炎性疾病的预防或治疗药的制作方法

专利名称：炎性疾病的预防或治疗药的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有NR10拮抗剂作为有效成分的、新型炎性疾病的预 防或治疗药。本发明还涉及使用NR10拮抗剂的预防或治疗炎性疾病的 方法。
背景技术：
作为参与各种细胞的增殖分化或分化成熟的细胞的功能赋活化 的液性因子，已知存在多种细胞因子。在机体内受到细胞因子刺激的 细胞产生另外的细胞因子，由多个细胞因子形成网络。机体恒常性是 通过该网络的相互调节而保持着微妙的平衡。有人认为多种免疫炎性 疾病是由这些细胞因子网络的破坏而引起的，基于单克隆抗体的抗细 胞因子疗法备受关注。例如，抗TNF抗体和抗IL-6受体抗体在临床上 显示出较好的效果。但另一方面，在实际病态中由于补偿经路发挥作 用，仅靠阻断IL-4等一种细胞因子还无法取得治疗效果，失败的例子 颇多。
本发明人等成功分离了与IL-6的信号传递受体gpl30同源性高的 新型细胞因子受体NR10(专利文献1)。 NR10与制癌蛋白M受体(OSMR) 形成异源二聚体，发挥IL-31受体的作用(非专利文献1)。 Zymogenetics 社报道了过量表达IL-31的转基因小鼠自然发生搔痒性皮炎(专利文献 2)。
但还不能断言小鼠中细胞因子的强制表达或病态小鼠血中的高 细胞因子浓度是实际的病因。利用抗体阻断信号时是否取得治疗效果 还完全不清楚。例如，使IL-18在角质形成细胞中过量表达的转基因小鼠发生搔痒性皮炎。另外，特应性皮炎自然发病模型NC/Nga小鼠的血 中IL-18浓度随病态的发展而升高。基于上述发现，推测IL-18的过量 表达是致病原因。但实际中尚未确认到给予中和抗体所产生的治疗效 果(非专利文献2)。
如上所述，在细胞因子的表达上升的疾病中，即使阻碍其细胞因 子的功能也未必能得到治疗效果，根据细胞因子的表达量难以推测实 际中取得治疗效果的疾病。因此，发现通过阻碍靶细胞因子的信号传 递而在实际中取得治疗效果的疾病至关重要。
本发明的先行技术文献如下所示。 专利文献l: WO00/75314 专利文献2: WO03/060090
非专利文献1 : IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis (IL-31与特应性皮炎患者中的皮肤淋巴细胞抗原阳性皮肤归巢T细胞 有关)，J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25 非专利文献2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga (给予抗白介素18抗体不能抑制特应性皮炎模型小鼠NC/Nga中皮炎的 发展)，British Journal of Dermatology 149: 39-45, 200
发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述背景而设，本发明的课题在于提供使用细胞因子 受体拮抗剂来治疗炎性疾病的抗细胞因子疗法。更具体而言，本发明
的课题在于发现使用抗NR10中和抗体可取得治疗效果的炎性疾病，提 供针对这些疾病的新型治疗方法。本发明的另 一课题在于提供可临床 应用于人的抗人NRl 0中和抗体。 解决课题的方法本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。本发明人等以各
种病态模型小鼠为对象，尝试了评价抗小鼠NR10中和抗体的药效。结 果表明，在使用NC/Nga小鼠的特应性皮炎模型小鼠和反复涂布苦基氯 而产生的慢性皮炎模型小鼠中，上述中和抗体显示出显著的症状抑制 效果，明确中和抗体在实际中可以用作治疗药。另外，在风湿症;fi型一 胶原关节炎和变形性关节症模型 一胶原酶关节炎中也确认到了抑制 症状的效果。上述结果表明本申请的NR10中和抗体可用于慢性炎症 的预防或治疗。
并且，本发明人等还成功获得了人NR10中和抗体。即，本发明提 供下述[1]~[17]。 [l]所述的预防或治疗药，其中NR10拮抗剂为具有NR10中和活性 的抗体。 [2]所述的预防或治疗药，其中抗体为单克隆抗体。 [2]所述的预防或治疗药，其中抗体为具有人NRIO中和活性的单
克隆抗体。 [2] [4]中任一项所述的预防或治疗药，其中抗体为重组抗体。 [5]所述的预防或治疗药，其中重组抗体为嵌合抗体、人源化抗体
或人抗体。[2] 问中任一项所述的预防或治疗药，其含有具NRIO中和活性的 抗体的片段和/或其修饰物作为有效成分。 [1] [7]中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病为特应性皮 炎。 [1] [7]中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病为慢性皮炎。 [10] [1] [7]中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病为风湿症。 [11] [1] [7]中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病为变形性关 节症。抗体，该抗体具有NRIO中和活性。[13] [12]所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。 [12]所述的抗体，其中NR10为人NRIO。 [12] [14]中任一项所述的抗体，该抗体为重组抗体。 [15]所述的抗体，其中重组抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。 [12] [16]中任一项所述的抗体的片段和/或其修饰物。预防或治疗炎性疾病的方法，该方法包括对患有炎性疾病的患者
给予NR10拮抗剂的步骤。 NR10拮抗剂在制造用于预防或治疗炎性疾病的药物中的应用。附图简述


图1是显示向IL-31依赖性Ba/F3细胞增殖测定系统中添加BM095时，观察BM095的细胞增殖抑制效果的结果图。横轴表示测定系统中mlL-31的推定浓度，纵轴(OD450 (450 nm的吸光度))表示细胞量。凡例显示BM095添加量(单位ng/mL)。观察到细胞增殖抑制效果依赖于BM095的添加量。
图2是显示对特应性皮炎模型'J 、鼠给予抗NR10抗体时的治疗效果图。与阴性对照组(溶剂对照组(vehicle))相比，抗NR10抗体给药组中确认到显著的炎症抑制效果。
图3是显示对特应性皮炎模型小鼠给予抗NR10抗体时体重随时间变化的图。尽管在现有抗炎药给药组中观察到体重减少，但抗NRIO给药组没有出现体重变化，抗NR10抗体的安全性得到确认。
图4是显示对慢性皮炎模型小鼠给予抗NR10抗体时的治疗效果图。在抗NR10抗体给药组中确认到显著的耳廓肿胀抑制效果。
图5是显示慢性皮炎模型小鼠耳廓的免疫组织染色的照片。与人一样，在肥厚的表皮中观察到小鼠NR10的表达亢进。
图6是显示对胶原诱导性关节炎模型小鼠给予抗NR10抗体时抑制关节炎发病的效果图。
7图7是显示胶原酶诱导性关节炎(变形性关节症)模型中BM095的给药浓度与AUC的关系图。其中以左右膝关节的宽度差作为表示右膝关节的胂胀的值，AUC意思是指上述宽度差的推移的曲线下面积。
图8是表示在IL-31存在下人NR10中和抗体(纯化抗体)的浓度与细胞增殖抑制活性的相关图。抗体l、抗体2、抗体3显示出高的NR10中和活性。
细胞增殖抑制活性的相关图。NA633显示出高的NR10中和活性。
图lO是比较食蟹猴(cynomol) NR10与人NR10的氨基酸序列的图。
带有双重下划线的序列表示跨膜结构域。
图11是显示嵌合NA633抗体在人IL-31刺激食蟹猴NR10/人
OSMR/BaF细胞林中的细胞增殖抑制活性的图。NA633对食蟹猴NR10
也显示出中和活性。
图12是显示DSS大肠炎模型小鼠的体重变化率的推移图。图13是显示急性苦基氯接触性皮炎模型的耳廓厚度变化的推移图。
实施发明的最佳方式
治疗药。本发明基于本发明人等的发现，即MIIO拮抗剂(例如抗NRIO中和抗体)在患有特应性皮炎、慢性皮炎、风湿症、变形性关节症等的
模型小鼠中显著抑制其症状。
NR10是一种与制癌蛋白M受体(OSMR)形成异源二聚体并发挥IL-31受体作用的蛋白质。NR10还以glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6,2002)、 GPL (J Biol Chem 278, 49850-9， 2003)、 IL-3 IRA (Nat Immunol 5,752-60, 2004)等名称而为人所知，本发明的NR10还包括以上述名称称呼的蛋白质。另外，本发明的NR10还包括来源于人、小鼠或其它哺乳动物的NRIO,虽然没有特别限定，但优选的NR10的例子有来源于
8人或小鼠的NRIO。作为来源于人的NRIO,已知有多种剪接变异体(WO00/075314)。上述剪接变异体中，MU0.1的特征在于包含662个氨基酸且具有跨膜结构域。而NR10.2是包含252个氨基酸且不具有跨膜结构域的可溶性受体样蛋白质。另一方面，发挥跨膜型受体蛋白功能的NR10剪接变异体已知有NR10.3和IL-31RAv3。本发明中的人NRIO只要是与制癌蛋白M受体(OSMR)形成异源二聚体并发挥IL-31受体功能的蛋白质即可，没有特别限定，但优选的NR10的例子有NR10.3 (也称作ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60， 2004))和IL-31RAv3。 NR10.3(IL-31RAv4)包含662个氨基酸(W000/075314, Nat Immunol 5, 752-60，2004),而IL-31RAv3包含732个氨基酸(GenBank检索号NMJ39017)。IL-31RAv4的氨基酸序列见SEQ ID No:6， IL-31RAv3的氨基酸序列见SEQIDNo:7。另一方面，来源于小鼠的NR10的例子有包含SEQ IDNo:5中记载的氨基酸序列的蛋白质。
在本发明中，NR10拮抗剂是指通过与NR10结合，阻断基于NR10活化的细胞内信号传递，使细胞的生理活性丧失或受到抑制的物质。其中，生理活性的例子有生理活性物质(例如趋化因子、炎性细胞因子等)的产生诱导活性、产生抑制活性、分泌促进活性、分泌抑制活性、增殖活性、增殖诱导活性、存活活性、分化活性、分化诱导活性、转录活性、膜转运活性、结合活性、蛋白酶解活性、磷酸化/脱磷酸化活性、氧化还原活性、转移活性、溶核活性、脱水活性、诱导细胞死亡的活性、诱导凋亡的活性等，但并不限于这些。
判定是否具有拮抗活性可以利用本领域技术人员所公知的方法来进行。例如只要在配体的存在下使受试化合物与在细胞表面上表达的NR10接触，判定是否产生作为NR10的活化指标的细胞内信号传递即可。上述判定例如可以按照文献"Dillon SR等，Interleukin 31, acytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice G舌4匕T细胞产生的细胞因子一白介素31诱发小鼠皮炎).Nat Immunol. 2004Jul; 5(7): 752-60"中记载的方法进行。认为阻碍应答配体刺激的细胞内信号传递的化合物是NR10的拮抗剂。
