专利名称：治疗和抑制纤维化疾病和瘢痕疙瘩的方法
治疗和抑制纤维化疾病和瘢痕疙瘩的方法
相关申请
本发明申请要求于2006年7月12日提交的美国临时专利申请第60/830,279号 和2006年10月2日提交的美国临时专利申请第60/849,041号的优先权，两文均以 引用的方式全部并入本文。
政府资助声明
本研究至少有部分工作是由NIH批准的K25HL074968和NIH STTR批准的6 R42 HL071309-03资助。美国政府对本发明持有确定的权利。
背景技术：
疤痕疙瘩和增殖性瘢痕是一类纤维增生性的异常愈合的疾病，其特征是由于细 胞外基质的过度产生、沉积和收缩而引起过度瘢痕化，从而导致功能性和美容性缺 陷(Leask和Abraham, 2004)。目前对于这类病症尚无有效治疗手l爻。
发明内容
在第一方面，本发明提供了治疗和/或抑制纤维化疾病的方法，该方法包括向有 需要的个体给予有效剂量的治疗和/或抑制纤维化疾病的多肽，所述多肽包含根据通 式I的序列
X1-A(X2)APLP-X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)
其中XI是位于序列SEQ ID NO: 298氨基酸残基1和14之间的热休克蛋白20 序列的0-14位氨基酸；
X2选自由S、 T、 Y、 D、 E、羟赖氨酸、羟脯氨酸、磷酸丝氨酸类似物和磷酸 酪氨酸类似物组成的组；以及
X3选自由下列组成的组(a)序列SEQ ID NO: 298的氨基酸残基21至160 的0-140位氨基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3类型序列的0、 1、 2或3位氨基酸，其中 Zl选自由G和D组成的组；Z2选自由L和K组成的组；以及 Z3选自由S、 T和K组成的组。
第二方面，本发明提供了治疗和/或抑制瘢痕的方法，该瘢痕选自由疤痕疙瘩和 增殖性瘢痕组成的组，其方法包括向有需要的个体给予有效剂量的治疗和/或抑制选 自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的瘢痕的多肽，所述多肽包含才艮据通式I的序列的 多肽
X1-A(X2)APLP國X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)
其中XI是位于序列SEQ ID NO: 298氨基酸残基1和14之间的热休克蛋白20 的0-14位氨基酸；
X2选自由S、 T、 Y、 D、 E、羟赖氨酸、幾脯氨酸、磷酸丝氨酸类似物和磷酸 酪氨酸类似物组成的组；以及
X3选自由下列组成的组(a)序列SEQ ID NO: 298的氨基酸残基21至160 的0-140位氨基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3类型序列的0、 1、 2或3位氨基酸，其中 Zl选自由G和D组成的纟且；
在本发明第一和/或第二方面的各种实施方式中，有需要的个体是亚洲人或非洲 人的后代，和/或有需要个体的靶组织中所含的一个或多个生物标志物的水平有所升 高，此生物标志物选自由TGFpl表达物；TGFp2表达物;CTGF表达物；磷酸化丝切 蛋白；磷酸化HSP27;和a平滑肌肌动蛋白表达物组成的组。
具体实施例方式
本文主要采用单字母表示氨基酸。本领域的技术人员所熟知的这种单字母表示 法规则如下
A是丙氨酸；C是半胱氨酸；D是门冬氨酸；E是谷氨酸；F是苯丙氨酸；G是 甘氨酸；H是组氨酸；I是异亮氨酸；K是赖氨酸；L是亮氨酸；M是蛋氨酸；N是 天冬酰胺；P是脯氨酸；Q是谷氨酰胺；R是精氨酸；S是丝氨酸；T是苏氨酸；V 是缬氨酸；W是色氨酸；以及Y是酪氨酸。
本文所使用的单数形式"一 (a) ，， 、 "一 (an)"和"这(the)，，包括复数意 义，除非上下文清楚另有所指。例如，表示一个(a)"多肽"意指一种或多种多肽。
本公开内容指出本发明方法中所使用的多肽可降低转化生长因子pi(TGF-(31)诱 导的结締组织生长因子(CTGF)的表达，以及减少相关胶原的合成。该作用还伴随有细胞形态学的改变(星形形态和应力纤维断裂)。由于肌动蛋白细胞骨架在CTGF 表达时应保持完整，因此这表明本发明多肽改变细胞骨架动力学的能力对于降低疤
痕疙瘩成纤维细胞中的CTGF水平具有重要意义。由于CTGF在纤维化反应的发展
和维持中发挥着关键作用，因此本发明的方法在治疗疤痕疙瘩和大部分纤维化疾病
中具有广阔的应用前景。
因此， 一方面，本发明提供了治疗和/或抑制纤维化疾病和/或选自由疤痕疙瘩和
增殖性瘢痕组成的组的瘢痕的方法，该方法包括向有需要的个体给予有效剂量的治
疗和/或抑制纤维化疾病和/或选自由^痕疙瘪和增殖性瘢痕组成的瘢痕的多肽，所述
多肽包含根据通式I序列的序列
X1-A(X2)APLP-X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)
其中XI是位于序列SEQ ID NO: 298氨基酸残基1和14之间的热休克蛋白20
的0-14位氨基酸；
X2选自由S、 T、 Y、 D、 E、羟赖氨酸、幾脯氨酸、磷酸丝氨酸类似物和磷酸 酪氨酸类似物组成的组；以及
X3选自由下列组成的组(a)序列SEQ ID NO: 298的氨基酸残基21至160的 0-140位氨基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3类型序列的0、 1、 2或3位氨基酸，其中Zl 选自由G和D组成的组；
Z2选自由L和K组成的组；以及
Z3选自由S、 T和K组成的组。
在一种优选实施方式中，XI是WLRR ( SEQ ID NO : 1); Z1是G; Z2是L; Z3是K。在该实施方式中，所优选的是具有通式的多肽包括或由具有SEQIDNO : 300的氨基酸序列(WLRRApSAPLPGLK)组成，其中"pS"表示磷酸化丝氨酸残基。 在另一种优选实施方式中，本发明方法采用的多肽包括或由依照下式的氨基酸序列 组成
Bl-WLRRApSAPLPGLK-B2 ( SEQ ID No : 317 ),其中Bl和B2至少有一个选 自由YARAAARQARA (SEQ ID NO : 281 )和YGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO : 299 )
组成的组。
在一种实施例中，"有需要的个体"是指已遭受或将遭受(例如接受外科手术) 创伤而可能导致选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕和/或纤维化疾病形 成的个体，或者已经出现选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕和/或纤维化疾病形成的个体。本文所述的"创伤"是泛指皮肤和皮下组织的损伤。这类创伤包 括但不限于撕裂伤、烧伤、刺伤、压疮、褥疮、口疮、外伤、咬伤；瘘、溃疡、感
染引发的损伤、牙周创伤、牙槽创伤、口腔烧灼综合征、剖腹产伤口、外科伤口、 切伤、烧伤后挛缩以及整容手术操作引起的创伤。
本文所述的"疤痕疙瘩"是指在愈合的皮肤损伤部位因组织过度生长而产生的 瘢痕。疤痕疙瘩通常伴随严重瘙痒、锐痛和紋理改变。在严重的病例中，它可影响 皮肤活动。本文所述的"增殖性瘢痕"是指生长不超过原始创伤边界的突出性瘢痕， 可随时间而逐渐减小。
本文所述的短语"减少选自由^痕疙瘪和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕形成"是 指在疤痕疙瘩或增殖性瘢痕形成中的任何形式的减少，可为患者带来治疗性的或美 容性的益处。与未采用本发明方法治疗的^痕疙瘩或增殖性瘢痕相比，可通过例如 减小疤痕疙瘩或增殖性瘢痕的大小和/或深度，或者缩小已存在的疤痕疙瘩或增殖性 瘢痕的大小获得这种治疗性的或美容性益处。
通过提供减少选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕形成的方法，本发 明可用于临床治疗各种类型的创伤以减少疤痕疙瘩和增殖性瘢痕形成，既用于减少 初始的总痕疙疼和增殖性瘢痕形成，也可用于对既有疤痕疙瘩或增殖性瘢痕的治疗
性处理(即在疤痕疙瘩或增殖性瘢痕形成后将其切除，采用本发明化合物进行处 理，使疤痕疙瘩或增殖性瘢痕愈合更加緩慢)。
在一种优选实施方式中，需要治疗或抑制选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的 组的瘢痕的个体是有色个体，包括但不限于亚洲人或非洲人的后裔，他们易出现疤 痕疙瘩和增殖性瘢痕，因此可受益于本发明方法用于限制疤痕疙瘩或增殖性瘢痕发 展的预防性治疗，以及用于处理疤痕疙瘩或增殖性瘢痕。
在其他不同的优选实施方式中，需要治疗或抑制纤维化疾病的个体是正在遭受 一种或多种与TGF卩诱导CTGF表达物相关的纤维化疾病或对后者具有高患病风险 的个体，包括但不限于组织纤维化(包括但不限于特发性肺纤维化、肝纤维化、肾 纤维化、腹膜后纤维化、嚢性纤维化、血管纤维化和心脏组织纤维化)；糖尿病性肾 病变、肾小球硬化症和IgA肾病(引起肾功能衰竭并需要透析和再次移植)；糖尿病 视网膜病和黄斑变性(眼部纤维化疾病并可导致失明)；肝硬化和胆道闭锁(导致肝 纤维化和衰竭)；充血性心力衰竭；肺纤维化；硬皮病；腹腔粘连和间质性纤维化。
在本文公开的所有实施方式的其他不同优选实施方式中，需要治疗和/或抑制纤
7维化疾病和/或选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕的个体是那些具有一 种或多种下列生物标志物水平升高的个体
转化生长因子betal( "TGF卩1")表达物;
转化生长因子beta2( "TGFp2")表达物；
结締组织生长因子("CTGF")表达物；
磷酸化丝切蛋白；
磷酸化HSP27;以及
a平滑肌肌动蛋白表达物。
