管理目的需要获得明确表征的酶产品， 这一可能性迄今为止代表了在改善大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II蛋白生产效 率方面严肃的技术挑战。
发明概述
本发明满足了上述对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶n的需求，该酶以重组
体形式高效和经济地生产，而提供与商品名为Oncaspa,的大肠杆菌L-天门 冬酰胺酶II蛋白具有同样的多肽结构的酶产品，同时该酶产品不含可检测 量的L-天门冬酰胺酶II其它同工型。
因此，本发明提供了大肠杆菌宿主细胞，其包含大肠杆菌染色体和至 少一份拷贝的重组染色体外载体，其中染色体外载体编码L-天门冬酰胺酶 II蛋白的亚单位，大肠杆菌宿主细胞染色体编码L-天门冬酰胺酶II蛋白的 相同亚单位，其中大肠杆菌宿主染色体不编码L-天门冬酰胺酶II任何其它 的同工型。所述染色体外载体优选为适于在大肠杆菌中复制并表达的质粒。
5优选的，所表达的L-天门冬酰胺酶蛋白包括4个亚单位，该亚单位具
有根据SEQIDNO:l的多肽序列，其对应于用于生产Oncaspa^的L-天门冬 酰胺酶II亚单位的序列，而质粒载体包括与适当的启动子可操作连接的编 码L-天门冬酰胺酶蛋白亚单位的核酸分子。该启动子是任何合适的启动子， 但任选选自由T7、 araB、 trp、 tac、 lac、人P。 XPR,、 aroH和phoA启动子组 成的组。质粒载体任选包括其它载体元件，其在高效表达和/或产品纯化中 可能是需要的，这些其它载体元件与L-天门冬酰胺酶开放阅读框架和/或启 动子可操作连接。这些载体元件包括例如相容的操纵子序列、核糖体结合 位点、转录终止子、信号序列、抗药性标记以及复制起点。也可以具有由 质粒携带的相关阻遏蛋白基因的拷贝，例如lacl 。
优选的，所述编码L-天门冬酰胺酶II亚单位的质粒DNA分子包含SEQ ID NO: 2,编码L-天门冬酰胺酶II蛋白亚单位的染色体DNA分子包含SEQ ID NO: 3。
附图简述
图1显示了 pEN537质粒载体的图镨。 发明详述
相应地，为了对相应于Oncaspar 和Kyowa Hapkko L-天门冬酰胺酶的 L-天门冬酰胺酶II的生产进行改善，需要获得编码该酶的载体，以及提供 仅表达L-天门冬酰胺酶II单一同工型的宿主细胞。因此，对来自Merck& Co., Inc.的L-天门冬酰胺酶II和获自Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.的L-天门冬 酰胺酶II进行测序，所得序列与来自大肠杆菌K-12的L-天门冬酰胺酶II 进行比较(由Jennings等报道，1990 J^oc&r/o/ 172: 1491-1498，其整体引入 本文作为参考)。所述K12L-天门冬酰胺酶I1由ansB基因编码(GeneBank No.M34277，引入本文作为参考)。
如前所述，本领域技术人员将理解，L-天门冬酰胺酶1I包含4个相同 的亚单位。因此，提到的编码酶和酶蛋白序列的基因或DNA分子，指编码 这些相同亚单位中的一个的基因。
肽测序通过本领域标准方法进行，如下面实施例1所概述的。令人惊 讶的是，Merck & Co., Inc.,和Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd的亚单^立的蛋白序列相同(参见SEQIDNO: 1)。根据该数据，可以认为早期由Maita等， /980 i/o; / e Se少/eA Z.尸/z;^》/. CTzem. 361(2), 105-117,和Maita等，1974, 历oc/zem. 76, 1351-1354 [Tokyo]报道的Merck L-天门冬酰胺酶序列实际上存 在许多错误。
所得的序列同样与K12L-天门冬酰胺酶I1的亚单位结构进行了比较。 发现K12 L-天门冬酰胺酶II亚单位在4个特定残基位点不同于Merck & Co., Inc的L-天门冬酰胺酶II 。相对于Merck L-天门冬酰胺酶II， K12酶的亚 单位将Ala27替换为Val27, Asp64替换为Asn64, 1^252替换为Ser252，以及 Asri263替换为Thr263。
如前所述，优选大肠杆菌宿主细胞的染色体不表达与染色体外载体(即 质粒)不同同工型的L-天门冬酰胺酶II。这一所希望的结果可通过一些可 选择的途径之一而获得。例如，大肠杆菌宿主染色体上的任何L-天门冬酰 胺酶II基因可被全部或部分删除或敲除。或者，出现在宿主染色体上的任 何其它L-天门冬酰胺酶II基因可被天然启动子的内在调控性质所抑制，这 种天然启动子在与有利于染色体外载体编码的L-天门冬酰胺酶II同工型表 达的相同培养条件下不允许染色体L-天门冬酰胺酶II同工型的表达。然而， 优选的，让染色体和染色体外L-天门冬酰胺酶II基因表达L-天门冬酰胺酶 II的相同同工型。