明中的拮抗剂可以使用公知的物质。还可以使用经上述方法判定为具 有拮抗活性的新型化合物。
作为本发明中的NR10拮抗剂的一种形式，可以列举出具有NRIO 中和活性的抗体。本发明中"具有NR10中和活性的抗体"是指具有抑制 基于NR10的生理活性的作用的抗体。本发明中"具有NR10中和活性的 抗体，，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，但优选的形式为单克隆 抗体。
具有NR10中和活性的单克隆抗体可如下得到以来源于人或小鼠 等哺乳动物的NR10或其片段肽作为免疫原，按照公知方法制备抗 NR10单克隆抗体，之后从所得抗NR10单克隆抗体中筛选具有NR10中 和活性的抗体，即可得到。即，使用所需抗原或表达所需抗原的细胞 作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫。利用通常的细胞 融合法使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，再利用通常的筛选方 法筛选单克隆抗体产生细胞(杂交瘤)，从而可以制作抗NR10单克隆抗 体。被免疫的动物例如可以使用小鼠、大鼠、兔、绵羊、猴、山羊、 驴、牛、马、猪等哺乳动物。制备抗原时，可以使用公知NR10基因序 列，按照公知方法、例如使用杆状病毒的方法(W098/46777等)等来进 行。筛选具有NR10中和活性的抗体时，如下所述，例如在实施例中利 用在IL-31依赖性细胞抹中添加候选抗体时观察该IL-31依赖性细胞林 的增殖抑制效果的方法，可以判定该抗体是否为具有NR10中和活性的 抗体。上述方法中，认为抑制IL-31依赖性细胞抹增殖的抗体为具有 NH10中和活性的抗体。
杂交瘤的制作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler, G.和 Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等来进行。当抗原的免 疫原性低时，使抗原与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合可以进 行免疫。
10本发明的具有NR10中和活性的抗体的优选形式的例子有具有人 NR10中和活性的单克隆抗体。作为用于制作具有人NR10中和活性的 单克隆抗体的免疫原，只要可以制作具有人NR10中和活性的抗体即 可，没有特别限定。例如，已知人NR10中存在多种变异体，但只要可 以制作具有人NR10中和活性的抗体，可以以任一种变异体作为免疫 原。或者在相同条件下，可以以NR10的片段肽或在天然的NR10序列 中导入了人为突变而得到的序列作为免疫原。人NR10.3在制作本发明 的具有NR10中和活性的抗体方面是优选的免疫原之一。
其中，本发明的上述抗体只要是具有NR 10中和活性的抗体即可， 没有特别限定，还包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等重组抗体。 嵌合抗体是指包含除人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的 可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体。嵌合抗体可以利用已 知的方法来制造。例如，由杂交瘤克隆抗体基因，并插入适当的载体 中，再将其导入宿主中，即可制造嵌合抗体(例如参照Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具体而言，使用逆转录酶由杂交瘤的mRNA 合成抗体可变区(V区)的cDNA。当得到编码目标抗体V区的DNA时， 将其与编码所需人抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其插入表达栽体 中。或者可以将编码抗体V区的DNA插入包括人抗体C区的DNA的表 达载体中。为了在表达调节区例如增强子、启动子的调节下进行表达， 将DNA插入表达载体中。接下来，可以利用该表达载体转化宿主细胞， 使嵌合抗体表达。
人源化抗体也称重构(reshaped)人抗体，是指将除人以外的哺乳动 物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR; complementarity determining region)移植到人抗体的互补性决定区而得到的抗体，其通常的基因重 组方法也已知。具体而言，利用PCR法由制作成末端部具有重叠部分 的多个寡核苷酸合成DNA序列，上述DNA序列设计成连接小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(framework region; FR)。人源化抗体可如 下得到连接所得DNA与编码人抗体恒定区的DNA,然后插入表达
号EP239400、国际专利申请公开号WO96/02576)。经由CDR连接的 人抗体的FR，篩选互补性决定区形成良好的抗原结合部位的FR。根 据需要，可以取代抗体可变区的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互 补性决定区形成适当的抗原结合部位(Sato, K.等，Cancer Res. (1993) 53,851-856)。
另外，获得人抗体的方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原 或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤 细胞例如U266融合，也可以得到具有抗原结合活性的所需人抗体(参 照日本特公平1-59878)。另外，还可以通过用所需抗原对具有完全人 抗体基因库的转基因动物进行免疫而获得所需人抗体(参照国际专利 申请公开号W093A2227、 WO92/03918、 WO94/02602、 W094/25585、 WO%/34096、 W096/33735)。
并且，还已知使用人抗体噬菌体文库通过筛选法获得人抗体的技 术。例如，利用噬菌体展示法使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv) 在噬菌体表面表达，可以筛选与抗原结合的噬菌体。通过分析所筛选 的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA 序列。如果清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以制作具有 该序列的适当的表达载体，获得人抗体。上述方法广为人知，可以参 考WO92/01047 、 WO92/20791 、 WO93/06213 、 W093/11236 、 W093/19172、 WO95/01438、 W095/15388等。
重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列只要具有NR10中和活性 即可，可以是在确认具有NRIO中和活性的抗体的重链可变区或轻链 可变区的氨基S吏序列中取代、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸 的氨基酸序列。作为在重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中取 代、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸以制备具有NR10中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的、本领域技术人 员所熟知的方法，已知有向蛋白质中导入突变的方法。例如，本领域
技术人员通过利用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno， T, Ogasahara, Y 和 Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleot 画ide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275 ; Zoller， MJ,和Smkh， M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml 3 vectors (克隆至'J M13载 体的DNA片段的寡核苷酸位点定向诱变).Methods Enzymol. 100， 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen， HW, Kramer, B， Pflugfelder, M， 和 Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12， 9441—9456; Kramer W，和Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel， TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection (不需要表型选择的快速有岁文 的位点特异性诱变法).Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492)等向具有 NR10中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中导 入适当的突变，可以制备与具有NR10中和活性的抗体的重链可变区 或轻链可变区功能相同的突变体。这样，重链可变区或轻链可变区中 有一个或多个氨基酸发生突变、且具有NR10中和活性的抗体的重链 可变区或轻链可变区也在包含在本发明的重链可变区或轻链可变区 中。
改变氨基酸残基时，优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的另一 种氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，例子有疏水性氨基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、亲水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、 A、 V、 L、 I、 P)、 具有含羟基的侧链的氨基酸(S、 T、 Y)、具有含硫原子的侧链的氨基 酸(C、 M)、具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D、 N、 E、 Q)、具有