正如以下的公开内容，本发明的多肽能抑制人疤痕疙瘩成纤维细胞中TGF卩1诱 导的CTGF表达、TGFpi诱导的a-SMA表达以及丝切蛋白和HSP27的磷酸化，它 们在纤维化疾病中均有所升高，由此表明具有这些生物标志物水平升高的个体尤其 能得益于本发明的方法。本文所述的一种或多种生物标志物"升高的"水平是指在 个体或处于相似境地的个体的相关靶组织中任何高于正常的情况。该靶组织是受纤 维化症状影响的组织，包括但不限于血液、伤口渗出液和取自受纤维化影响组织的 活检物，后者包括但不限于上述公开的组织(皮肤、肾、肺、肝、腹膜、血管、心 脏、视网膜等)。在其他各种实施方式中，有需要的个体是具有一种或多种所列举的 生物标志物水平高于正常水平5%、 10%、 15%、 20%、 25%、 50%、 75%、 100%或 更多的个体。测定一种或多种生物标志物的水平可采用本领域内的常规技术对蛋白 质和/或基因表达进行检测，包括但不限于以下公开内容。
这些一种或多种生物标志物的"正常"水平可采用任何适当方法建立，包括但 不限于测定无纤维化症状和/或疤痕疙瘩的个体或处于相似境地个体的正常水平，或 者采用任意其他适宜方法建立标准以作参考。
本文所述的"治疗(treat或treating)"是指完成一项或多项以下内容(a)减 轻疾病的严重程度；(b)抑制或防止所治疗疾病特征性症状的发展；(c)阻止所治 疗疾病特征性症状恶化；(d)抑制或防止曾经患病的病人再次患病；以及(e)抑制 或防止曾经出现疾病症状的病人再次出现症状。
本文所述的"抑制(limit或limiting )，，是指抑制具有患病风险的个体发病。
在另一方面，本发明提供了监测本发明方法治疗有效性的方法，包括按本文披 露的方法处理个体，接着测定一种或多种下列生物标志物的水平
TGF(31表达物；化丝切蛋白； 磷酸化HSP27;以及 a平滑肌肌动蛋白表达物。
在这些实施方式中，优选在治疗前测定一种或多种生物标志物的水平以确立治 疗前水平，接着在治疗后测定生物标志物水平。这种随后的生物标志物水平的检测 时机可以是主治医师认为可行的任意时间(即治疗后每周一次；每周两次；每几周 一次等)。即使疗效可由治疗对个体症状的效应而确立，但监测生物标志物水平可提 供疗效的其它信息因而有助于主治医师制定后续治疗方案。例如，如果治疗方案尚 未对个体的症状产生明显改善作用，但是生物标志物的水平显示治疗正在降低生物 标志物水平，那么医师就可能决定继续使用剂量和给药频率相同的治疗方案。可选 自地，如果症状或生物标志物水平均未受治疗影响，则主治医师就可能决定增加药 物剂量和/或给药频率，或者进行联合治疗(包括但不限于TGF-p抗体疗法，和/或 设计为抑制a平滑肌肌动蛋白表达和/或HSP27和/或丝切蛋白去磷酸化的治疗)。
重新提及通式，HSP20的氨基酸残基15-21，形成了依照通式I( A(X2) APLP) (SEQ ID NO : 2)的多肽结构核心，其中HSP20的氨基酸残基16可以被取代。HSP20 的全序列以SEQIDNO:298表示，如下所示
G7m i7e /Vo Pra )^/ G7w尸ra Ser 7>; 丄ew种Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu Ser Ala Pro Gly Arg Leu Phe Asp Gin Arg Phe Gly Glu Gly Leu Leu Glu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Thr Leu Ala Pro iyr Tyr Leu Arg Ala Pro Ser Val Ala Leu Pro Val Ala Gin Val Pro Thr Asp Pro Gly His Phe Ser Val Leu Leu Asp Val Lys His Phe Ser Pro Glu Glu lie Ala Val Lys Val Val Gly Glu His Val Glu Val His Ala Arg His Glu Glu Arg Pro Asp Glu His Gly Phe Val Ala Arg Glu Phe His Arg Arg iyr Arg Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Ala Ala Val Thr Ser Ala Leu Ser Pro Glu Gly Val Leu Ser lie Gin Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ala Lys。
下划线的氨基酸残基表示氨基酸15-21。
XI是SEQ ID NO: 298氨基酸残基1至14之间的SEQ ID NO: 298 0-14位氨基 酸(见上，以斜体字表示)。因此，如果XI是SEQ ID NO: 298氨基酸残基1至14 之间的5位氨基酸，则XI将是邻接氨基酸残基15-21的5位氨基酸,例如SWLRR
9(SEQ ID NO: 303)。同样地，当XI是SEQ ID NO: 298氨基酸残基1至14之间的下列数量氨基酸，则其特性如下所示SEQ ID NO:298的1位氨基酸RSEQ ID NO:298的2位氨基酸RRSEQ ID NO:298的3位氨基酸LRR ( SEQ ID NO: 304)SEQ ID NO:298的4位氨基酸WLRR ( SEQ ID NO: 1)SEQ ID NO:298的6位氨基酸PSWLRR ( SEQ ID NO: 305)SEQ ID NO:298的7位氨基酸NPSWLRR (SEQ ID NO: 306)SEQ ID NO:298的8位氨基酸VNPSWLRR (SEQ ID NO: 307)SEQ ID NO:298的9位氨基酸PVNPSWLRR (SEQ ID NO: 308)SEQ ID NO:298的10位氨基酸VPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 309)SEQ ID NO:298的11位氨基酸PVPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 310)SEQ ID NO:298的12位氨基酸IPVPPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 311)SEQ ID NO:298的13位氨基酸EIPWPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 312)SEQ ID NO:298的14位氨基酸MEIPVPPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 313)在另一种实施方式中，XI是具有WLRR序列(SEQ ID NO: l)的0、 1、 2、 3或4位氨基酸。
在另 一种实施方式中，X3是SEQ ID NO: 298氨基酸残基21-160之间的0-140位氨基酸。根据该实施方式，X3可以是SEQ ID NO: 298氨基酸残基21至160之间
的0、 1、2、3、 4、 5、6、7、 8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、 21、22、23、 24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、 39、40、41、 42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、 57、58、59、 60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、
74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 1 18、 1 19、 120、 120、 121、 122、123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、138、 139或140位氨基酸。
例如，如果X3是SEQ ID NO: 298氨基酸残基21至160之间的5位氨基酸，则X3为邻接氨基酸残基达15-21的5位氨基酸，如GLSAP (SEQ IN No: 314)。本领域的技术人员根据本文所提供的教导将会明悉其他可能的X3序列。
在另一种实施方式中，X3是具有Z1-Z2-Z3类型序列的0、 1、 2或3位氨基酸，其中Zl选自由G和D组成的组；
Z2选自由L和K组成的组；以及Z3选自由S、 T和K组成的组。
例如，如果X3是含Zl-Z2-Z3类型序列的2位氨基酸，则X3可以是GL、 GK、DL和DK。本领域的技术人员根据本文所提供的教导将会明悉该实施方式中其他可能的X3序列。
根据通式I的多肽的不同实施方式，X2是S、 T、 Y、 D、 E、磷酸丝氨酸类似物或磷酸酪氨酸类似物。优选X2为S、 T或Y;更优选X2为S或T,最优选X2为S。在这些X2为S、 T或Y的实施方式中，更优选X2是磷酸化的。当X2为D或E时，这些氨基酸残基具有负电荷能够模拟磷酸化状态。当X2被磷酸化，是磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸类似物或者是其它一种磷酸化氨基酸残基类似物(例如D或E残基)时，通式I多肽在本发明方法中表现出最佳功效。磷酸丝氨酸类似物的实例包括但不限于硫代丝氨酸、含取代磷酸基团氧原子的亚甲基的氨基酸类似物、4-膦酰基(二氟甲基)苯丙氨酸，以及L-2-氨基-4.(膦酰基)-4,4-二氟丁酸。其他磷酸丝氨酸类似物可由本领域的技术人员制备。磷酸酪氨酸类似物的实例包括但不限于膦酰基甲基苯丙氨酸、二氟膦酰基甲基苯丙氨酸、氟-O-丙二酰酪氨酸和O-丙二酰酪氨酸。