为此目的，对由几种可得到的大肠杆菌菌抹生产的L-天门冬酰胺酶II 亚单位进行测序，并且与商用的酶产品进行比较。出乎意料的是，大肠杆 菌BLR(DE3)菌抹[来自Novagen Corporation;目录号69208-3]产生了与商 用酶相同结构的染色体编码的L-天门冬酰胺酶II,却发现同样受试的大肠 杆菌GX1210和大肠杆菌GX6712菌抹产生了 L-天门冬酰胺酶II的不同同 工型。
鉴别了优选的大肠杆菌宿主后，可构建染色体外表达的载体(即作为 染色体外实体存在，其复制独立于染色体的复制)。适用于大肠杆菌的染 色体外载体包括，例如pUC或pBR322衍生的质粒。其包括质粒例如pET 和pBAD,以及多种含有表达元件，如T7、 araBAD、 phoA、 trc、 Ol、 0R、
P。 PR的质粒。
在载体中，编码L-天门冬酰胺酶II亚单位的核酸序列与合适的启动 子序列可操作连接。合适的启动子包括，例如T7、 araBAD、 phoA、 trc、O。
Or、 Pi^和PR启动子。优选的，所述启动子为T7病毒启动子。
合适的诱导物元件包括，诸如阿拉伯糖、乳糖或热诱导，磚酸限制
(phosphate limitation )、色氨酸限制等，在此不——列举。优选的，诱导物 元件为乳糖操纵子，其可被异丙基硫代半乳糖苷("IPTG")诱导。
合适的信号序列(信号肽)可衍生自pelB， fd pIII或ompA。优选的， 信号肽来自ansB。
合适的抗生素选择性标记物在本领域是公知的。例如赋予氨苄西林 (ampicillin )、卡那審素(kanamycin )、 氣零素(chloramphenicol )、矛J-w平 (rifampicin )或四环素(tetracycline )抗药性的那些选择性标记物,以及其他。
合适的复制起点序列包括在下列质粒中发现的那些pf/CW，
合适的终止序列包括，例如噬菌体fd主要终止子，TF和〃wB。
通常，质粒优选用在大肠杆菌中。常规的质粒载体为双链环状DNA分 子，优选经工程化而带有酶识别位点，以适于插入外源性DNA序列；以及 带有抗生素选择性基因、用于宿主细胞内自主增殖的复制起点，以及用于 辨别或选择含有重组插入DNA的克隆的基因。可用的质粒载体包括，例如 pET3， pET9， pETll以及扩展的pET系列(见Novagen Corporation目录)， pBAD, trc, phoA, trp和OiVPL,R质粒。
如下文举例说明，pET表达系统的质粒，例如pET27b十是优选的。为 了提供有效和可控的酶表达，所述表达载体也包括启动子，操纵子，核糖 体结合位点，信号序列，转录终止子，复制起点以及阻遏蛋白基因的受调 控的拷贝(例如lacl)。
宿主大肠杆菌菌抹将在其染色体中含有相容的调控元件。例如，BLR (DE3)细胞中含有受lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因。该菌林是 噬菌体DE3的溶原性细菌。向BLR(DE3)的培养物中加入IPTG可诱导T7 RNA聚合酶，其继而转录在pET质粒上的靶基因。BLR(DE3)也是recA-的， 其可对染色体外质粒上的基因提供进一步的稳定性。
为了获得编码Merck和Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd.酶的核酸分子，可
采用合适的方法修饰可用的L-天门冬酰胺酶n。L-天门冬酰胺酶ii亚单位
大肠杆菌K-12 ansB的326个成熟氨基酸的序列由978个碱基对的片段所编码，见Jennings MP和BeachamIR所冲艮道(1990/Sa"en'oZ 172: 1491-1498; GeneBankNo. MM277)。在成熟蛋白前含有22个氨基酸信号肽的ansB基因 用常规聚合酶链式反应(PCR)从另一种大肠杆菌K-12菌抹(GX1210;获 自Genex Corporation)中克隆。编码大肠杆菌K-12 ansB L-天门冬酰胺酶II 亚单位的ansB基因通过定点诱变(例如采用Amersham Sculptor方法)进行 修饰(adapted),以表达含有上述残基置换的L-天门冬酰胺酶II，来进行 下述碱基置换。碱基530处T变为C,碱基640处的A变为G,碱基1205 处的T变为A，碱基1239处的C变为A。编号基于GeneBankNo. M34277 给出的编号，引入本文作为参考。所得的密码子改变[相应位置上GTG变为 GCQ; AAT变为GAT; TCT变为ACT和ACC变为AAC]将ansB基因转化 为修饰的基因(下文中称ansB*; SEQIDNO: 2),其表达与从Merck & Co.， Inc.和Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd获得的相同的L-天门冬酰胺酶II亚单 位。
31^8*基因可插入如上所述的任何适于在大肠杆菌中进行高效蛋白表