13含碱基的侧链的氨基酸(R、 K、 H)和具有含芳香族的侧链的氨基酸(H、 F、 Y、 W)(括弧内均表示氨基酸的一文字标记)。上述各组内氨基酸 的取代称作保守取代。已知含有对某氨基酸序列通过缺失、添加一个 或多个氨基酸残基和/或用其它氨基酸取代而被修饰的氨基酸序列的 多肽能够维持其原有的生物学活性(Mark， D. F.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 5662-6; Zolier， M. J.和Smith, M.， Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A.等，Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland， G.等，Proc. Natl. Acad. Sd. USA (1982) 79: 6409-13)。上述突变体与本发明的重链可变区或轻链可变区的氨基酸 序列具有至少70%、优选至少75%、更优选至少80%、进一步优选至 少85%、更进一步优选至少90%、最优选至少95%的氨基酸序列的同 源性。本说明书中，序列的同源性定义为根据需要进行序列排比并 适当导入间隙使序列同源性达到最大后，与原始重链可变区或轻链可 变区的氨基酸序列的残基相同的残基的比例。氨基酸序列的同源性可 以利用上述方法确定。
另外，在重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中取代、缺失、 添加和/或插入一个或多个氨基酸并具有NRIO中和活性的重链可变区 或轻链可变区的氨基酸序列，还可以由核酸得到，所述核酸是在严格 条件下与包含编码该重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核苷 酸序列的核酸进行杂交的核酸。作为用于分离在严格条件下与包含编 码重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核苦酸序列的核酸杂交 的核酸的严格的杂交条件，可以例示6M尿素、0.4%SDS、 0.5xSSC、 37。C的条件或与其同等严格的杂交条件。采用更严格的条件例如6M 尿素、0.4%SDS、 O.lxSSC、 42。C的条件时，可以期待分离同源性更高 的核酸。确定已分离的核酸的序列时，可以按照后述公知的方法进行。 关于所分离的核酸的同源性，在核苷酸序列整体中具有至少50%以上、 进一步优选70%以上、更进一步优选90%以上(例如95%、 96%、 97%、 98%、 99%以上)的序列同源性。除上述利用杂交技术的方法以外，利用基因扩增法、例如聚合酶 链锁反应(PCR)法，也可以分离在严格条件下与包含编码重链可变区 或轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸，上述基 因扩增法使用根据编码重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核 苷酸序列信息而合成的引物。
核普酸序列和氨基酸序列的同源性可以通过Karlin和Altschul的 算法BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7)来确定。根 据该算法开发了被称作BLASTN和BLASTX的程序(Altschul等，J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10)。根据BLAST通过BLASTN来解析核 普酸序列时，参数设定为分值(score)-100、字长(wordlength)-12。 另夕卜，根据BLAST通过BLASTX来解析氨基酸序列时，参数设定为 分值=50、字长=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程 序的默认参数。上述解析方法的具体手法广为人知(参照NCBI (National Center for Biotechnology Information)的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)的网址；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)
本发明中的抗体可以是低分子抗体。本发明的低分子抗体包括全 抗体(例如全IgG等)的一部分缺失的抗体片段，只要具有NR10中和 活性即可，没有特别限定。本发明的低分子抗体只要是全抗体的一部 分即可，没有特别限定，但优选包括重链可变区(VH)或轻链可变区 (VL),特别优选为包括VH和VL两方的低分子抗体。
本发明中的低分子抗体优选较全抗体的分子量小，但有时也会形 成例如二聚体、三聚体、四聚体等多聚体，有时还会较全抗体的分子 量大。
作为本发明中的低分子抗体之一，例如有scFv抗体。scFv抗体 是指将重链可变区([VH])和轻链可变区([VL])经接头等连接而形成的 单链多肽的抗体(Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" 113 巻,Resenburg和Moore编,Springer Verlag, New York, 269-315页，
15(1994))。对所连接的重链可变区和轻链可变区的顺序没有特別限定，
可以按照任何顺序进行排列，例如有以下排列。接头[VL] [VL]接头[VH]
重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列可以被取代、缺失、添加 和/或插入。并且，使重链可变区与轻链可变区締合时，只要具有抗原 结合活性即可，可以缺失一部分，还可以添加其它多肽。并且可以将 可变区嵌合或人源化。
在本发明中，连接抗体可变区的接头可以使用能通过基因工程 导入的任意的肽接头或合成化合物接头，例如Protein Engineering, 9(3): 299-305, 1996中公开的接头。
本发明中优选的接头为肽接头。对肽接头的长度没有特别限定， 本领域技术人员可以根据目的适当选择，但通常为1-100个氨基酸， 优选3 50个氨基酸，进一步优选5~30个氨基酸，特别优选为12~18 个氨基酸(例如15个氨基酸)。
肽接头的氨基酸序列的例子有以下序列。
Ser
Gly.Ser
Gly.Gly.Ser
Ser.GlyGly
Gly'Gly'Gly'Ser (SEQ ID No:8) Ser'Gly.Gly.Gly (SEQ ID No:9) Gly'Gly.GlyGly'Ser (SEQ ID No:10) Ser.Gly.Gly'Gly.Gly (SEQ ID No:l 1) GlyGly.Gly.Gly.Gly,Ser (SEQ ID No:12) SerGly.Gly.Gly.Gly'Gly (SEQ ID No: 13) Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ IDNo:14) Ser.Gly.Gly.Gly'Gly.Gly.Gly (SEQ ID No: 15)(Gly.Gly.Gly.GlySer (SEQ ID No:10))n (Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ IDNo:l l))n 可以列举[n为1以上的整数]等。
合成化合物接头(化学交联剂)是通常用于肽交联的交联剂，例如 有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸 双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS3)、 二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、 二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥询酰 亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀S臾磺基琥珀酰亚胺酯)(Sulfo-EGS)、 二 琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)、 二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐 (Sulfo-DST)、双P-(琥珀酰亚氨氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双 [2-(磺基琥珀酰亚氨氧基羰基氧基)乙基]砜(Sulfo-BSOCOES)等，上述 交联剂市场上可以买到。
本发明的抗体还包括在本发明抗体的氨基酸序列中添加了多个 氨基酸残基而得到的抗体。另外，还包括上述抗体与其它肽或蛋白融 合而成的融合蛋白。制作融合蛋白的方法可以采用本领域技术人员所 公知的方法，例如连接编码本发明抗体的多核普酸与编码其它肽或多 肽的多核苷酸使构架一致，将其导入表达载体中，使之在宿主中表达 即可。作为与本发明抗体融合的其它肽或多肽，例如可以使用FLAG (Hopp， T. P.等,BioTechnology (1988) 6， 1204-1210)、包含6个His (组 氨酸)残基的6xHis、 10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP 片段、pl8HIV片段、T7-tag、 HSV-tag、 E-tag、 SV40T抗原片段、lck tag、 (x-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C片段等公知的肽。另外，与本 发明抗体融合的其它多肽例如有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流 感血凝素)、免疫球蛋白恒定区、P-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋 白)等。使编码市售的这些肽或多肽的多核苦酸与编码本发明抗体的多 核苷酸融合，使由此制备的融合多核芬酸表达，从而可以制备融合多 肽。
17而在氨基酸序列、分子量、等电点或是否具有糖链或构象等方面有所 不同。但所得抗体只要具有与本发明抗体相同的功能，即包括在本发 明中。例如，使本发明的抗体在原核细胞例如大肠杆菌中表达时，在 原始抗体的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸残基。本发明的抗体也 包括这样的抗体。
本发明的抗体可以利用本领域技术人员所公知的方法进行制作。