因此，根据这些各种实施方式，适用于本发明方法的依照通式I的多肽代表性的实例包括 f旦不限于包括以下序列或由以下序列组成(ASAPLP) (SEQ ID NO:3);(ATAPLP) (SEQ ID NO:4); (RASAPLP) (SEQ ID NO:5); (RATAPLP) (SEQ IDNO:6); (AYAPLP) (SEQ ID NO:7); (RAYAPLP) (SEQ ID NO:8); (RRASAPLP) (SEQID NO:9); (LRRASAPLP) (SEQ ID NO:10); (WLRRASAPLP); (SEQ ID NO:ll)(RRATAPLP) (SEQ ID NO:12); (LRRATAPLP) (SEQ ID NO:13); (WLRRATAPLP)(SEQ ID NO:14); (RRAYAPLP) (SEQ ID NO:15); (LRRAYAPLP) (SEQ ID NO:16);(WLRRAYAPLP) (SEQ ID NO: 17); (RRASAPLPG) (SEQ ID NO: 18); (RRASAPLPD)(SEQ ID NO: 19); (RRASAPLPGL) (SEQ ID NO:20); (RRASAPLPGK) (SEQ IDNO:21); (RRASAPLPDL) (SEQ ID NO:22); (RRASAPLPDK) (SEQ ID NO:23);(RRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:24) ; (RRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:25);
11(RRASAPLPGKS) (SEQ ID NO:26)(RRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:28)(RRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:30)(LRRASAPLPG) (SEQ ID NO:32)(LRRASAPLPGL) (SEQ ID NO:34)(LRRASAPLPDL) (SEQ ID NO:36)(LRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:38)(LRRASAPLPGKS) (SEQ ID NO:40)(LRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:42)(LRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:44)(WLRRASAPLPG) (SEQ ID NO:46)(WLRRASAPLPGL) (SEQ ID NO:48)(WLRRASAPLPDL) (SEQ ID NO:50)(WLRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:52)(WLRRASAPLPGKS) (SEQ ID NO:54)(WLRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:56)(WLRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:58)
(RRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:27)RRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:29)(RRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:31)(LRRASAPLPD) (SEQ ID NO:33)(LRRASAPLPGK) (SEQ ID NO:35)(LRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:37)(LRRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:39)(LRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:41)(LRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:43)(LRRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:45)(WLRRASAPLPD) (SEQ ID NO:47)(WLRRASAPLPGK) (SEQ ID NO:49)(WLRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:51)(WLRRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:53)(WLRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:55)(WLRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:57)(WLRRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:59)
(RRATAPLPG) (SEQ ID NO:60); (RRATAPLPD) (SEQ ID NO:61); (RRATAPLPGL)(SEQ ID NO:62); (RRATAPLPGK) (SEQ ID NO:63); (RRATAPLPDL) (SEQ IDNO:64); (RRATAPLPDK) (SEQ ID NO:65); (RRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:66);
(RRATAPLPGLT)(SEQIDNO:67);(RRATAPLPGKS)(SEQIDNO:68)
(RRATAPLPGKT)(SEQIDNO:69);(RRATAPLPDLS)(SEQIDNO:70)
(RRATAPLPDLT)(SEQIDNO:71);(RRATAPLPDKS)(SEQIDNO:72)
(RRATAPLPDKT)(SEQIDNO:73);(LRRATAPLPG)(SEQIDNO:74)
(LRRATAPLPD) (SEQ IDNO:75);(LRRATAPLPGL)(SEQIDNO:76)
(LRRATAPLPGK)(SEQIDNO:77);(LRRATAPLPDL)(SEQIDNO:78)
(LRRATAPLPDK)(SEQIDNO:79);(LRRATAPLPGLS)(SEQIDNO:80)
(LRRATAPLPGLT)(SEQIDNO:81);(LRRATAPLPGKS)(SEQIDNO:82)
(LRRATAPLPGKT〕(SEQIDNO:83);(LRRATAPLPDLS)(SEQIDNO:84)
(LRRATAPLPDLT)(SEQIDNO:85);(LRRATAPLPDKS)(SEQIDNO:86)(LRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:87); (WLRRATAPLPG) (SEQ ID NO:88); (WLRRATAPLPD) (SEQ ID NO:89); (WLRRATAPLPGL) (SEQ ID NO:90); (WLRRATAPLPGK) (SEQ ID NO:91); (WLRRATAPLPDL) (SEQ ID NO:92); (WLRRATAPLPDK) (SEQ ID NO:93); (WLRRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:94); (WLRRATAPLPGLT) (SEQ ID NO:95); (WLRRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:96); 10 (WLRRATAPLPGKT) (SEQ ID NO:97); (WLRRATAPLPDLS) (SEQ ID NO:98); (WLRRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:99); (WLRRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:100); (WLRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO: 101); (RRAYAPLPG) (SEQ ID NO: 102); (RRAYAPLPD) (SEQ ID NO:103) ; (RRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:104); (RRAYAPLPGK) (SEQ ID NO: 105); (RRAYAPLPDL) (SEQ ID NO: 106); 15 (RRAYAPLPDIQ (SEQ ID NO: 107) ; (RRAYAPLPGLS) (SEQ ID NO:108); (RRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO: 109); (RRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO: 110); (RRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:lll); (RRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO: 