达的染色体外载体。特别的，ansBf基因被插入到质粒pET-27b+中(Novagen Corporation),通过电穿孔导入大肠杆菌菌林BLR (DE3),如下文实施例 中所详述的，以获得带有&1^8*质粒、作为符合Merck L-天门冬酰胺酶II 的均一同工型表达L-天门冬酰胺酶II亚单位的大肠杆菌。
优选的，使用根据实施例鉴定的、称为菌抹EN538 (保藏为ATCC保藏 号PTA 7490)的克隆，可通过任何本领域已知的适于大肠杆菌的方法培养。 合适的培养系统包括分批、补料分批和连续培养法。培养基选自本领域已 知的最适于大肠杆菌的培养基。一旦培养物到达足够的密度(为约加OD660 至约200 OD柳)，向培养基中加入合适的诱导物，例如IPTG。足够长时间 后(约0.5小时至约20小时)，所产生的L-天门冬酰胺酶II通过标准方法 从培养基和/或从培养物中收集的细胞团块(cellmass)中纯化。
细胞团块通过离心和/或过滤收集，并且用任何本领域已知的方法裂解。 胞体的裂解可以通过下列方法完成，其包括酶促细胞壁裂解然后进行渗 透性溶解，冻融，超声处理，机械破裂(例如微流化)，采用裂解剂等。随 后通过过滤和/或离心从可溶蛋白成分中分离破裂的细胞团块。为获得最佳 收率，可采用数个裂解、清洗和分离循环。
所述酶可通过公知的纯化方法从上清和/或培养基中回收和纯化。所述方法包括硫酸铵沉淀、酸提取、层析聚焦、阴离子或阳离子交换层析、磷 酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、FPLC⑧(快 速蛋白液相层析)、高效液相层析等。
可对发酵过程的若干参数进行调整，以优化天门冬酰胺酶的表达或控 制蛋白从周质渗漏至生长培养基中的程度。这些变量包括培养基组分(例如
碳和氮源以及添加的氨基酸或其它营养素)，温度，pH,诱导物浓度和表达
持续时间。总的大肠杆菌遗传谱系(基因型)也可影响表达和产物渗漏。 根据蛋白表达和从宿主细胞渗漏的结果，可能仅需要从细胞(周质)收集、 仅从培养基收集或从总的发酵罐内含物中收集天门冬酰胺酶产品。
物的系统的列表，例如:v'(CR32R33》-, -[C(=0)〗v,0(CR32R33)t'0-, -[C(=0)]v'0(CR32R33)t'NR36-, -[C(=0)]v'0(CR32R330)t'NR36-, -[C(=0)]v,NR3!(CR32R33)t'-， -[C(=0)]v'NR31(CR32R33)fO-, -[C( 31(CR32R330)t'_, -[C(=C0]v'NR31(CR32R33O)t'(CR34R35)y-, -[C( 31(CR32R330)t'(CR34R35)y'0-, -[C(=0)]v'NR31(CR32R33》(CR34CR350)y'-， -[C(=0)]v'NR31(CR32R33)t'(CR34CR350)y'NR36-, -[C(=0)]v'Ml3!(CR32R33)t'NR36-，
-[C(=0)]v,0(CR32R33).
(CR34R35)t.NR36-R37
-[C(=0)]v,NR31(CR32R33)y,~<￡^>~(CR34R35)t,0-，其中
1131-1137独立的选自由氢、氨基、取代的氨基、叠氮基、羧基、氰基、
卤素、羟基、硝基、甲硅烷基醚、磺酰基、巯基、Cw烷基巯基、芳基巯基、取代的芳基巯基、取代的Q-6烷硫基、C卜6烷基、C2-6烯基、C2—6炔基、C3.19支链烷基、C3.8环烷基、Ci—6取代的烷基、C2—6取代的烯基、(32.6取代的炔基、C^取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、6杂烷
基、取代的C,—6杂烷基、C^烷氧基、芳氧基、C,.e杂烷氧基、杂芳氧基、
C2—6烷酰基、芳基羰基、C2_6烷氧羰基、芳氧羰基、烷酰氧基、芳基羰基氧、C2_6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2—6取代的烷酰氧基、取代的芳氧基
羰基、(:2.6取代的烷酰氧基、取代的和芳基羰基氧组成的组，
其中取代基选自由酰基、氨基、酰氨基、脒、芳烷基(araalkyl)、芳基、叠氮基、烷基巯基、芳基巯基、羰基、羧酸酯、氰基、酯、醚、甲酰基、卣素、杂芳基、杂环烷基、羟基、亚氨基、硝基、硫代羰基、硫酯、硫代乙酸酯、硫代甲酸酯、烷氧基、磷酰基、膦酸酯、次磷酸酯、甲硅烷基、巯基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰(sulfamoyl)、氨磺酰(sulfonamide)和^黄酰基组成的组。
(t，)和(y，)独立的选自0或正整数，优选1-6，以及
(v')为0或1。
优选的，Lw和"选自
-C(0)CH2OCH2C(0)-;
-C(0)CH2NHCH2C(0)_;
-C(0)CH2SCH2C(0)-;
-C(0)CH2CH2CH2C(0)4。
-C(0)CH2CH2C(0)-.