例如，可以根据识别NR10的抗体的序列，采用本领域技术人员所公 知的基因重组技术进行制作。具体而言，根据识别NR10的抗体的序 列构建编码抗体的多核苷酸，将其导入表达载体中，之后使之在适当 的宿主细胞中表达即可(例如参照Co， M. S.等，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976; Better, M.和Horwitz， A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A.和Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi， E., Methods Enzymol. (1986) 121， 652-663; Rousseaux, J.等，Methods Enzymol. (1986) 121， 663-669; Bird, R. E.和Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137)。
载体的例子有M13系载体、pUC系载体、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。为了亚克隆和切除cDNA时，除上述载体外，例如还 有pGEM-T、 pDIRECT、 pT7等载体。为了产生本发明的抗体而使用 载体时，表达载体是特别有用的。作为表达载体，例如为了在大肠杆 菌中表达时，载体除了具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外，还必须 具有可以在JM109、 DH5a、 HBIOI、 XL1-Blue等大肠杆菌宿主中高 效率地表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等，Nature (1989) 341， 544_546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、 araB启动子(Better等，Science (1988)240, 1041-1043)或T7启动子等。作为这样的载体，除上述载体 夕卜，还包括pGEX-5X画l (Pharmacia制)、"QIAexpress system" (Quiagen 制)、pEGFP、或者pET (此时宿主优选表达T7 RNA聚合酶的BL21) 等。
载体中还可以包括用于抗体分泌的信号序列。作为用于抗体分泌的信号序列，当向大肠杆菌的周质中分泌蛋白时，可以使用pe旧信号 序列(Lei, S. P.等，J. Bacteriol. (1987) 169， 4379)。例如可以利用氯化4丐 法、电穿孔法将载体导入宿主细胞中。
除大肠杆菌外，用于制造本发明抗体的载体例如还有来源于哺 乳动物的表达载体(例如pcDNA3 (Invitrogen社制)或pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), 5322页)、pEF、 pCDM8)、来源于昆 虫细胞的表达载体(例如"Bac-to-BAC杆状病毒表达系统"(Gibco-BRL 制)、pBacPAK8)、来源于植物的表达载体(例如pMHl 、 pMH2)、来源 于动物病毒的表达载体(例如pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、来源于反转 录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来源于酵母的表达载体(例如 "Pichia Expression Kit" (Invitrogen制)、pNVll、 SP-QOl)、来源于枯草 菌的表达载体(例如pPL608、 pKTH50)。
为了在CHO细胞、COS细月包、NIH3T3细胞等动物细胞中表达时， 载体必须具有在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子 (Mulligan等，Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTR启动子、EFla启 动子(Mizushima等，Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMV启动子 等，进一步优选栽体具有用于筛选转化细胞的基因(例如可用药物(新 霉素、G418等)判别的耐药基因)。具有上述特性的载体的例子有 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV、 pOP13等。
并且，为了稳定表达基因且扩增细胞内的基因拷贝数时，可以列 举以下方法，即向缺失核酸合成路径的CHO细胞中导入补偿该路径 的具有DHFR基因的载体(例如pSV2-dhfr (Molecular Cloning第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等)，再用氨曱蝶呤扩增该 载体的方法。另外，为了瞬时表达基因时，可以列举以下方法，即使 用染色体上具有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，用具有SV40 的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。复制起点可以使用来源 于多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的起点。为了在宿主 细胞系中扩增基因拷贝数，表达载体可以进一步含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄噪呤鸟噪呤磷酸核糖转 移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为筛选标记。
由此得到的本发明的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养 基等)分离，并纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可 以使用通常抗体的纯化中所使用的分离、纯化方法，但没有任何限制。 例如，可以适当选择和组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、 溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳 法、透析、重结晶等来分离和纯化抗体。
层析例如有亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、 反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization (蛋白质纯化与鉴定实'验指南)A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshark等,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。上述层析可以使用液相层析例如HPLC、 FPLC等来进行。亲合 层析柱有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有HyperD、 POROS、 Sepharose FF (GE Amersham Biosciences)等。本发明还包含经上述纯化 方法进行高度纯化的抗体。
本发明还提供含有上述本发明抗体的片段和/或其修饰物作为有 效成分的炎性疾病的预防或治疗药。本发明抗体的片段和/或其修饰物 包括本发明的抗体(全抗体(例如全IgG)、重组抗体(例如嵌合抗体、人 源化抗体、人抗体等)、低分子抗体(例如scFv抗体等))的一部分缺失的 抗体片段，只要具有抗原结合能即可，没有特别限定。本发明的抗体 片段只要是全抗体的一部分即可，没有特别限定，但优选包括重链可 变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。 VH或VL的氨基酸序列可以包含取 代、缺失、添加和/或插入。并且，VH和/或VL可以部分缺失，只要具 有抗原结合能即可。还可以将可变区嵌合或人源化。抗体片段的具体 例子有Fab、 Fab，、 F(ab，)2、 Fv等。为了得到上述抗体片段，只要构 建编码上述抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当 的宿主细胞中表达即可(例如参照Co， ML S,等,J. Immunol. (1994) 152，
202968-2976; Better, M.和Horwitz， A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496; Pluckthun, A.和Skerra， A.， Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J.等，Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E,和Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9， 132-137)。
本发明的抗体还可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、荧光物 质、发光物质、酶、毒素等各种分子结合而成的缀合抗体。上述缀合 抗体可以通过对所得抗体实施化学修饰而得到。需要说明的是，抗体 的〈'务饰方法已在本领域中确立(例如US 5057313、 US 5156840)。本发 明中的"抗体"还包括上述缀合抗体。
测定抗体的NR10结合活性时，可以利用本领域技术人员所公知 的方法进行。例如，测定抗体的抗原结合活性的方法可以采用ELISA (酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法) 或荧光抗体法。例如使用酶免疫测定法时，在包被了抗原的平板上加 入含有抗体的试样、例如抗体产生细胞的培养上清或纯化抗体。添加 用石成性磷酸酶等酶标记的二次抗体并温浴平板，清洗后加入对硝基苯 磷酸等酶底物，之后测定吸光度，由此可以评价抗原结合活性。
测定抗体的NR10中和活性时，例如可以按照实施例记载的7见察 该IL-31依赖性细胞林的增殖抑制效果的方法来进行。
本发明的NR10拮抗剂或具有NR10中和活性的抗体可用于炎性 疾病的预防或治疗药中。本发明人等证实对各种炎症模型动物给予 小鼠NR10中和抗体时，取得了显著的治疗效果。另外，有才艮道称， 在特应性皮炎患者的肥厚表皮中人NTUO的表达亢进(非专利文献1)。 另 一方面，本发明人等进行上述慢性皮炎模型小鼠耳廓的免疫组织染 色时，确认与人的情形一样，在肥厚表皮中小鼠NR10的表达亢进(实 施例5)。以上情况表明NR10在所有动物种中都同样参与了炎性疾 病，认为人NR10中和抗体与小鼠NR10中和抗体一样，对各种炎性 疾病的预防或治疗有效。并且认为抗体以外的NR10拮抗剂也与本实
21施例中的所见相同，对各种炎性疾病具有治疗效果。
在本发明中，炎性疾病是指，与由于物理、化学或生物学作用物 质引起的损伤或异常刺激而在受患血管和相邻组织中发生的细胞学.