112); (RRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:113); (RRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO:114); (RRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO: 115) ; (LRRAYAPLPG) (SEQ ID NO: 116); (LRRAYAPLPD) (SEQ ID NO: 117) ; (LRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO: 118); (LRRAYAPLPGK) (SEQ ID NO:119); (LRRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:120); (LRRAYAPLPDK) (SEQ ID NO: 121); (LRRAYAPLPGLS) (SEQ ID NO: 122); (LRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO: 123); (LRRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO: 124); (LRRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO: 125); (LRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO: 126); (LRRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO: 127); (LRRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO: 128); (LRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO: 129); (WLRRAYAPLPG) (SEQ ID NO: 130); (WLRRAYAPLPD) (SEQ ID NO:131); (WLRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:132); (WLRRAYAPLPGK) (SEQ ID NO:133); (WLRRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:134); (WLRRAYAPLPDK) (SEQ ID NO:135); (WLRRAYAPLPGLS) (SEQ ID 30 NO:136); (WLRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO: 137); (WLRRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO: 138); (WLRRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:139); (WLRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:140); (WLRRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:141);
(WLRRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO: 142); 和(WLRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO:143);《FA7W)RRASAPLP) (SEQ ID NO:144); ((F/Y/W)LRRASAPLP) (SEQ ID200NO: 145); ((FA7W)WLRRASAPLP); (SEQ ID NO:146);((FA7W)RRATAPLP) (SEQ ID NO:147); ((FA7W)LRRATAPLP) (SEQ ID NO:148); ((F/Y/W)WLRRATAPLP) (SEQ ID NO: 149); ((F/Y/W)RRAYAPLP) (SEQ ID NO:150); ((FA7W)LRRAYAPLP) (SEQIDNO: 151) ;((FA7W)WLRRAYAPLP)(SEQIDNO: 152); ((FA7W)RRASAPLPG) (SEQ ID NO: 153);
((F/Y/W)RRASAPLPD) (SEQ ID NO:154); ((F/Y/W)RRASAPLPGL) (SEQ ID NO: 155); ((F/Y/W)RRASAPLPGK) (SEQ ID NO: 156); ((F/Y/W)RRASAPLPDL) (SEQIDNO: 157) ;((FA7W)RRASAPLPDK)(SEQIDNO: 158); ((F/Y/W)RRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:159); ((F/Y/W)RRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:160); ((F/Y/W)RRASAPLPGKS); (SEQ ID NO:161); ((F/Y/W)RRASAPLPGKT) (SEQID NO:162) ;((F/Y/W)RRASAPLPDLS)(SEQIDNO: 163); ((FA7W)RRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:164); ((F/Y/W)RRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:165); ((F/Y/W)RRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:166); ((F/Y/W)LRRASAPLPG) (SEQ ID NO:167) ; ((F/Y/W)LRRASAPLPD) (SEQ ID NO:168) ; ((F/Y/W)) LRRASAPLPGL) (SEQ ID NO:169); ((FA7W)LRRASAPLPGK) (SEQ ID NO:170); ((FA7W)LRRASAPLPDL) (SEQ ID NO: 171); ((F/Y/W)LRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:172); ((F/Y/W)LRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:173); ((F/Y/W)LRRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:174) ; ((F/Y/W)LRRASAPLPGKS) (SEQ 20 ID NO:175); ((FA7W)LRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO: 176); ((F/Y/W)LRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:177); ((FA7W)LRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:178); ((FA7W)LRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO: 179) ;((FA7W)LRRASAPLPDKT) (SEQ ID NO: 180); ((FA7W)WLRRASAPLPG) (SEQ ID NO: 181); ((FA7W)WLRRASAPLPD) (SEQ ID NO: 182) ; ((F/Y/W)WLRRASAPLPGL) (SEQ ID NO: 183) ; ((F/Y/W)WLRRASAPLPGK) (SEQ ID NO: 184); ((F/Y/W)WLRRASAPLPDL) (SEQ ID NO:185) ; ((FA7W)WLRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:186); ((F/Y/W)WLRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO: 187); ((FA7W)WLRRASAPLPGLT) (SEQ IDNO:188) ; ((F/Y/W)WLRRASAPLPGKS)(SEQIDNO:189); ((F/Y/W)WLRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:l卯)；((F/Y/W)WLRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:191) ;((FA7W)WLRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:192); ((F/Y/W)WLRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO: 193); ((F/Y/W)WLRRASAPLPDKT)
14(SEQ ID NO:194); ((FA7W)RRATAPLPG) (SEQ ID NO:195); ((F/Y/W)RRATAPLPD) (SEQIDNO:阔；((FA7W)RRATAPLPGL)(SEQIDNO:197); ((F/Y/W)RRATAPLPGK) (SEQ ID NO: 198); ((F/Y/W)RRATAPLPDL) (SEQ ID NO:199);
