含有壳低聚糖的ampk增效剂的制作方法

专利名称：：含有壳低聚糖的ampk增效剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于促进磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)的活性的组合物，该组合物含有壳低聚糖作为活性成分。特别是，本发明涉及用于通过激活AMPK和与脂质代谢有关的酶来增强肝细胞中能量代谢的组合物，该组合物含有壳低聚糖。
背景技术：
：壳聚糖广泛用于各个领域，例如废水凝固剂、重金属吸收剂、功能食品、离子交换剂、医药产品等。最近，已知壳多糖、壳聚糖、以及它们的衍生物显示出多种生理学活性，如去胆固醇功能(decholesteroUction)、抗癌作用、抑制血压升高、控制血糖、改善肝功能、排出人体内的重金属和污染物等，因此，对作为在生物医学科学领域中具有很高附加价值的未来材料的这种物质进行了很多的研究。壳低聚糖为通过酸或酶由壳聚糖水解得到的低分子多糖，它在人体内具有比壳聚糖更高的吸收性，并且已经研究了壳低聚糖的免疫增强作用、抗氧化作用(ShonYetal"J.Chitinandchitosan，2001，6，107-110)和抑制癌细胞生长的作用(NamMY,J.ChitinandChitosan,1999，4，184-188)。而且，据报道，壳低聚糖具有抑制由四氯化碳引起的肝损害的功能(ChejuJ.LifeScience,2(2),3-10,1999)。尽管壳低聚糖以多种方式用于保健食品或传统食品，但仍有少许涉及其功能的专利。此外，现有的专利没有提供将能量代谢的增强作用与能量消耗结合在一起的具体方法。同时，AMPK是在缺乏细胞内能量的状况下被激活的酶，有助于通过多功能的控制代谢而从缺乏能量的状况中恢复，并且在AMP的水平增至超过3ATP的应激状态下而被激活，由此增加了细胞内能量(ATP)的产生(BergeronR等，Diabetes,50，1076-1082，2001;WinderWW等，AmJPhysiol277:E1-10，1997)。己知AMPK广泛地分布在人体内，并且在调解细胞适应细胞内营养状况和外界环境的变化中起到能量检测器的作用(HardieAnnRevBiochem67，821-855，1998;HardieDG,EurJBiochem246,259-273,1997)。最近的研究报导，AMPK对细胞内能量的变化具有响应，并在碳水化合物和脂质的代谢中作为能量转化的主要介质而起到重要的作用。在许多研究中还研究了AMPK的激活对肝内代谢的作用。特别是，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)，这些催化了在脂肪酸和甾醇的合成中重要的控制步骤的酶，是这些研究中处理的主体。据报道，通过离体肝细胞内应激消耗ATP的AMPK激活作用诱导了HMGR的磷酸化，并抑制了脂肪酸和甾醇的合成(CortonJM等，CurrBiol4，315-324,1994;HeninN等，FASEBJ9,541-546，1995)。肝细胞内的ACC是肉碱棕榈酰转移酶-l(camithinepalmitoyltransferase-1)(CPT-1)(在将脂肪酸输送到线粒体内起重要作用)的有效抑制剂，并且当ACC失去活性时，对脂肪酸氧化具有较大影响的ACC代谢产物(如丙二酸单酰辅酶A)的浓度降低(MaGarryJD，AmJClinNutr67(Suppl.3)，500s-504s,1998;McGarryJD等,EurJBiochem244,1-14，1997)。当用肝细胞培养了典型的AMPK激活剂AICA-肌酐(AICAR)时，增加了脂肪酸的氧化；并且由于丙二酸单酰辅酶A浓度的降低，CPT-1的活性增加。而且，当在离体的鼠科动物脂肪细胞内通过AICAR激活AMPK时，通过ACC的磷酸化抑制了脂质的合成(SullivanJE，FEBSLett353，33-36，1994)。