或者，合适的氨基酸残基可选自任何已知的天然L氨基酸，例如丙氨
酸、缬氨酸、亮氨酸等，和/或其组合，在此不--列举。Lw和Ls也可包
括肽，其大小在约2至约10个氨基酸残基范围内。
天然氨基酸的衍生物和类似物，以及多种本领域已知的非天然的氨基酸(D或L)，无论其是疏水或非疏水的，同样落于本发明的范围之内。
A部分
1. 离去或活化基团
在A为活化基团的那些方面，合适的部分包括但不限于如下基团例如N-羟基苯并三唑基、卣素、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基、对硝基苯氧基、咪唑基、N-鞋基琥珀酰亚胺基、p塞唑烷硫酮、邻酰基脲、五氟苯氧基或2,4,6-三氯苯氧基或其它对于本领域普通技术人员来说是显而易见的合适的离去基团。
为了本发明的目的，离去基团应当理解为能够与所希望的靶标上的亲核基团反应的那些基团，即生物活性部分、诊断试剂、靶向部分、双功能间隔区、中间体等等。因此靶标含有用于置换的基团，例如蛋白、肽、酶、天然或化学合成的治疗性分子(如多柔比星)上的氨基，间隔区例如单保护的双胺类化合物。应当理解，被选择用于A的那些基团也可与生物活性亲核物质以外的其它部分反应。
2. 官能团
A也可以是官能团。该官能团非限制性的例子包括马来酰亚胺基，乙蹄基，砜、羟基、氨基、羧基、巯基、酰肼、肼基曱酸酯(carbazate)等的残基，其可以通过含胺的间隔区连接至N-二 (羟乙基)甘氨酸部分。 一旦连接到N-二 (羟乙基)甘氨酸部分，官能团(例如马来酰亚胺)可用于将N-二 (羟乙基)甘氨酸聚合物连接至靶标，例如多肽的半胱氨酸残基、氨基酸或肽间隔区等。
3. 烷基
式(I)中，当A为烷基时，非限制性的合适基团的列表由Cw烷基、(32.6烯基、C2.6炔基、Cw9支链烷基、C3—8环烷基、Cw取代的烷基、<:2.6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-s取代的环烷基、芳烷基(aralkyl) 、 d.6杂烷基和取代的d-6杂烷基。
Z部分及其功能
在本发明的一方面，Z为L7-C(=Y12),其中L7为双功能接头，选自定义L,-6的组，Y12选自与定义Y,的组相同的组。在本发明的这一方面，基
23团Z用作L-天门冬酰胺酶和聚合物递送系统的剩余部分之间的连接。在本发明的另一方面，Z为被主动转运至革巴细胞中的部分，疏水部分和其组合。Z，当存在时可以充当双功能接头、被主动转运至靶细胞中的部分，疏水部分和其组合。
在本发明的这一方面，可释放的聚合物系统制备成体内水解能将聚合
物从L-天门冬酰胺酶上切割下来、并将酶释放入细胞外液体、而酶仍然连有Z部分的形式。例如一种可能的Z-B组合是亮氨酸-L-天门冬酰胺酶。
L-天门冬酰胺酶缀合物的制备
用作说明目的，合适的缀合反应包括将L-天门冬酰胺酶与本文中所述的经过适当活化的聚合物系统反应。该反应优选在本领域普通技术人员熟知的蛋白修饰条件下进行，包括使用PBS援沖系统等，pH范围为约6.5-8.5。大多数情况下应当考虑采用过量的活化聚合物与L-天门冬酰胺酶反应。
这类反应通常会形成缀合物，其含有一种或多种与L-天门冬酰胺酶连接的聚合物。应当理解的是，通常需要分离各种组分，以提供更为均一的产品。在本发明的大多数方面，反应混合物收集后加载到适当的柱树脂上，用递增浓度的緩冲液依次洗脱所需的组分。在进一步处理前，组分用适当的分析工具分析，来测定缀合蛋白质的纯度。不考虑合成途径和选择的活化聚合物，所述缀合物应当与本文中定义的式(I)相一致。用本丈中所述合成技术制备的某些优选的化合物包括
<formula>formula see original document page 24</formula>其中B为L-天门冬酰胺酶。
根据本发明制备的其它缀合物包括:<formula>formula see original document page 25</formula>
其中所有的变量如上文中所定义。例如，包括在缀合物中的某些实施方案选自由下列组成的组
<formula>formula see original document page 25</formula>其中B为L-天门冬酰胺酶。可用于缀合物中的非限制性的列表为选自
qi o
其中B为L-天门冬酰胺酶。特别优选的缀合物是
其中B为L-天门冬酰胺酶.其它缀合物包括
R5-cR6
丫5
II
g
R ICIR
26m-PAG
其中mPEG的分子量为约10,000至约40,000。
当采用基于N-二(羟乙基)甘氨酸的聚合物系统时，两种优选的缀合物
为
其中mPEG的分子量与上述相同。
必须注意，L-天门冬酰胺酶的PEG化将对与每个蛋白上的总PEG连接 数、PEG聚合物大小和PEG接头设计进行经验性的优化。用于评价PEG化 优化的PEG化的L-天门冬酰胺酶的关键特征包括体外测定(例如酶活性和 稳定性)和体内测定(例如药代动力学和药物动力学)。
通过本文中所述DNA、载体和宿主细胞生产的L-天门冬酰胺酶可用于 本领域对于Elspar (Merck & Co., Inc.)和Oncaspar (Enzon Pharmaceuticals, Inc.)已知的所有方法和适应症。这样，本发明所述L-天门冬酰胺酶II (无 论其是与聚氧化烯烃缀合的，还是作为未缀合的蛋白)可以以有效治疗疾 病或病症或其它对该治疗有反应的症状的量，向需要的患者施用。根据已 知的Elspa,和Oncaspar 的性质，本领域技术人员可推断出合适的剂量、施 用途径和给药方案。
^t%sn
O
mPEG^义
治疗方法