((F/Y/W)RRATAPLPDK) (SEQ ID NO:200); ((FA7W)RRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:201); ((FA7W)RRATAPLPGLT) (SEQ ID NO:202);
((FA7W)RRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:203); ((FA7W)RRATAPLPGKT) (SEQ ID NO:204);《FA7W)RRATAPLPDLS) (SEQ ID NO:205);
((FA7W)RRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:206); ((FA7W)RRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:207); ((FA7W)RRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:208);
((F/Y/W)LRRATAPLPG) (SEQ ID NO:209); ((F/Y/W)LRRATAPLPD) (SEQ ID NO:210); ((FA7W)LRRATAPLPGL) (SEQ ID NO:211);
((F/Y/W)LRRATAPLPGK) (SEQ ID NO:212); ((FA7W)LRRATAPLPDL) (SEQ ID NO:213); ((FA7W)LRRATAPLPDK) (SEQ ID NO:214);
((FA7W)LRRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:215); ((F/Y/W)LRRATAPLPGLT) (SEQ ID NO:216); ((F/Y/W)LRRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:217); ((F/Y/W)LRRATAPLPGKT) (SEQID NO:218) ;((F/Y/W)LRRATAPLPDLS)(SEQ ID NO:219); ((F/Y/W)LRRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:220); ((F/Y/W)LRRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:221); ((FA7W)LRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:222); ((FA7W)WLRRATAPLPG) (SEQIDNO:223) ;C(FA7W)WLRRATAPLPD)(SEQ ID NO:224); ((F/Y/W)WLRRATAPLPGL) (SEQ ID NO:225); ((F/Y/W)WLRRATAPLPG K) (SEQ IDNO:226) ;20((FA7W)WLRRATAPLPDL)(SEQIDNO:227); ((FA7W)WLRRATAPLPDK) (SEQ ID NO:228); ((FA7W)WLRRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:229) ; ((FA7W)WLRRATAPLPGLT) (SEQ IDNO:230); ((FA7W)WLRRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:231); ((FA7W)WLRRATAPLPGKT) (SEQ IDNO:232) ; ((FA7W)WLRRATAPLPDLS) (SEQ IDNO:233); ((FA7W)WLRRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:234); ((F/Y/W)WLRRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:235); ((F/Y/W)WLRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:236); ((FA7W)RRAYAPLPG) (SEQIDNO:237) ; ((F/Y/W)RRAYAPLPD)(SEQIDNO:238); ((FA7W)RRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:239); ((F/Y/W)RRAYAPLPGK) (SEQ ID
15NO:240); ((F/Y/W)RRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:241); ((F/Y/W)RRAYAPLPDK) (SEQ ID NO:242); ((F/Y/W)RRAYAPLPGLS) (SEQ ID NO:243); ((F/Y/W)RRAYAPLPGLT) (SEQIDNO:244) ;((F/Y/W)RRAYAPLPGKS)(SEQID NO:245); ((F/Y/W)RRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:246); ((F/Y/W)RRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:247); ((FA7W)RRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:248); ((F/Y/W)RRAYAPLPDKS) (SEQID NO:249) ;((F/Y/W)RRAYAPLPDKT)(SEQID NO:250); ((F/Y/'W)LRRAYAPLPG) (SEQ ID NO:251); ((FA7W)LRRAYAPLPD) (SEQ ID NO:252); ((FA7W)LRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:253); ((F/Y/W)LRRAYAPLPGK) (SEQIDNO:254) ;((FA7W)LRRAYAPLPDL)(SEQID NO:255); ((F/Y/W)LRRAYAPLPDK) (SEQ 5 IDNO:256) ; ((FA7W)LRRAYAPLPGLS) (SEQIDNO:257) ; ((F/Y/W)LRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO:258); ((FA7W)LRRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO:259); ((F/Y/W)LRRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:260); ((F/Y/W)LRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:261); ((FA7W)LRRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:262) ;((F/Y/W)LRRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO:263); ((F/Y/W)LRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO:264); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPG) (SEQ ID NO:265); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPD) (SEQ ID NO:266); ((FA7W)WLRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:267) ;((F/Y/W)WLRRAYAPLPGK) (SEQ ID NO:268); ((FA7W)WLRRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:269); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPDK) (SEQ IDNO:270) ; ((FA7W)WLRRAYAPLPGLS)(SEQIDNO:271); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO:272); ((FA7W)WLRRAYAPLPGKS) (SEQ IDNO:273) ; ((FA7W)WLRRAYAPLPGKT)(SEQIDNO:274); ((FA7W)WLRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:275); C(FA7W)WLRRAYAPLPDLT) (SEQ IDNO:276) ;((FA7W)WLRRAYAPLPDKS)(SEQIDNO:277); 和 ((FA7W)WLRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO:278)，其中(FA7W)是指选自F、 Y和W 的氨基酸残基。本领域的技术人员根据本文所提供的教导将会明悉归属于通式I范 围内的其他特定多肽。