组织学反应相关的、伴有病理学所见的疾病(Stedman医学大辞典第5 版，林式会社MEDICAL VIEW社，2005年)。常见的炎性疾病的例子 有皮炎(特应性皮炎、慢性皮炎等)、炎性肠病(大肠炎等)、哮喘、关 节炎(类风湿性关节炎、变形性关节症等)、支气管炎、Th-2型自身免 疫疾病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、慢性GVHD、克罗恩氏病 (Crohn's disease)、变形性脊推炎、腰痛、痛风、手术外伤后的炎症、 肿胀的緩解、神经痛、咽喉炎、膀胱炎、肝炎(非酒精性脂肪肝、酒精 性肝炎等)、乙型肝炎、丙型肝炎、动脉硬化等。
成为本发明对象的炎性疾病的优选例有特应性皮炎、慢性皮炎、 风湿症、变形性关节症、慢性哞喘。
本发明人等发现NR10拮抗剂抗体对特应性皮炎、慢性皮炎、 风湿症、变形性关节症具有治疗效果。另一方面，判明NR10拮抗剂 抗体在急性接触性皮炎和DSS急性大肠炎模型中没有治疗效果。
本发明的炎性疾病的预防或治疗药的特征在于含有上述NR10 拮抗剂或具有NR10中和活性的抗体作为有效成分。"含有NR10拮抗 剂作为有效成分"意思是指，含有NR10拮抗剂作为活性成分的至少一 种，对其含有率没有限定。另外，本发明的炎性疾病的预防或治疗药 在含有NR10拮抗剂的同时，可以含有其它促进炎性疾病的预防或治 疗的成分。
可以按照常规方法将本发明的NR10拮抗剂制成制剂(例如 Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton， US A)。而且，根据需要还可以含有医药上可接受的 载体和/或添加剂。例如可以含有表面活性剂(PEG、 Tween等)、赋 形剂、抗氧剂(抗坏血酸等)、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、緩冲 剂(磷酸、枸橼酸、其它有机酸等)、螯合剂(EDTA等)、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、矫味剂等。但本发明的炎性 疾病的预防或治疗药并不受限于此，还可以适当含有其它常用的载 体。具体例子有轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、 羧甲基纤维素钧、羧曱基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基曱基纤维 素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链
脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧曱基纤维素、玉 米淀粉、无机盐类等。还可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋 白、明胶和免疫球蛋白等蛋白质；以及甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、
精氨酸和赖氨酸等氨基酸。制成注射用水溶液时，将mio拮抗剂溶
于含有例如生理盐水、葡萄糖或其它佐剂的等渗溶液中。佐剂的例子 有D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，并且可以与适当的 助溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活 性剂(聚山梨酯80、 HCO^0)等结合使用。
根据需要，还可以将NR10拮抗剂封入微胶嚢(羟曱基纤维素、明 胶、聚甲基丙烯酸甲酯等的微胶嚢)中、或者制成胶体药物传递系统(月旨 质体、白蛋白微球体、微乳、纳米粒子和纳米胶嚢等)(例如参照 Remington's Pharmaceutical Science第16片反&， Oslo Ed. (1980)等)。并 且，将药物制成緩释制剂的方法也已公知，这些方法可适用于NR10 4吉4元剂(Langer等，J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15， 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12， 98-105;美国专利第3,773,919号；欧洲专利申 请公开(EP)第58,481号；Sidman等，Biopolymers (1983) 22， 547-56; EP第133,988号)。
本发明的炎性疾病的预防或治疗药可以口服给药也可以胃肠外 给药，但优选胃肠外给药。具体而言，对患者进行注射给药和经皮给 药。作为注射剂型的例子，例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射或 皮下注射等进行全身或局部给药。可以在欲抑制炎症的部位或其周边 局部注入、特别是肌肉内注射。可以根据患者的年龄、症状选择适当 的给药方法。给药量例如可以在每次、每lkg体重活性成分为0.0001mg 100mg的范围内选择。或者，例如对患病的人给药时，可以选择 每人的给药量在活性成分为0.0001~1000 mg/kg体重的范围，每次的 给药量例如优选含有约0.01-50 mg/kg体重的量的NR10拮抗剂。但 本发明的炎性疾病的预防或治疗药并不受上述给药量的限制。
本发明还提供具有NRIO中和活性的抗体(包括具有NRIO中和活 性的抗体的片段和/或其修饰物。下同)。本发明的具有NR10中和活 性的抗体可以在上述炎性疾病的预防或治疗药中作为有效成分。本发 明的具有NTUO中和活性的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗 体，但优选为单克隆抗体。具有NRIO中和活性的单克隆抗体可以通 过上述方法得到。另外，本发明的单克隆抗体对来源于哺乳动物的 NR10或其片段具有中和活性，优选对来源于人或小鼠的MUO或其 片段具有中和活性，进一步优选对来源于人的NR10或其片段具有中 和活性。为了作成具有人NRIO中和活性的单克隆抗体，可以使用人 的NR10或其片段肽作为免疫原。本发明的具有NR10中和活性的抗 体可以是重組抗体。本发明的具有NRIO中和活性的重组抗体并不受 限于此，其例子有嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、低分子抗体。
本发明中，具有NRIO中和活性的抗体的例子有具有包含SEQ ID No:l中记载的氨基酸序列的重链可变区、包含SEQ ID No:3中记 载的氨基酸序列的轻链可变区的抗小鼠NR10抗体。
本发明还包括具有人NRIO中和活性的单克隆抗体。如上所述， 本发明的具有人NR10中和活性的单克隆抗体，可以通过使用人NR10 或其片段肽作为免疫原来制作单克隆抗体，再利用使用上述IL-31依 赖性细胞林的测定系统从上述抗人NR10单克隆抗体中筛选具有人 NR10中和活性的抗体。
本发明中具有人NRIO中和活性的抗体的例子有下述(a) (d)中 任一项所记载的抗体。
(a)抗体，其具有含有SEQIDNo:18所记载的氨基酸序列作为CDR1、 含有SEQ ID No: 19所记载的氨基酸序列作为CDR2、含有SEQ ID