27实施例
下述非限制性的实施例说明本发明的某些方面。 实施例1
L-天门冬酰胺酰氨基水解酶EC-2型，EC 3,5丄1的测序；大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II蛋白
为了分别获得商业上可从Merck & Co.和Kyowa Hakko Kogyo Co.得到
的L-天门冬酰胺酶n的氨基酸序列，对这些蛋白进行了蛋白序列分析，并
与已发表的大肠杆菌K-12 ansB基因序列(GenBank登录号M34277)进行比较。
L-天门冬酰胺酶II测序按如下进行。 一份2mL的L-天门冬酰胺酶II (80 mg/mL; Merck)用试剂纯的水稀释，产生蛋白浓度为5.0 mg/mL的稀释 液。在进行蛋白序列分析前用0.22lam滤器过滤稀释液至小瓶中，以减少生 物负荷量。类似的，将100 mg L-天门冬酰胺酶II (Kyowa Hakko Kogyo)溶 于20mL试剂纯的水中，获得5.6 mg/mL的稀释液，无菌过滤。采用定量 氨基酸序列分析、N-末端序列测定、肽图谱和质谱，测定这两个蛋白的完 整序列。制备胰蛋白酶消化、胰凝乳蛋白酶消化、Lys-C消化和澆化氰(CnBr) 片段，用高效液相色谱("HPLC")分离，在分离的肽段上进行质谱和氨基酸 序列分析。所完成的分析显示这两个商用L-天门冬酰胺酶II具有明显的序 列一致性，然而，有4个氨基酸位置与来自大肠杆菌K-12天门冬酰胺酶的 基因序列不同。这四个有差别的位置如下表l所示。
表1
残基位置2764252263
Merck 和 KHAlaAspThrAsn
K12 AnsBValAsnSerThr
实施例2
表达重组L-天门冬酰胺酶II的大肠杆菌菌抹EN538的构建 对编码大肠杆菌K-12ansBL-天门冬酰胺酶II的基因进行修饰，使之 表达具有按实施例l表l中所示的残基置换的L-天门冬酰胺酶II。大肠杆
28菌K-12 ansB L-天门冬酰胺酶II的326个成熟的氨基酸序列通过978个 i威基对的片段编码，见Jennings MP和Beacham IR所报道(1990 </ Bacteho/ 172: 1491-1498; GeneBankNo. M34277)。在成熟蛋白前含有22个氨基酸的 信号肽的ansB基因用常规聚合酶链式反应(PCR)方法从另一种大肠杆菌 K-12菌抹(GX1210;来自Genex Corporation)中克隆。具体的，采用寡核芬 酸5 ，-TACTGAATTCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCA-3， (SEQ ID NO: 4)和5，-ACAGTAAGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCTG-3， (SEQ ID NO: 5) 作为引物，使用Perkin Elmer Gene Amp 9600热循环仪、Taq聚合酶和标准 试剂。循环参数为94。C30秒，40。C30秒，72。Cl分钟，25个循环。
扩增的 1 kb带用TBE琼脂糖凝胶电泳纯化，Eco RI和Hind III酶切， 克隆至噬菌体载体M13mp8中。AnsB基因的DNA序列[Genebank No. M34277]经人工DNA双脱氧序列测定法确认。克隆的ansB基因随后进行 定点诱变，改变ansB基因的4个密码子[碱基530处GTG变为GCQ;碱 基640处AAT变为GAT ;碱基1205处TCT变为ACT;碱基1239处ACC 变为AAC]以编码改变的氨基酸(Val27Ala; Asn64Asp; Ser252Thr;以及 Thr263Asn),其采用Amersham RPN 1523第2版诱变试剂盒进行，如 Whitlow和Filpula所描述的那才羊[Single Chain Fvs, In Tumour Immunology. A Practical Approach, Ed. G. Gallagher, R.C. Rees， and C,W. Reynolds, 1993, Oxford University Press, pp 279-291]。
具体的，采用的诱变寡核苷酸为 5，-CAACTTTACCCGCTGTGTAGTTAS-3， (SEQ ID NO: 6)用于Val27Ala
改变；
5，-CAGCCAGACATCATCGTTCATGTC-3， (SEQ ID NO: 7)用于 Asn64Asp 支变；
5，-GTCGAACACAGTTTTATACAGGTTGC-3， (SEQ ID NO: 8)用于 Ser252Thr改变；
5'-CTGCAGTACCGTTTTTCGCGGCGG-3， (SEQ ID NO: 9)用于 Thr263Asn改变。所有4种变化一批完成，DNA测序证实了经修饰的ansB 基因序列[在此称为ansB+基因(SEQIDNO: 2)〗。
采用PCR扩增通过分别在该基因的5，和3，末端导入侧翼限制位点7Vcfe/ 和5amH/，将ansB^基因克隆至质粒pET-27b+ (Novagen Corporation)中。用限制酶A^fe/和SawH/将合成的DNA消化后，lkb的基因用T4DNA连接酶 连接至质粒载体pET-27b(+)质粒中，其同样已用这两种酶消化。重组质粒 通过电穿孔导入大肠杆菌菌抹BLR (DE3)中，根据生产商说明通过BTX Electro Cell Manipulator 600进行。