用于本发明方法中的通式I多肽可以多拷贝形式存在以提供更高功效。例如， 多肽可以l、 2、 3、 4或5个拷贝存在。在另一种实施方式中，包含通式I序列的多 肽包括来自X1-A(X2)APLP-X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)区域的不同序 列的组合。在该实施方式中，例如，多肽可由1个拷贝的SEQ ID NO :9和1个拷贝的SEQ ID NO: 143组成。在另 一个不同的实施例中，多肽可由2个拷贝的SEQ ID NO: 200和3个拷贝的SEQ ID NO: 62组成。根据本发明的教导，本领域的技术人员将会 明悉有许多可能的这类组合。
在一个优选实施方式中，依照通式I的多肽还包括一个或多个转导域。本文所 述"转导域"是指能够跨细胞膜转运多肽的氨基酸序列。这些结构域可与其他多肽 结合而带动相连多肽^E争细胞膜移动。在某些情况下转导分子不需要与活性多肽共价 结合。在一个优选实施方式中，转导结构域通过肽键与多肽的其它部位结合。这种 转导域的实施例包括但不限于(R) 4—9 (SEQ ID NO: 279); GRKKRRQRRRPPQ (SEQ IDNO:280); YARAAARQARA
(SEQ ID NO:281); DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEQ ID 10 NO:282) ;GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:283) PLSSIFSRIGDP (SEQ ID NO:284); AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:285); AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO:286); VTVLALGALAGVGVG (SEQ ID NO:287); GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP (SEQ ID NO :288)
GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:289) KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:290); KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID 隐291) ; KAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO:292); KAFAKLAARLYRAAGC (SEQ ID NO:293); AAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO:294); KAFAALAARLYRKAGC (SEQ ID NO:295); KAFAKLAAQLYRKAGC (SEQ ID NO:296) ， GGGGYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:297)和YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:299)。
在另一种实施方式中，多肽包括以下分子式的多肽或由具有以下分子式的多肽 组成
B1-X1-A(X2)APLP-X3-B2 (SEQ ID NO: 318和SEQ ID NO: 319)
其中XI、 X2和X3如上所述，Bl和B2分别不包括或包括上述转导域。 在一个优选实施方式中，Bl和B2之一或二者均包括具有YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 299)和/或YARAAARQARA (SEQ ID NO:281)序列的氨基酸或由其组 成。在一个最为优选的实施方式中，依照本文所披露通式的多肽包括多肽 YGRKKRRQRRRWLRRApSAPLPGLK(SEQIDNO:301) 或
L其中"pS"
17表示磷酸化丝氨酸残基。
在本发明方法的另一种实施方式中，多肽包括具有以下分子式的多肽或由具有 以下分子式的多肽组成
J2-X1-A(X2)APLP-X3-J3 (SEQ ID NO: 320和SEQ ID NO: 321)
其中XI 、 X2和X3如上所述，J2和J3分别不包括或包括上述转导域。 本发明方法所使用的多肽还可被衍生化以提供更长的半衰期，例如通过与聚乙 二醇结合。本发明多肽可包括L-氨基酸、D-氨基酸(在体内具有L-氨基酸特异性蛋 白酶抗性)、D-和L-氨基酸混合物以及各种"带标签的"氨基酸(例如P-曱基氨基 酸、Ca-甲基氨基酸和Na-曱基氨基酸等)以附加特定性质。合成氨基酸包括替代赖 氨酸的鸟氨酸和替代亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。
此外，多肽可含有类肽键(如酯键)而为其带来新型特性。例如，掺入还原性 肽键制备肽，即RrCHrNH-Rz,其中R^和R2是氨基酸残基或序列。还原性肽键可 作为二元肽亚基被引入。这种多肽能够对抗蛋白酶活性，从而在体内具有更长的半 衰期。
术语"多肽"取用其最广泛意义以指代氨基酸亚基序列、氨基酸类似物或类肽。 亚基通过肽键相连，尽管多肽还可包括不需以肽键与多肽结合的部分。例如，如上 所述，多肽还可能包括含有芳香环的非氨基酸分子。
本文所述多肽可以是化学合成的或重组表达的。重组表达可采用本领域的常规 方法获得，主要涉及将导致多肽表达的核酸序列克隆进入表达载体，该载体用于转 染或转化宿主细胞使其提供细胞体系进行多肽表达。这种表达载体可以包括细菌或 病毒表达载体，宿主细胞可以是原核的或真核细胞。
本发明方法使用的多肽优选为化学合成。采用固相、液相或肽缩聚或它们的任 意组合等常用技术制备的合成多肽可包括天然的和非天然氨基酸。用于肽合成的氨 基酸可以是经常规固相操作的常规脱保护、中和、偶联和洗涤步骤处理的标准Boc (Na-氨基被保护的Na-t-叔丁氧羟基)氨基酸树脂，或者碱不稳定的Na-氨基被保 护的9-药曱氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Na-氨基被保护的氨基酸均可从 Sigma、 Cambridge Research Biochemical或其他本领域技术人员熟悉的化学公司购 得。此外，多肽也可采用本领域技术人员熟悉的其他Na-保护性基团合成。
固相肽合成可采用本领域的技术人员熟知的技术进行，例如采用自动合成仪。
本文所述的一种或数种多肽的"有效剂量"是指足以提供预期治疗益处的剂量。应用多肽的有效剂量通常在0.01 pg/kg体重-10 mg/kg体重的范围之间，优选0.05 pg/kg-5mg/kg体重。然而剂量水平还基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、 性别、个体的身体状况、疾病严重程度、给药途径和所应用的特定化合物。因此， 给药方案可能千差万别，但医师能够根标准方法加以确定。
可对多肽进行常规的药学操作，例如灭菌和/或包含常规辅料，如防腐剂、稳定 剂、湿润剂、乳化剂、緩冲液等。
对于给药方式，多肽通常与一种或多种适用指定给药途径的辅料组合。化合物 可与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、 磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷、硫酸葡聚
糖、含肝素凝胶和/或聚乙烯醇混合，制成传统给药的片剂或胶嚢剂。可选地，本发 明化合物可溶于盐水、水、聚乙烯醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉 米油、花生油、棉籽油、芝麻油、西黄蓍胶和/或各种缓冲液。其他辅料和给药方式 均是药学领域所熟知的。载体或稀释剂可包括延时材料，例如单独的单硬脂酸甘油 酯或二硬脂酸甘油酯，单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯与蜡的混合物，或者本领 域所熟知的其他材料。
多肽或它的药学组合物可以含有常规药学可接受的载体、辅料和赋形剂的单位 剂量剂型通过任何适当的途径给药，包括经口、经胃肠道外、喷雾吸入、经直肠或 局部给药。本文所用术语经胃肠道外包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、 腱内、推内、颅内、胸腔内注射技术或腹腔内给药。给药的优选实施方式根据治疗 情况而定。在一个优选实施方式中，多肽或药学组合物被置于伤口敷料或其他局部 用药之上或之内。该伤口敷料可以是本领域内所使用的任何形式，包括但不限于薄 膜(如聚氨酯薄膜)、水胶体(结合于聚氨酯薄膜的亲水性胶粒)、水凝胶(含水至 少60%的交联聚合物)、泡沫剂(亲水的或疏水的)、藻酸钩(藻酸钧纤维的非织造 复合物)、玻璃纸和生物聚合物，例如2003年10月9日公开的美国专利申请公开号 第20030190364号所述的生物聚合物。
多肽可制备为固体形式(包括颗粒、粉末或栓剂)或液体形式(如溶液、混悬 液或乳液)。本发明多肽可应用于多种溶液。根据本发明适合采用的溶液是无菌的、 能溶解一定数量多肽并对计划用药无害的溶液。
实施例1
19疤痕疙瘩和增殖性瘢痕是纤维化增生致异常愈合的疾病，其特征是由于细胞外 基质的过度产生、沉积和收缩而引起过度瘢痕化，从而导致功能性和美容性缺陷
(Leask和Abraham, 2004)。目前对于这类病症尚无有效治疗手l殳。
有三种哺乳动物亚型，分别是TGF-pl、 TGF-(32和TGF-(33。 TGF-p是具有多重功能 的分子，其作用取决于细胞环境和各同工型表达平衡状态。TGF-pl被认为涉及启动 纤维化的应答，而TGF-|33则可能具有抗纤维化功能(Leask和Abraham, 2004， Miller和Nanchahal, 2005)。