24No:20所记载的氨基酸序列作为CDR3的重链可变区。
(b) 抗体，其具有含有SEQIDNo:21所记载的氨基酸序列作为CDR1、含有SEQ ID No:22所记载的氨基酸序列作为CDR2、含有SEQ IDNo:23所记载的氨基酸序列作为CDR3的轻链可变区。
(c) 抗体，其具有(a)的重链可变区和(b)的轻链可变区。
(d) 抗体，其识别与(a) (c)中任一项记载的抗体相同的表位。
某抗体是否与其它抗体识别相同的表位，这可以通过两者对表位的竟争来确认。抗体间的竟争可以通过竟争结合分析进行评价，其方法有ELISA、荧光能量转移测定法(FRET)或焚光微量测定技术(FMAT (注册商标))等。与抗原结合的该抗体的量与候选竟争抗体(受试抗体)的结合能间接相关，所述候选竟争抗体竟争性地结合相同表位。即，受试抗体与相同表位结合的量或亲和性越大，该抗体与抗原结合的量越低，受试抗体与抗原的结合量越增加。具体而言，向抗原中同时添加已适当标记的该抗体和应该评价的抗体，利用标记冲全测结合的抗体。通过预先标记该抗体可以容易地测定与抗原结合的该抗体量。对该标记没有特别限定，根据检测方法来选择标记方法。标记方法的具体例子有焚光标记、放射标记、酶标记等。
例如，向使NR10表达的动物细胞中同时添加荧光标记的该抗体和未标记的该抗体或受试抗体，利用荧光微量测定技术纟全测被标记的该抗体。
这里所说的识别相同表位的抗体是指，当受试抗体的浓度为非标
记抗体的ICsg的10倍时能够使标记抗体在该表位的结合量下降至少
50%的抗体。其中IC5o是指利用非标记抗体的结合使标记抗体在该表
位的结合量下降50%的浓度(1<:50)。
蟹猴NR10结合活性，进一步优选具有食蟹猴NR10中和活性。测定对食蟹猴NR10的结合活性或中和活性时，可以使用包含SEQ IDNo :24中记载的氨基酸序列的食蟹猴NR10。本发明还提供以下所示的治疗方法。其中，NRIO、拮抗剂、单克 隆抗体、重组抗体、炎性疾病等的说明同上。
(1) 炎性疾病的预防或治疗方法，该方法包括对患有炎性疾病的患者
给予NR10拮抗剂的步骤。
(2) (1)所述的方法，其中NR10拮抗剂为具有NR10结合活性的抗体。
(3) (2)所述的方法，其中抗体为单克隆抗体。
(4) (2)所述的方法，其中抗体为与人NR10结合的单克隆抗体。
(5) (2) (4)中任一项所述的方法，其中抗体为重组抗体。
(6) (5)所述的方法，其中重组抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(7) (2) (6)中任一项所述的方法，其含有具NRIO中和活性的抗体的片 段和/或其修饰物作为有效成分。
(8) (1) (7)中任一项所述的方法，其中炎性疾病为特应性皮炎。
(9) (1 )~(7)中任一项所述的方法，其中炎性疾病为慢性皮炎。
(10) (1) (7)中任一项所述的方法，其中炎性疾病为风湿症。
(11) (1) (7)中任一项所述的方法，其中炎性疾病为变形性关节症。 并且，本发明还提供以下所示的发明。其中，NRIO、拮抗剂、单
克隆抗体、重组抗体、炎性疾病等的说明同上。
(1) NR10拮抗剂在制造用于预防或治疗炎性疾病的药物中的应用。
(2) (1)所述的应用，其中NR10拮抗剂为具有NR10结合活性的抗体。
(3) (2)所述的应用，其中抗体为单克隆抗体。
(4) (2)所述的应用，其中抗体为与人NR10结合的单克隆抗体。
(5) (2) (4)中任一项所述的应用，其中抗体为重组抗体。
(6) (5)所述的应用，其中重组抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(7) (2) (6)中任一项所述的应用，其含有具N1U0中和活性的抗体的片 段和/或其修饰物作为有效成分。
(8) (1) (7)中任一项所述的应用，其中炎性疾病为特应性皮炎。
(9) (1) (7)中任一项所述的应用，其中炎性疾病为慢性皮炎。
(10) (1) (7)中任一项所述的应用，其中炎性疾病为风湿症。
26(11) (1) (7)中任一项所述的应用，其中炎性疾病为变形性关节症。
需要说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献，均作为参
照而纳入本"i兌明书。 实施例
以下通过实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不受限于 这些实施例。
「实施例11确立表达NRIO和OSMR的Ba/F3细胞抹
将人NR10 cDNA (WO 0075314 SEQ ID No:l)插入表达载体 pCOSl (Biochem Biophys Res Commun. 228， 838-45页，1996)中，制成 pCosNR10.3。利用PCR法从人胎盘文库中分离制癌蛋白M受体cDNA (OSMR, GenBank检索号NM003999)，同样构建表达载体 pCosl-hOSMR。利用电穿孔法将各lO,g的载体同时导入来源于小鼠 IL-3依赖性pro-B细胞的细胞林Ba/F3中(BioRad Gene Pulser, 960 pF, 0.33 kV)。导入后添加人IL-31进行培养，得到依赖于IL-31而增殖的 细胞林。同样，由表达小鼠KR10和小鼠OSMR基因的Ba/F3细胞制 作小鼠IL-31依赖性细胞抹。
所有细胞抹均显示数ng/mL的ED50,得到了进行良好增殖的细 胞林。人IL-31依赖性细胞株不与小鼠IL-31反应，通过添加人NR10 蛋白(胞外域)，增殖受到抑制。小鼠IL-31依赖性细胞抹不与人IL-31 反应，通过添加小鼠NR10蛋白(胞外域)，增殖未受到抑制。 「实施例21 NR10蛋白(胞外域)的制备
以人NR10 cDNA为模板，利用PCR法仅扩增胞外域，另外在C 末端附加FLAG tag序列，并插入表达载体pCXND3 (WO2005/005636) 中(pCXND3-NR10-flag)。利用电穿孔法将10 ,g直链状的该载体导入 中国仓鼠卵巢细胞林DG44中(BioRad Gene PulserII; 25 , 1.5 kV)， 得到显示出高表达的细胞株。利用抗FLAG抗体柱(SIGMA制)和凝胶 过滤法从将该细胞林大量培养的培养上清中得到纯化样品，供给以下实验。C末端添加有FLAG tag序列的小鼠NR10 (胞外域)也同样制备。 r实施例31具有抗小鼠NR10中和活性的scFv的分离和嵌合IgG化 BM095的制备
具体而言，本发明人等使用生物素化小鼠NR10蛋白(胞外域)， 利用筛选法从人抗体噬菌体文库中缩小候选克隆的筛选范围。从这些 克隆中纯化分泌性scFv,将其添加到实施例1中记载的IL-31依赖性 Ba/F3细胞增殖测定系统中。结果成功地获得了显示强增殖抑制活性 的克隆BM095。