AMPK与源自运动的脂肪酸的氧化有关(MusiN等，Biochemicalsocietytransactions31,161-195,2002)，并且在运动过程中在鼠科动物的骨骼肌肉中激活的AMPK通过磷酸化使ACC-2失活，并降低了肌肉中能够使脂肪酸进入线粒体的丙二酸单酰辅酶A的量。在人类骨骼肌肉的研究中，报道了ACC-2在运动的过程中被磷酸化(ChenZ等，AmJPhysiol279，E1202-E1206,2000)，并因此失去活性，由此增加了脂肪酸的氧化(DeanD等，Diabetes,49(8),1295-300，2000)。如以上所公开的，AMPK是在缺乏细胞内能量的状况下被激活的酶，并有助于通过多功能的控制代谢而从缺乏能量的状况中恢复。也就是说，在细胞内ATP能量降低的状况下，它的活性增加，例如通过运动，并因此起到了促进代谢并增强ATP的合成的"代谢传感器"的作用。此外，由AMPK的激活而增加了能量的产生，在需要能量的情况下(诸如运动时或者在日常生活中)，增加的能量产生使运动能力得到改善并减少疲劳。因此，AMPK激活剂可以用于制备作为耐力促进剂(endurancebuilder)或者用于预防和改善疲劳的食品或医药产品o然而，对于促进显示了多种功能并具有广泛的应用范围的AMPK活性，壳低聚糖的作用还是未知的。
发明内容本发明的发明人研究了壳低聚糖对AMPK活性的作用，并发现了壳低聚糖对与AMPK活性和能量代谢有关的酶的作用。因此，本发明的目的在于提供用于促进AMPK活性的组合物，该组合物含有壳低聚糖，其中，该组合物能够有效地用于促进能量代谢并改善疲劳。为了实现上述目的，本发明提供了用于提高AMPK活性的组合物，该组合物含有壳低聚糖作为活性成分。下文中，将更详细地描述本发明。用于本发明的壳低聚糖可以通过下列步骤获得通过磨碎螃蟹、虾等的壳而进行分离和提纯，将磨碎物脱盐，除去蛋白质并除去杂质；对壳聚糖进行脱乙酰化；使用无机酸(如盐酸等)通过化学降解、或者使用酶通过酶降解来水解壳聚糖。尤其是，在使用酶的降解方法中，将壳聚糖加入到净化水中，再加入2-3%的盐酸，将混合物在40-6(TC下搅拌，产生含有固体5-10%和盐酸的壳聚糖分散液。将壳聚糖溶解后，将pH调节至4-6，将溶解在净化水中作为壳聚糖水解的酶的纤维素加入其中。随后，在40-60。C下水解14-20小时，在8(TC下热处理30分钟使水解酶失活，并过滤和干燥，得到壳低聚糖。在所述方法的过程中，壳低聚糖的分子量随着添加纤维素的量而变化。当添加酶的量为壳聚糖的10%时，得到分子量为1000以下的壳低聚糖；当添加酶的量为6%时，分子量为1500-2000;当添加酶的量为3%时，分子量为7000-10000。在本发明中，以所述壳聚糖的重量为基准，所述酶的添加量为3-10%，且获得分子量为700-9000的壳低聚糖。以所述组合物的总重量为基准，所述壳低聚糖的含量优选为10-90重量%。考虑到将组合物配制成片剂或软胶囊时，粉末或功能成分的含量可以为10-60%，将组合物配制成硬胶囊时，粉末或功能成分的含量可以为10-90%，可以提供所述组合物的含量为10-90%的保健功能食品。因此，本发明提供了保健功能食品，该食品含有根据所述方法制备的壳低聚糖。所述保健功能食品包^多种剂型，如粉末、颗粒、片剂、胶囊和饮料。所述食品优选配制成单位剂量，其中，各剂量含有添加剂以及给定的有效成分。而且，还可以根据常规的制备方法进一步与合适的稀释剂、载体或其它赋形剂混合。