PET载体构建体将ans;^基因置于T7启动子后面，T7启动子在添加 IPTG后可被诱导。在lacUV5启动子的控制下，IPTG诱导染色体T7 RNA 聚合酶基因的表达，随后T7RNA聚合酶转录ansBf基因，获得高水平表达 的ansB+蛋白产品。
转化混合物铺于含有卡那霉素(15 pg/ml)的LB琼脂板上，以选择含有 质粒pET-27b(+)/ansBt的克隆。其称为质粒pEN537,如图1所示。分离的 克隆进一步通过铺板纯化，采用标准方法(例如Novagen pET System Manual 第9版中公开的那些)分析IPTG可诱导的基因表达。基因序列采用Applied Biosystems Prism310 Genetic Analyzer验证。
实施例3
重组L-天门冬酰胺酶II的表达及酶的部分表征
在37°C下，在含卡那霉素(15pg/ml)的LB培养基中培养菌株EN538。 在OD,为约0.8时，向培养物中加入IPTG (1 mM),使基因表达的诱导进 行约2、 3或4小时。培养物的SDS-PAGE分析证实了 34.6 kDa ansB水多肽 的高水平表达，采用抗大肠杆菌天门冬酰胺酶II兔多克隆抗体进行蛋白质 印迹分析，证实了 SDS-PAGE上主要诱导的蛋白带为L-天门冬酰胺酶II.。
由于在信号肽去除后，L-天门冬酰胺酶II通常分泌至周质间隙，进行 附加试验以检查天门冬酰胺酶在细胞抑或培养基中的位置。离心培养物， 将细胞沉淀重悬于溶菌酶溶液中以破坏细胞壁，随后通过SDS-PAGE检查 可溶性和不溶性细胞相连的蛋白，以及培养时释放到培养基中的蛋白。
这些分析显示，37 。C诱导3或4小时获得了近乎最大量的ansB*表达， 约为总细胞蛋白的30%。通过用溶菌酶处理，至少70%的天门冬酰胺酶可 从细胞沉淀中溶解。培养过程中释放到生长培养基中的天门冬酰胺酶的量 约为天门冬酰胺酶总表达量的25%。
通过溶菌酶处理从周质释放的溶解的天门冬酰胺酶进一步采用 RP-HPLC测定天冬氨酸以检查酶活性，天冬氨S吏是经天门冬酰胺酶反应从底物天冬酰胺产生的产物。IPTG诱导样品中粗提取物的酶活性约为60
IU/mg，而从未诱导的培养物制备的样品中仅为约2 IU/mg。由于蛋白在该 步骤仅为20%纯，其与报道的纯天门冬酰胺酶II的比活( 250-300 IU/mg) 符合良好。该天门冬酰胺酶制品的N末端序列分析采用AppliedBioSystems PROCISE蛋白测序仪进行。其N末端序列LPNITILATGGTIAGGGDSA (SEQ ID NO: 10)与成熟的正确加工的天门冬酰胺酶所预测的N末端蛋白 质序列完全符合。该样品还进行了 LC-MS分析(Jupiter C-18反相柱)，主 要蛋白种类所显示的分子量为34,592，完全符合成熟ansB5^天门冬酰胺酶 的预测质量。未观察到带有正亮氨酸置换的蛋白质种类。
实施例4
来自pEN537质粒和大肠杆菌BLR染色体的L-天门冬酰胺酶II蛋白 编码序列(ANSB & ANSB*基因)
染色体DNA从大肠杆菌BLR (DE3)[来自Novagen Corporation; Cat. No. 69208-3]制备。将2 ml在37 °C下含卡那霉素(15 pg/ml)的LB培养物中生长 的BLR在微量离心机中离心2分钟，细胞沉淀重悬于0.5 ml STET缓沖液 中。加入苯酚/氯仿(0.5ml)，涡旋搅拌混合物，在室温下离心5分钟。收集 上清，与50pl的3M醋酸钠和1 ml乙醇混合。水上孵育10分钟后，通过 离心使DNA沉淀，再重悬于10(^1水中。采用该样品进行PCR,以分离染 色体ansB基因。PCR反应混合物含有5 pl的10x高保真度PCR緩冲液， 5^1的lOmMdNTP混合物，lpl的50mMMgSO4 ， 0.5的(il(50pmo1) 寡核苷酸5，-GATCCATATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCAC-3， (SEQ ID NO: 11), 0.5 pi (50 pmol)寡核苷酸
5，-GTACGGATCCTCATTAGTACTGATTGAAGATC-3，(SEQIDNO: 12)， 1 ^ 的BLRDNA, 36M!蒸馏水和lpl的Platinum Taq高保真度聚合酶。PCR 产物用来自Invitrogen Corporation的商用TOPO克隆系统克隆，按生产商说
明操作。
采用PCR产物和TOPO TA载体的克隆反应以6 pi体积在室温下进行 30分钟。将反应的连接产物转化至感受态TOPIO大肠杆菌细胞中，铺于卡 那霉素选择性的LB琼脂平板上。克隆的ansB BLR染色体基因和pEN537 ansB^基因的DNA序列分析采用Applied Biosystems Prism 310 GeneticAnalyzer在质粒上进行。两个条带均进行了测序。BLR ansB基因和pEN537 &1^8*基因的编码序列在成熟蛋白编码序列中有29个不匹配的碱基分派。 然而由于密码子简并，这些碱基置换没有一个导致氨基酸序列的变化。所 编码的来自BLR的ansB蛋白和所编码的来自pEN537的ansB^蛋白被证 实在氨基酸序列上相同。这两个天门冬酰胺酶蛋白中，所有的326个位置 -波显示均相同。
实施例5
从细胞和培养基中纯化
下述方法？文纟扁自Harms等，1991 /Vc^ez.w 5!xpresw'cw ami尸Mnyk^&ow 2: 144-150。