在成纤维细胞中TGF-p促进结締组织生长因子(CTGF)的表达。CTGF是富含 半胱氨酸的多肽，它作为TGF-(3下游调节因子发挥作用，促进成纤维细胞增殖、细 胞外基质产生(包括胶原和纤维蛋白连接素)和肉芽组织形成(Duncan等人，1999, Leask和Abraham, 2004 )。组织损伤所释放的其他化合物，例如凝血酶和内皮素也可 上调CTGF表达(Chambers等人，2000 , Shi-Wen等人，2004 , Rodriguez-Vita等人， 2005 )，提示细胞-基质-细胞因子相互作用的复杂网络调节着创伤愈合过程的起始以 及病理性纤维化疾病(Duncan等人，1999)。由于CTGF在痣痕疙疼和增殖性瘢痕 中的过表达增强了 TGF-(3促纤维化的应答，因此CTGF被认为参与了瘢痕纤维化的 发病机制(Colwell等人，2004 )。因此，可以想象阻断CTGF表达可能会通过防止结 締组织细胞增殖和基质沉积而减轻病理性瘢痕形成的纤维化增殖性应答。
除了细胞因子和蛋白酶，对细胞结构的调节也会影响CTGF表达。因此，破坏 微管、活化RhoA和稳定肌动蛋白纤维的药物被证明促进CTGF在肾成纤维细胞中 的表达，而使肌动蛋白解聚的药物(如红海海绵素)则减少了 CTGF的表达(Ott 等人,2003 )。
最近有研究证明，P20肽( 一种热休克蛋白20的磷酸肽类似物)与被称作蛋白 质转导域(PTD)的肽载体结合能穿透进入细胞并抑制由血清或溶血磷脂酸激发的 应力纤维形成(Dreiza等人，2004)。这个结果令我们猜测P20肽引起的细胞骨架断 裂抑制了 CTGF合成，可能会抑制纤维化增生病症。为验证该假设，我们研究了 PTD-P20肽处理是否会减少CTGF和胶原在TGF-p刺激的疤痕疙瘩成纤维细胞中的 表达。
方法
成纤维细胞培养:人疤痕疙瘩成纤维细胞置10 cn^培养脏中，于37。C和10% C02下在含10% FBS和青霉素与链霉素(1% )的DMEM中生长至细胞汇合达70%。实 验前细胞在含0.5% FBS的DMEM中进行血清饥饿培养48h。开始测定时向培养皿 中加入新鲜培养液，细胞不经处理(对照)或用TGF-pl(剂量范围0.6-5 ng/mL)、 p20磷酸肽(剂量范围50-200 mM)、福斯高林(forskolin) (fsk， 10 )或snap (500 mM)处理24h。为验证血清饥饿的影响，还将部分细胞生长于含10% FBS 培养液(高血清对照)进行实验。
Western blot分析实-验结束后，细胞用PBS冲洗，再采用UDC緩冲液匀浆。 混合细胞裂解液，离心(6000 x g)20 min,上清用于CTGF和胶原表达检测。样品(20 吗蛋白质)上样15 %或10% SDS-PAGE胶，蛋白质被电泳转移至Immobilon转印 膜。为阻断非特异性结合，将膜在l: 1 (v/v) Tris緩冲盐溶液(TBS):封闭緩沖液 (Odyssey)中孵育，用抗CTGF ( Torrey Pines )和抗胶原(Cortex) —抗室温着染 1 h， TBS洗涤3遍。接着将膜置于抗兔和抗小鼠二抗中孵育，用含吐温的TBS洗涤。 蛋白-抗体复合物采用Odyssey直接红外荧光显像系统(Li-Cor, Lincoln , NE)显影。
免疫细胞化学:人疤痕疙瘩成纤维细胞以2.5 x 105细胞/孔在带盖玻片的6孔板中 生长。细胞经血清饥饿24 h,再用刺激物处理。未处理细胞(对照)或用TGF-pl (1.2或2.5 ng/mL )和/或P20磷酸肽(50 )处理的细胞经4%多聚曱醛固定，用 0.1 % Triton X进行透化处理。接着用Alexa 350鬼笔环肽对细胞染色显影肌动蛋白丝。 采用带UV滤镜和Zeiss软件的Zeiss显微镜获得荧光影像。
统计学分析所有数值结果均以从3-6个实验所得的平均值士标准差表示。采用 Tukkey post-hoc检验后用ANOVA与实验组比较。显著性差异水平设定为< 0.05。
结果
TGF-pi与CTGF表达人悉痕疾瘪成纤维细胞在含0.5 % FBS的DMEM培养 基中血清饥饿培养48小时，用不同剂量的TGF-pl处理24小时。CTGF表达的western blot密度测定结果参照GAPDH表达以校正上样误差。为比较各点将对照细胞的 CTGF表达设定为1。结果表明TGF-pl处理24 h呈剂量依赖性地增加人疤痕疾瘩成 纤维细胞中的CTGF表达(2.1-4.6倍)。
P20处理与CTGF表达人^痕疙瘩成纤维细胞在含0.5 % FBS的DMEM培养 基中血清々几饿培养48小时，用剂量范围在1.2-5 ng/mL的TGF-pl刺激24小时，并 同时用P20磷酸肽(50、 100或200 )处理24小时。Western blot条带采用密度 测定法定量，CTGF表达参照GAPDH表达以校正上样误差。为比较各点将对照细胞的CTGF表达设定为1。结果显示PTD-P20处理可显著(P < 0 . 05)减少症痕疙瘩成 纤维细胞中TGF-(31诱导的CTGF表达。观察到1.2和2.5 ng/mL TGF-pi的下降幅度 分别是53 %和29 % 。另 一方面，当采用5 ng/mL TGF-(31刺激细胞时，PTD-P20处 理即使在高剂量(100和200 )时也而没有减少CTGF表达。
P20处理与胶原产生在观察到PTD-P20处理减少了细胞经1.2和2.5ng/mL TGF- P 1刺激的CTGF表达之后，我们下一步研究了胶原合成是否也被减少。人疤 痕疙疼成纤维细胞在含0.5 %FBS的DMEM培养基中血清饥饿培养48小时，用剂 量范围在1.2-2.5 ng/mL的TGF-(31刺激24小时，并同时用P20磷酸肽(50 ^M) 处理24小时。Western blot条带采用密度测定法定量，胶原表达参照GAPDH表达 以校正上样误差。为比较各点将对照细胞的胶原表达设定为1。结果表明PTD-P20 处理减少胶原合成约48%。
采用升高cAMP和cGMP的化合物处理下一步我们评测了升高cAMP (Forskolin, FSK)或cGMP (SNAP)的化合物对痣痕疙瘪成纤维细胞中CTGF表达的 影响。人疤痕疙瘩成纤维细胞在含0.5 %FBS的DMEM培养基中血清饥饿培养48 小时，用2.5 ng/mL剂量的TGF-pl刺激并同时用FSK( 10 pM )处理24小时。Western blot条带采用密度测定法定量，CTGF表达参照GAPDH表达以校正上样误差。为 比较各点将对照细胞的CTGF表达设定为1。 TGF- p l( TGF- (3 1剂量为2.5 ng/mL ) 刺激的成纤维细胞经FSK处理其CTGF表达减少约50%。用FSK处理的未刺激成 纤维细胞与未处理细胞相比，其CTGF表达无差别。另一方面，SNAP处理没有减 少TGF- P 1刺激细胞的CTGF表达。此外，用SNAP处理的未刺激成纤维细胞与 未处理(对照)细胞相比，其CTGF表达显著增加(p < 0.05,增加2倍)。这些结 果与先前的报道一致(Duncan等人，1 999 ),表明对CTGF表达的抑制性作用对升 高cAMP药物是具有选择性的。而且，近期研究表明将痣痕疙瘩成纤维细胞经外源 性一氧化氮处理会剂量依赖性地增加胶原表达(Hsu等人,2006 )。
PTD-P20处理对细胞肌动蛋白细胞骨架的影响人痣痕疙瘩成纤维细胞在含0.5 %FBS的DMEM培养基中血清饥饿培养48小时，用TGF-卩1 ( 1.2或5 ng/mL )和 /或p20 ( 50 mM )刺激24小时。接着用鬼笔环肽对细胞染色以评价ptd-p20处理 对肌动蛋白细胞骨架的影响。PTD-P20处理导致未刺激细胞和经1.2 ng/mL TGF-Pl刺激细胞出现星形细胞形态以及肌动蛋白细胞骨架断裂。当TGF-pl剂量为 2.5 ng/mL时该作用并不明显。总结
迄今为止对疤痕疙瘩和其他纤维化疾病尚无有效治疗手段。目前正处于研究阶
^险的治疗法绝大多数将目标锁定在TGF- (3信号级联通路中的细胞表面受体或酶。 本文所提供的方法因其提出了经我们团队鉴定的激酶级联下游蛋白质的治疗性应 用而具有创新性。本文提供的结果表明PTD-P20可降低TGF- P 1诱导的CTGF表 达(与FSK相当的水平)并减少相关胶原合成。PTD-P20的作用涉及细胞形态学 改变(星状形态和应力纤维断裂)。由于肌动蛋白细胞骨架在CTGF表达时应保持 完好，因此我们推断PTD-P20改变细胞骨架动力学的能力对于降低疤痕疙瘩成纤 维细胞中的CTGF水平具有重要意义。因为CTGF在纤维化反应的发展和维持过程 中发挥关键作用，因此使用PTD-P20代表了一种治疗疤痕疙瘩和其他纤维化疾病 的有潜力的策略。
实施例1的参考文献
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实施例2
成纤维细胞被普遍认为是纤维化、创伤愈合和组织修复过程中的关键细胞类 型。少部分观点还将成纤维细胞转化为成肌纤维细胞看作是细胞发挥上述功能的关 键甚至可能是必须事件(Powell等人，1999和Tomasek等人,2002 )。成肌纤维细胞 是平滑肌样成纤维细胞，它表达a平滑肌肌动蛋白(a-SMA)并含有由肌动蛋白丝 和相关蛋白整合而成的显著的应力纤维组成的收缩性结构(Tomasek等人，2002 )。 除了在维持组织稳态和修复中的正常作用而外，成肌纤维细胞的数量和功能发生改变与细胞外基质(ECM)沉积增多而致纤维化的疾病有关，例如涉及肺(肺纤维
化)、血管(内膜增生)、心脏(心脏纤维化)和皮肤(疤痕疙瘩)的疾病(Desmouliere 等人，2003, Desmouliere等人，2005， Hewitson等人，1995, Mitchell等人，1989, Zhang 等人，1994, Naugle等人，2006, Chipev等人，2000, Pepper等人，1997, Heusinger-Ribeiro等人,2001 )。因此抑制成纤维细胞至成肌纤维细胞的表型调变可 能为抑制由诸如TGF P 1和其他调节因子等刺激因子引发的纤维化提供一种方法。