利用PCR法将BM095的人H链可变区序列(VH)连接到小鼠 IgG2a恒定区(CH1后)、将人L链可变区序列(VL)连接到小鼠X链恒 定区，构建表达载体。此时VH的氨基酸序列见SEQ ID No:l,编码 该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ IDNo:2。 VL的氨基酸序列见SEQ ID No:3,编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID No:4。将直链状 的各表达载体同时导入DG44林中，筛选以高水平表达嵌合IgG的细 胞4朱。利用蛋白A (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences制)柱和阳离子交换(SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH制) 柱层析法从将该细胞抹大量培养的培养上清中得到纯化样品。再利用 ActiClean Etox (Sterogen制)树脂将致热源减少至检测限以下，供给以 下的动物实验。向上述测定系统中添加BM095时的结果见图1。 「实施例41利用NC/Nga小鼠的特应性皮炎模型研究药效
通过每周重复涂布一次苦基氯(PiCl)来制作皮炎模型。即，用 5。/oPiCl(150〃l)致敏腹部、足趾4天后，每周用0.8。/。PiCl(150/4)涂布 背部、耳廓一次，通过反复涂布诱发皮炎。从第3周一直到第6周每 周观察2次症状，从5个方面((l)搔痒症、(2)发红和出血、(3)浮肿、 (4)损伤和组织破损、(5)形成痂皮和干燥)各进行0 3分的评分。按10 mg/kg腹腔内给予抗体，在致敏、各诱发前一天共给药6次(BM095 组)，或者第3周后在各诱发前一天共给药3次(V/B组)。第3周后每 天按l mg/kg经口给予地塞米松(DEX组)，作为阳性对照。每组使用10只NC/Nga雄性小鼠。
如图2所示，与溶剂给予组相比，抗体给予组确认到显著的抑制 效果。此时如图2所示，DEX组确认到体重显著减轻，但抗体给予组 的体重没有变化，表明该抗体是非常安全的药物。 「实施例51利用反复涂布苦基氯而产生的慢性皮炎模型研究药效
在6周龄雌性BALB/c小鼠的右耳涂布200.5%的苦基氯(丙酮/ 橄榄油(1:4， v/v)溶液)进行致敏。致敏后第8天起每隔1天在右耳涂 布20^10.25%的苦基氯(丙酮/橄榄油(1:4， v/v)),通过反复涂布诱发皮 炎。对BM095预防效果评价组从致敏前一天起按10 mg/kg每周腹腔 内给予一次BM095,而对BM095治疗效果评价组从诱发开始后第20 天起按IO mg/kg每周腹腔内给予一次BM095。通过用表盘式测厚仪 经时性测定右耳的厚度，来评价耳廓肿胀。
其结果见图4，在抗体给予组确认到显著的抑制效果。有"R告称， 在特应性皮炎患者的肥厚表皮中人NR10表达亢进(非专利文献1)。进 行上述慢性皮炎模型小鼠耳廓的免疫组织染色时，与人的情形一样， 观察到在肥厚表皮中小鼠NR10表达亢进(图5。在实施例3中制作将 恒定区变换为人IgG的BM095,用于免疫组织染色。呈茶褐色的部分 为NR10表达部位)。本发现表明在人和小鼠中NR10同样参与了炎 -!"生疾病。
r实施例61利用胶原诱导性关节炎(风湿症)模型研究药效 模型小鼠的制作和药效评价如下进行。
对9周龄雌性DBA/1JN小鼠在尾根部皮内给予来源于牛关节的 0.3%11型胶原与完全佐剂H37Ra等量混合的140/^胶原凝胶(第0天， 致敏)。3周后在背部皮内给予同样调制的胶原凝胶，诱发关节炎的发 病(第21天，诱发)。根据致敏前两天(天数-2)的体重将16只小鼠分成 2组、每组8只，设定为溶剂给予組和BM095给药组。将受试物质 BM095以经PBS稀释6倍的20 mmol/L的乙酸緩冲液(pH5.5) (200 mmol/L NaCl)作为溶剂，对BM095给药组的8只小鼠在致壽丈前一天(天
29数-l)按10 mg/kg体重进行静脉内给药 而对作为对照的溶剂给予组 的8只小鼠在Day-l天给予相同剂量的溶剂。需要说明的是，从诱发 前一天(第20天)起每隔2-3天观察四肢的肺胀，通过打分(每肢0-4分 满分16分)来进行评价。
结果见图6, BM095给药组在第20天后四肢肺胀的分数降低， 这表明BM095具有抑制关节炎发病的作用。
「实施例71利用胶原酶诱导性关节炎(变形性关节症)模型研究药效 模型小鼠的制作和药效评价如下进行。
对8周龄雄性C57BL/6J Jcl小鼠(日本CLEA制)从尾静脉进行静 脉内给予溶剂对照(经PBS稀释6倍的20 mmol/L乙酸緩冲液，pH5.5， 200 mmol/L NaCl， n=5)、 BM095 2 mg/kg (n=5)、 BM095 20 mg/kg (n=6) (5 mL/kg)。之后在3%异氟烷吸入麻醉下，向右膝关节腔内注入6 ;d 经0.45 /rni滤器(MILLIPORE社制)过滤的1.5。/。胶原酶溶液(Type11， Sigma社制)(Am J Pathol 1989; 135(6): 1001-14)。
在即将给予胶原酶之前、给予后3、 7、 14天用卡规(Mitsutoyo制) 测量左右膝关节宽度，算出左右之差。以该差作为表示右膝关节肺胀 的值，利用梯形法则算出其推移曲线下面积(AUC),作为药效指标。 使用统计解析软件(SAS Institute社制)，对溶剂对照组与CNP给药组 之间的AUC进行斯氏t检验(p0.05时存在显著差异)。其结果见图7, BM095给药组的AUC在所有用量中均较溶剂对照组明显小。由该结 果可知BM095抑制了变形性关节症模型中的关节炎。 「实施例81抗人NR10中和抗体的获得
用人NR10蛋白(胞外域)[实施例2中记载]对小鼠进行免疫，按 照常规方法制作杂交瘤。使用实施例1所示的人IL-31依赖性细胞抹 (hNR10/hOSMR/BaF3细胞)评价上述杂交瘤培养上清的中和活性，得 到具有高的NR10中和活性的若干个克隆(图8)。 「实施例91人嵌合抗体的制备
中和抗体中活性最高的NA633的重链可变区的氨基酸序列见SEQ ID No:16、轻链可变区的氨基酸序列见SEQ ID No:17。此外， NA633的重《连可变区的CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列分别见 SEQIDNo:18、 SEQIDNo:19和SEQIDNo:20,轻链可变区的CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列分别见SEQ ID No:21 、 SEQ ID No:22和 SEQIDNo:23。
再按照常规方法制作具有上述小鼠可变区和人恒定区(H链为 IgGl型、L链为K型)的嵌合抗体，测定中和活性。如图9所示，嵌 合NA633抗体在低浓度下显示出强的中和活性。 「实施例101食蟹猴NR10的分离
在临床前阶段的安全性评价中认为对食蟹猴的交差反应性、中和 活性至关重要，所以本发明人等尝试着分离食蟹猴NR10基因。根据 公开的恒河猴基因组信息等设计引物，利用PCR法成功地由食蟹猴脏 器扩增NR10基因。分离的食蟹猴NR10与人NR10的氨基酸序列的 排比见图10。此外，食蟹猴NR10的氨基酸序列见SEQIDNo:24。如 实施例1所述，将该食蟹猴NR10基因与人OSMR基因 一 同导入Ba/F3 细胞中，确立显示人IL-31依赖性增殖的细胞抹。使用该细胞抹研究 实施例9的嵌合抗体NA633的中和活性时，判明该抗体在食蟹猴中也 显示出强的中和活性(图11)。
「参考例11 BM095对硫酸葡聚糖钠(DSS)诱发大肠炎的药效