如上文所述，37 。C下，在摇床培养箱中用含卡那霉素(15 pg/ml)的Luria 肉汤培养大肠杆菌菌抹EN538的培养物。在OD660为0.8时，加入IPTG 至终浓度为lmM，继续生长4小时。离心收集细胞。采用2ml培养物进行 分析。
为了获得细胞提取物，将细胞沉淀重悬于1 ml裂解缓沖液中(50 mM KPO， pH 7,5, 1 mM EDTA， 0.5 mM 二硫苏糖醇)，通过孩t流化裂解细胞。离 心去除细胞碎片，测定上清液的L-天门冬酰胺酶II活性，也用上清液通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)测定酶产量。渗透沖击分级分离根据Boyd 等所述进行(1987,尸roc. iVa". ^cad 5W. USA 84:8525-8529,引入本文作为 参考)。简而言之，将细胞沉淀重悬于2 ml球芽(spheroblast)緩冲液中(O.l MTris-HCl, pH8.0, 0.5 M蔗糖，0.5mMEDTA),冰上孵育5分钟，离心。 沉淀加热至室温，再重悬于0.3 ml冰冷的水中，置于冰上孵育5分钟，再 离心。上清周质级分不需进一步处理即可进行活性测定和电泳。
酶纯化
对于大规模L-天门冬酰胺酶II制备而言，细胞在分批培养物(IO升) 中生长，采用上述方法进行渗透冲击。每升培养物使用50- 100ml体积的球 芽緩沖液和30-40 ml水。下述方法由从2升培养物中得到的周质提取物开 始。所有的步骤在5-10。C下进行。硫酸铵分级分离
向100ml上清液中加入29.5g固体硫酸铵，获得50%的饱和度。2小 时后，离心去除沉淀，弃去沉淀物。上清加入石克酸铵至90%的饱和度(100ml 中力口入27.2g)。沉淀放置过夜后离心收集，用数毫升25mM哌嗪-HCl緩沖 液(pH5.5)溶解，用相同緩冲液透析。同样的过程应用于其余细胞培养物， 以回收分泌的L-天门冬酰胺酶II。
层析聚焦
多緩沖液交换体系(Polybuffer exchanger )PBE 94的1 x 30-cm柱用200 ml前述哌。秦-HCl緩冲液(起始緩沖液)平衡。样品溶液(10ml)上样后，用 200 ml洗脱緩沖液(Polybuffer 74,用水稀释10倍，HC1调节pH至4.0 ) 以流速为30 ml/h洗脱。以2 ml收集级分，适当稀释20-|iil样品后测定L-天门冬酰胺酶II活性。合并含天门冬酰胺酶的级分，用饱和的石危酸铵溶液 透析。酶沉淀用90。/U直酸铵洗涤，在该介质中以混悬液储存。
实施例6
从细胞和培养基中纯化
如上所述，25-37 °C下，在发酵器中用培养基[例如见Filpula, D., McGuire, J.和Whitlow, M (1996) Production of single-chain Fv monomers and multimers, In Antibody Engineering: A Practical Approach (丄 McCafferty, H. Hoogenboom,禾口 D丄Chiswell, eds.; Oxford University Press, Oxford, UK) pp. 253_268]在卡那霉素(15 pg/ml)存在下培养大肠杆菌菌抹 EN538的培养物。在OD柳为20至200时，加入IPTG至终浓度为0,1-lmM' 继续生长1-12小时。离心收集细胞，使细胞Manton-Gaulin细胞匀浆器。 6。C下，将所述细胞裂解液在24，300 g离心30分钟，收集上清进行超滤/ 渗滤，传导率调节至3mS。裂解液的pH用25%的乙酸调节至4.1，用含5 mM的醋酸钠、25mMNaCl、 pH4.1的緩冲液渗滤。
天门冬酰胺酶用S-Sepharose阳离子交换柱层析进行收集。结合的天 门冬酰胺酶用12.5mM磷酸钾、25mMNaCl、 pH 6.4 (緩沖液NK64)洗脱。
合并S-Sepharose层析所收集的天门冬酰胺酶峰级分，加入0.1 % Tween80,室温下孵育20分钟。加入一份体积的緩沖液NK64，样品加载到
33Q-Sepharose柱上。Q柱用Q-25緩冲液(25 mM NaCl, 10 mM磷酸钾，pH 6.4) 清洗，天门冬酰胺酶用緩冲液Q-135 (135 mMNaCl溶于10mM磷酸钾，pH 6.4)洗脱。
向合并的酶级分中加入硫酸镁粉末，至终浓度为0.25M，加载到用0.25 M的MgSCU、 10mM磷酸钾、pH 7.8预平衡的笨基疏水相互作用柱上。天 门冬酰胺酶以馏分的形式收集在流出液中，用分子量截断值为30kDa的聚 砜膜渗滤在Filtron单元中，緩冲液为75 mM NaCl、 1 mM磷酸钾，pH7.2。
天门冬酰胺酶级分用等体积的水稀释，加栽到羟基磷灰石柱上。用缓 冲液H15 (50 mM NaCl, 15 mM磷酸钾，pH 7.8)洗脱，以除去杂质，纯化的 天门冬酰胺酶用缓冲液Hl50(50 mM NaCl， 150 mM磷酸钟，pH 7.8)洗脱。
实施例7
从细胞和培养基中纯化
按照实施例6生长、诱导和勻浆的大肠杆菌菌抹EN538的培养物采用 50 kDa的Microgon中空纤维针对8倍产物体积的20 mM醋酸钠、40 mM NaCl、 pH4.6渗滤，流速2.9 L/min, 16psi，直至八280低于0.1，传导率为 5 mS。产物用0.22 )im的膜过滤。
阳离子交换层析采用Poros-HS柱进行，层析柱用20mM醋酸钠、pH 4.6、 40 mM NaCl平衡。经渗滤的澄清溶液以0.5柱体积(CV ) /分钟的速 率上样，层析柱用5CV的20mM醋酸钠，pH 4.6, 40 mMNaCl洗涤。天门 冬酰胺酶用20 mM醋酸钠，pH4.6, 135mMNaCl洗脱。