最近有研究证明，P20肽( 一种热休克蛋白20的磷酸肽类似物)与被称作蛋白 质转导域(PTD)的肽载体结合能穿透进入细胞并抑制由血清或溶血磷脂酸激发的 应力纤维形成(Dreiza等人，2004)。正如以上所讨论的，该PTD-P20肽还能抑制 人疤痕疾瘩成纤维细胞中由TGF p 1诱导的CTGF表达。在这些实验中，为进一步 检测PTD-P20的抗纤维化活性，还测定了它对其他纤维化分子的作用ot-SMA和 肌动蛋白辅助蛋白丝切蛋白和HSP27。丝切蛋白在去磷酸化时被活化而使肌动蛋白 丝解聚，而HSP27则在磷酸化时被活化并与应力纤维形成相关。因此纤维化表型 会与丝切蛋白和HSP27的磷酸化增加有关。这些结果表明PTD-P20可抑制TGF P 1诱导的a-SMA表达和丝切蛋白和HSP27磷酸化。这类信息增加了对PTD-P20作 用机制的认识，并且鉴别出可能用于检测PTD-P20活性或纤维化疾病状态的有潜 力的生物标志物。
方法
成纤维细胞培养:人疤痕疙瘩成纤维细胞置10 cr^培养亚中，于37。C和10% C02 下在含10% FBS和青霉素与链霉素(1% )的DMEM中生长至细胞汇合达70%。实 验前细胞在含0.5% FBS的DMEM中进行血清饥饿培养48h。开始测定时，向培养 皿中加入新鲜培养液，细胞不经处理(对照)或用TGF-(31(剂量范围0.6-5 ng/mL)、 P20磷酸肽(剂量范围50-200 ^M)、福斯高林(FSK, 10 )或SNAP ( 500 ) 处理24h。为验证血清饥饿的影响，还将部分细胞生长于含10% FBS培养液(高血 清对照)进行实验。
Western blot分析实验结束后，细胞用PBS冲洗，再采用UDC緩冲液匀浆。 混合细胞裂解液，离心(6000xg) 20 min,上清用于蛋白表达检测。样品(20吗蛋 白质)上样15 %或10% SDS-PAGE胶，蛋白质被电泳转移至Immobilon转印膜。为 阻断非特异性结合，将膜在1: 1 (v/v )Tris緩冲盐溶液(TBS ):封闭緩冲液(Odyssey ) 中孵育，用抗a平滑肌肌动蛋白表达、磷酸化HSP27和磷酸化丝切蛋白 一抗室温着染l h, TBS洗涤3遍。接着将膜置于抗兔和抗小鼠二抗中孵育，用含吐温的TBS 洗涤。蛋白-抗体复合物采用Odyssey直接红外荧光显像系统(Li-Cor， Lincoln, NE )显影。
统计学分析所有数值结果均以从3-6个实验所得的平均值土标准差表示。采用 Tukkey post-hoc检验后用ANOVA与实验组比较。显著性差异水平设定为p < 0.05。
结果
P20处理与a平滑肌肌动蛋白表达人悉痕疙瘩成纤维细胞在含0.5%FBS的 DMEM培养基中血清饥饿培养48小时，用含有或不含TGF-pi (2.5 ng/mL )的 PTD-P20 ( 50^M)处理24小时。采用Western blot密度测定法对a-SMA和P肌动 蛋白的表达水平进行定量并用GAPDH表达标准化以校正上样误差。为比较各点将 对照细胞的蛋白表达设定为1。结果显示无论是否含有TGF(3 1， PTD-P20处理均显 著(P〈 0.05 )减少了疤痕疙瘩成纤维细胞的a-SMA表达(
图1 )。而另 一方面，PTD-P20 对I3肌动蛋白表达无影响，提示其活性a-SMA具有特异性，其是纤维化的关键标志 物。
P20处理与HSP27和丝切蛋白磷酸化人痣痕疙瘩成纤维细胞在含0.5%FBS 的DMEM培养基中血清饥饿培养48小时，用含有或不含TGF-(31 (2.5 ng/mL)的 PTD-P20 (50pM)处理24小时。采用Western blot密度测定法对磷酸化丝切蛋白和 HSP27的表达水平进行定量并用GAPDH表达标准化以校正上样误差。为比较各点 将对照细胞的蛋白表达设定为1。结果表明PTD-P20处理显著(P < 0.05 )减少了疤 痕疙瘩成纤维细胞中TGF P 1诱导的丝切蛋白和HSP27磷酸化增加。而丝切蛋白和 HSP27的总水平(磷酸化加非磷酸化)无变化。这些结果提示PTD-P20从影响肌动 蛋白细胞骨架的多个水平上抑制TGF P 1的纤维化反应。
总结
本文提供的结果的表明PTD-P20降低了 TGF p 1诱导的a-SMA表达并减少了 丝切蛋白和HSP27磷酸化。早期结果还显示PTD-P20处理与细胞形态学改变相关 (星形形态和应力纤维断裂)并可抑制CTGF表达。由于肌动蛋白细胞骨架的完整 性对于CTGF表达非常重要，因此这些结果提示PTD-P20通过改变细胞骨架动力 学而抑制纤维化反应。因为肌动蛋白细胞骨架在纤维化反应的发展和维持过程中发 挥关键:作用，因此使用PTD-P20代表了一种治疗疤痕疙瘩和其他纤维化疾病的有潜力的策略。总而言之，这些结果也鉴别出了可以用于检测PTD-P20活性或纤维
化疾病状态的有潜力的生物标志物(CTGF、 a-SMA、丝切蛋白和HSP27)。
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Zhang et al. (1994) Am J Pathol 145, 114-12权利要求
1. 一种治疗和/或限制纤维化疾病的方法，该方法包括向有需要的个体给予有效剂量的治疗和/或抑制纤维化疾病的的多肽，所述多肽包含根据通式I的序列X1-A(X2)APLP-X3其中X1是位于序列SEQ ID NO298氨基酸残基1和14之间的热休克蛋白20序列的0-14位氨基酸；X2选自由S、T、Y、D、E、羟赖氨酸、羟脯氨酸、磷酸丝氨酸类似物和磷酸酪氨酸类似物组成的组；以及X3选自由下列组成的组(a)序列SEQ ID NO298的氨基酸残基21至160的0-140位氨基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3类型序列的0、1、2或3位氨基酸，其中Z1选自由G和D组成的组；Z2选自由L和K组成的组；以及Z3选自由S、T和K组成的组。
2. —种治疗和/或抑制瘢痕的方法，该瘢痕选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成 的组，该方法包括向有需要的个体给予有效剂量的治疗和/或抑制选自由疤痕疙瘩和 增殖性瘢痕组成的组的瘢痕的的多肽，所述多肽包含通式I的序列X1-A(X2)APLP隱X3其中XI是位于序列SEQ ID NO: 298氨基酸残基1和14之间的热休克蛋白20 的0-14位氨基酸；X2选自由S、 T、 Y、 D、 E、羟赖氨酸、羟脯氨酸、磷酸丝氨酸类似物和磷酸 酪氨酸类似物组成的组；以及X3选自由下列组成的组(a )SEQ ID NO: 298的氨基酸残基21至160的0-140 位氨基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3类型序列的0、 1、 2或3位氨基酸，其中Z1选自群 组包4舌G和D组成的组；Z2选自由L和K组成的组；以及Z3选自由S、 T和K组成的组。
3. 如权利要求1或2的方法，其中XI是WLRR ( SEQ ID NO : 1 )。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中X3是GLK。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中XI是位于序列SEQIDNO: 298氨基酸残基1和14之间的热休克蛋白20序列的0-14位氨基酸。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中多肽包括WLRRASAPLPGLK (SEQ ID NO : 300 ),其中S氨基酸残基是磷酸化的。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中多肽还包括共价结合的转导域。
8. 如权利要求7的方法，其中转导域包括选自由YARAAARQARA (SEQ ID NO : 281 )和YGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO : 299 )组成的组的多肽。
9. 如*1利要求2-8中任一项所述的方法，其中该方法是用于限制选自由疤痕疙 瘩和肥厚性瘢痕组成的组的瘢痕，并且其中有需要的个体是亚洲人或非洲人的后裔。
10. 如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中该方法是用于治疗或限制纤维化 疾病，并且有需要的个体正在遭受一种或多种下列疾病或者对其具有高患病风险 糖尿病性肾病变、肾小球硬化症、IgA肾病、糖尿病视网膜病、黄斑变性、肝硬化、 胆道闭锁、充血性心力衰竭、硬皮病和腹腔粘连。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中有需要个体的靶组织中一个或 多个下列生物标志物的水平有所升高TGFpl表达物； TGF卩2表达物； CTGF表达物； 磷酸化丝切蛋白； 磷酸化HSP27;以及 a平滑肌肌动蛋白表达物。
12. 如权利要求1-10中任一项所述的方法，还包括通过测定启用方法后靶组织 中 一个或多个下列生物标志物的水平以监测本发明方法治疗有效性的方法TGF|31表达物；TGF卩2表达物；CTGF表达物；磷酸化丝切蛋白；磷酸化HSP27;和a平滑肌肌动蛋白表达物。
全文摘要
本发明提供了治疗和/或抑制纤维化疾病和/或治疗或抑制选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕的方法，该方法包括向有需要的个体给予有效剂量的治疗和/或抑制选自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕组成的组的瘢痕的多肽，所述多肽包含HSP20相关多肽。
文档编号A61K38/00GK101489572SQ200780026130
公开日2009年7月22日 申请日期2007年7月10日 优先权日2006年7月12日
发明者伊丽莎白·J·弗尼士, 帕米尼·科马拉维拉斯, 查尔斯·罗伯特·弗林, 科林·M·布罗菲, 艾丽莎·帕尼什, 露茜安娜·比亚吉尼·洛佩斯 申请人:亚利桑那州董事会代表的亚利桑那州大学