制作作为炎性肠病(IBD)的病态模型被报道的DSS诱发大肠炎模 型(J Immunol (2003); 171: 5507-5513)，研究抗小鼠NR10中和抗体一 BM095的效果。使用经0.22 〃m滤器(Millipore制)过滤灭菌的蒸馏水 制备硫酸葡聚糖钠(和光纯药制)的5。/。(w/v)水溶液，让6周龄雄性 Balb/cAnN Crj小鼠(日本CHARLES RIVER制)经给水瓶自由摄取7天 上述溶液，测定体重，以相对于DSS给药起始日的体重的变化率作为 药效评价指标。
使用该模型，在DSS给药前一天按10 mg/kg的用量静脉内给予 抗小鼠NR10中和抗体BM095，评价体重减轻(n-10)，以枱r验通过中和IL-31信号病态是否得到改善。设定在DSS给药前一天静脉内给予 溶剂(乙酸緩冲液[20mmol/L乙酸钠、20mmol/L氯化钠]与磷酸緩冲生 理盐水[PBS ， GIBCO制]以容量比1:5混合的混合液)的组(溶剂组，n= 10) 作为溶剂对照组。另外，为了掌握正常小鼠体重变化率的推移，还观 察与DSS给药组相同周龄和性别的Balb/cAnN Crj小鼠的体重变化率 的推移(n-l)。
体重的推移见图12。溶剂組通过给予DSS体重变化率降低。另 一方面，虽然BM095给药组也显示出与溶剂组相同的体重推移，但 DSS给药后4天和5天后BM095组的体重变化率较溶剂组明显下降。 由上述结果确认到给予BM095对该模型的大肠炎没有产生治疗效果。
有报道称，在该模型中IL-31RA的表达亢进(W02004/003140), 但上述实验结果表明同分子的中和抗体对该模型的大肠炎没有治疗 效果。
「参考例21 BM095对急性苦基氯接触性皮炎模型的药效
制作作为急性接触性皮炎模型被报道(Clin Immunol (2003); 108: 257-262)的、经涂布苦基氯而致敏和诱发的产生延迟型过敏症反应结 果的皮炎，研究抗小鼠NRIO中和抗体一BM095的效果。在8周龄雌 性Balb/cAnN Crj小鼠(日本CHARLES RIVER制)的腹部皮肤上涂布 50//L 7。/。的苦基氯(nacalai tesque， Inc.)溶液(乙醇:丙酮=3:1, v/v)进行致 敏，5天后在右耳廓皮肤上涂布20 〃L i。/。的苦基氯溶液(丙酮:橄榄油 =1:4， v/v)，诱发接触性皮炎(诱发)。在同一只小鼠的左耳廓皮肤上涂 布20/^溶剂(丙酮:橄榄油=1:4， Wv)，作为用于评价溶剂对耳廓厚度 影响的对照(阳性对照组，n=6)。在临i秀发前和诱发后24、 48、 72小 时用表盘式测厚仪(尾崎制作所制)测量左右耳的厚度，以相对于临诱 发前的耳廓厚度的变化作为药效评价指标。
设立致敏时于腹部皮肤上涂布不含苦基氯的乙醇丙酮混合液 (3:1, v/v)、在此5天后于右耳廓皮肤上涂布20^Ll。/c)的苦基氯溶液、 于左耳廓皮肤上涂布20〃L溶剂(丙酮:橄榄油=1:4， v/v)的组(阴性对照
32组，n=6)，作为用于评价病态成立的对照组。
为了评价本类病态中抗NR10抗体的给药效果，设立按照上述阳 性对照组的方法诱发急性接触性皮炎并在致敏前一天和诱发前一天 静脉内给予10mg/kgBM095的组(BM095组，n-6)和按相同计时给予 溶剂(乙酸緩冲液口Ommol/L乙酸钠、ZOmmol/L氯化钠]与磷酸緩冲生 理盐水[PBS， GIBCO制]以容量比1:5混合的混合液)的组(溶剂组， n=5)。
诱发后直至72小时的耳廓厚度变化见图13。在诱发后24、 48、 72小时，阳性对照组的耳廓均较阴性对照组明显肥厚，显示病态成立。 此时，BM095组显示出与溶剂组同样的耳廓厚度的推移，没有确认到 显著的抑制。
由上述结果判明给予BM095并没有对该才莫型所观察到的急性 接触性皮炎产生治疗效果。
产业实用性
根据本发明，可提供新型的炎性疾病的预防或治疗药。本发明所 提供的炎性疾病的预防或治疗药含有NR10拮抗剂、更优选具有NR10 中和活性的抗体作为其活性成分。
近年来，使用单克隆抗体的抗细胞因子疗法备受关注。但在实际 病态中的许多场合，即使阻断一种细胞因子，但其补偿经路起作用， 故难以得到治疗效果。并且，在阻断靶细胞因子时，难以预测会在哪
—种疾病中取得治疗效果。在上述状况下，本发明人等发现抗NRIO 中和抗体在患有特应性皮炎、慢性皮炎、风湿症、变形性关节症等的 模型小鼠中可以显著抑制其症状。
本发明人等还成功地获得了人NRIO中和抗体。含有人NR10中 和抗体作为有效成分的炎性疾病的预防或治疗药可临床应用于人。
权利要求
1. 炎性疾病的预防或治疗药，其含有NR10拮抗剂作为有效成分。
2. 权利要求l所迷的预防或治疗药，其中NR10拮抗剂为具有NR10 中和活性的抗体。
3. 权利要求2所述的预防或治疗药，其中抗体为单克隆抗体。
4. 权利要求2所述的预防或治疗药，其中抗体为具有人NR10 中和活性的单克隆抗体。
5. 权利要求2 4中任一项所述的预防或治疗药，其中抗体为重 组抗体。
6. 权利要求5所述的预防或治疗药，其中重组抗体为嵌合抗体、 人源化抗体或^v抗体。
7. 权利要求2~6中任一项所述的预防或治疗药，其含有具NRIO 中和活性的抗体的片段和/或其修饰物作为有效成分。
8. 权利要求1 7中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病 为特应性皮炎。
9. 权利要求1~7中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病 为慢性皮炎。
10. 权利要求1~7中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病 为风湿症。
11. 权利要求1~7中任一项所述的预防或治疗药，其中炎性疾病 为变形性关节症。
12. 抗体，该抗体具有NR10中和活性。
13. 权利要求12所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。
14. 权利要求12所述的抗体，其中NR10为人NR10。
15. 权利要求12 14中任一项所述的抗体，该抗体为重组抗体。
16. 权利要求15所迷的抗体，其中重组抗体为嵌合抗体、人源 化抗体或人抗体。
17. 权利要求12~16中任一项所述的抗体的片段和/或其修饰物。
18. 预防或治疗炎性疾病的方法，该方法包4舌对患有炎性疾病的 患者给予NR10拮抗剂的步骤。
19. NR10拮抗剂在制造用于预防或治疗炎性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明人等从人抗体噬菌体文库中获得了在IL-31依赖性Ba/F3细胞增殖测定系统中显示出强增殖抑制活性的克隆BM095。对使用NC/Nga小鼠的特应性皮炎模型小鼠、反复涂布苦基氯而产生的慢性皮炎模型小鼠、类风湿性关节炎模型小鼠、变形性关节症模型小鼠给予该抗小鼠NR10中和抗体时，显示出显著的抑制症状的效果，这表明抗NR10中和抗体实际上可以用作炎性疾病治疗药。本发明人等还成功获得了抗人NR10中和抗体，提供了实际上可临床应用的、极为有用的治疗药。
文档编号A61K45/00GK101500608SQ20078002960
公开日2009年8月5日 申请日期2007年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者北村秀智, 安达秀树, 糟谷惠子, 长谷川雅一 申请人:中外制药株式会社