向上述产物中加入0.2 M的pH 9.2的磷酸氢二钠，调节pH至6.3。 样品采用50 kDa的Microgon中空纤维滤器针对10 mM pH 6.3的磷酸钠渗 滤，流速0.74L/min, 16.5 psi。
阴离子交换层析在TMAE Fractogel上进行，层析柱用10 mM pH 6.4的 醋酸钠平tf,将渗滤的阳离子柱洗脱物以0.5CV/min上样，层析柱用5 CV 的10 mM的pH6.4的醋酸钠洗涤，随后柱子再用5 CV的10 mM醋酸钠, pH 6.4， 25 mM NaCl洗涤，天门冬酰胺酶用10 mM醋酸钠，pH 6.4, 100 mM NaCl洗脱。
产物采用50 kDa的膜针对10 mM pH 7.5的磷酸钠渗滤至浓度为40 mg/ml，并用0.22pm的膜过滤。保藏声明
在满足关于国际公认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的
要求的条件下，以下生物材料的培养物已在下述国际保藏机构保藏 美国典型培养物保藏中心(ATCC)
10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A.。
国际保藏号
生物体/载体 ATCC号 保藏曰期
大肠杆菌/EN538 PTA7490 2006年4月11曰
权利要求
1. 用于生产大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II的重组大肠杆菌宿主细胞，其包含大肠杆菌染色体和至少一份拷贝的重组的染色体外载体，其中重组的染色体外载体编码L-天门冬酰胺酶II的亚单位，宿主细胞染色体编码相同的L-天门冬酰胺酶II亚单位，其中宿主染色体不编码L-天门冬酰胺酶II的任何其它同工型。
2. 权利要求1所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述染色体外载体为质粒。
3. 权利要求1所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所编码的L-天门冬酰胺酶II亚单位包含SEQ ID NO: 1 。
4. 权利要求1所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述重组染色体外载体包含编码所述L-天门冬酰胺酶蛋白的DNA分子，所述DNA分子与合适的启动子可操作地连接。
5. 权利要求4所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中启动子选自T7，araB, PR/PL, phoA， trc禾口 trp启动子。
6. 权利要求4所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述重组染色体外载体还包含操纵子、核糖体结合位点、信号序列、转录终止子、抗生素选择性标记、复制起点以及阻遏蛋白的受调节的拷贝。
7. 权利要求4所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述编码L-天门冬酰胺酶蛋白1I亚单位的DNA分子包含SEQIDNO:2。
8. 权利要求4所述的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述染色体包含根据SEQ ID NO:3的DNA分子。
9. 编码SEQIDNO:l的L-天门冬酰胺酶II亚单位的分离的核酸分子，其选自根据SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3的核酸分子。
10. 染色体外载体，其含有权利要求9的SEQ.IDNO:2核酸。
11. 权利要求10的染色体外载体，其为质粒。
12. 权利要求11的染色体外载体，其为质粒pEN537。
13. 包含权利要求12的质粒的大肠杆菌宿主细胞，其被称为EN538，ATCC保藏号为PTA74卯。
14. 制备基本上不含L-天门冬酰胺酶II其它同工型的重组L-天门冬酰胺酶II的方法，其包括培养权利要求13的宿主细胞，以及分离所获得的 L-天门冬酰胺酶II。
15. 聚氧化烯烃缀合物，其包含权利要求14的重组L-天门冬酰胺酶II 。
16. 治疗患有对L-天门冬酰胺酶II有响应的疾病或病症的患者的方 法，包括施用有效量的权利要求14的L-天门冬酰胺酶II 。
17. 治疗患有对L-天门冬酰胺酶II有响应的疾病或病症的患者的方法， 包括施用有效量的权利要求15的与聚氧化烯烃缀合的L-天门冬酰胺酶II。
18. 编码L-天门冬酰胺酶II亚单位的分离的DNA分子，包含SEQ ID NO: 2。
19. 分离的重组蛋白分子，其包含带有相同亚单位的四聚体酶，该亚 单位为SEQ ID NO: 1。
全文摘要
本发明提供了用于生产大肠杆菌L-天门冬酰胺酶II的重组大肠杆菌宿主细胞。所述宿主细胞包含大肠杆菌染色体和至少一份拷贝的重组的染色体外载体，其中重组染色体外载体编码L-天门冬酰胺酶II，宿主细胞染色体编码相同的L-天门冬酰胺酶II，宿主染色体不编码任何其它的L-天门冬酰胺酶II同工型。
文档编号A61K38/46GK101484181SQ200780024860
公开日2009年7月15日 申请日期2007年6月8日 优先权日2006年6月30日
发明者戴维·R·菲尔普拉, 王懋梁 申请人:安佐制药股份有限公司