如果需要，所述保健功能食品可以含有选自下列添加剂中的一种或多种柚子、苹果、橙子、柠檬、菠萝、香蕉、梨等的提取物(可以使用任何一种浓縮的提取物或粉末提取物)；维生素(水溶性或油溶性维生素，如棕榈酸维生素A、维生素B2、维生素B6、维生素B12、抗坏血酸钠、烟酰胺、6泛酸钙、叶酸、生物素、维生素D3、酒石酸氢胆碱(cholinebitartrate)、维生素E、(3-胡萝卜素等)；食用香料(柠檬香料、橙子香料、草莓香料、柚子香料、香草香精等)；氨基酸、核酸和它们的盐(谷氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸钠、肌苷酸等)；植物纤维(聚右旋糖、果胶、黄原胶橡胶(xantanrubber)、葡甘露聚糖、藻酸等)；矿物质(氯化钠、醋酸钠、硫酸镁、氯化钾、氯化镁、碳酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、甘油磷酸钙、柠檬酸铁钠、柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、硫酸锰、硫酸铜、碘化钠、钾溶剂化物、锌、锰、铜、碘、钴(covalt)等)。AMPK激活剂对与脂质代谢有关的酶起作用，并能够促进肝细胞中的能量代谢，因此增加了能量的产生。在需要能量的情况下(如运动时或日常生活中)，增加的能量产生改善了运动能力并减少了疲劳。因此AMPK激活剂可以用于制备作为耐力促进剂或者用于预防和改善疲劳的食品或医药产品。图1为显示了通过给予壳低聚糖，肝细胞内总的AMPK蛋白质和磷-AMPK蛋白质的表达量变化的图。图2为显示了通过给予壳低聚糖，肝细胞内总的ACC蛋白质和磷-ACC蛋白质的表达量变化的图。图3为显示了通过给予壳低聚糖，肝细胞内脂肪酸的氧化程度的图。图4为显示了通过给予壳低聚糖，肝细胞内ATP产生量的变化的图。图5为显示了饮食摄入壳低聚糖后小鼠体内的固定时间(immobilitytime)。具体实施例方式下文中，将参考下列实施例和试验例进一步详细地描述本发明。然而，本发明的范围并不仅限于这些实施例。实施例l:软胶囊的制备将壳低聚糖、维生素E、维生素C、棕榈油、植物硬化油、黄蜂蜡和卵磷脂以下述比例混合80mg的壳低聚糖、9mg的维生素E、9mg的维生素C、2mg的棕榈油、8mg的植物硬化油、4mg的黄蜂蜡和9mg的卵磷脂，并根据常规的方法来制备用于填充软胶囊的液体。关于分离步骤，将66重量份的明胶、24重量份的甘油和10重量份的山梨糖醇液体用于制备软胶囊壳层。用所述液体填充软胶囊，以400mg/胶囊的量含有本发明的组合物。实施例2:片剂的制备将壳低聚糖、维生素E、维生素C、乳低聚糖、乳糖和麦芽糖以下述比例混合80mg的壳低聚糖、9mg的维生素E、9mg的维生素C、200mg的乳低聚糖、60mg的乳糖和140mg的麦芽糖，通过流化床干燥器，使该混合物成为颗粒，随后添加6mg的糖酯。根据常规的方法将504mg的组合物压制成片剂。实施例3:饮料的制备将壳低聚糖、维生素E、维生素C、葡萄糖、柠檬酸和液体低聚糖以下述比例混合80mg的壳低聚糖、9mg的维生素E、9mg的维生素C、10g的葡萄糖、0.6g的柠檬酸和25g的液体低聚糖，接着加入300ml净化水。以200ml/瓶的量将该溶液充填入瓶中，并在13(TC下将充填好的瓶子灭菌4-5秒，以制备饮料。8实施例4:颗粒的制备将壳低聚糖、维生素E、维生素C、无水晶体葡萄糖和淀粉以下述比例混合80mg的壳低聚糖、9mg的维生素E、9mg的维生素C、250mg的无水晶体葡萄糖和550mg的淀粉，通过流化床制粒机将该混合物配制成颗粒，并将颗粒装填入每个包装中。同时，AMPK是在缺乏细胞内能量的状况下激活的酶，并有助于通过多功能的控制代谢而从缺乏能量的状况中恢复。在本发明中，研究了在体外试验和体内试验中，在肝细胞内壳低聚糖对AMPK活性的作用。激活的AMPK使肝细胞内的ACC失活，这降低了ACC代谢物(如丙二酸单酰辅酶A)的浓度，丙二酸单酰辅酶A是肉碱棕榈酰转移酶-l(CPT-l)的有效抑制剂，CPT-1在将脂肪酸输送入线粒体内中起作用。为了研究它，检测了通过添加壳低聚糖引起的ACC的变化。此外，当ACC的活性降低时，则抑制CPT-1的能力降低，因此可以促进脂肪酸的氧化。因此，检测由给予壳低聚糖引起的脂肪酸氧化的程度。另外，AMPK是一种能量传感器酶，因此当由于运动而消耗能量以及ATP/AMP的比例或者磷酸肌酸/肌酸的比例降低时，AMPK阻断ATP的消耗途径，并开启产生ATP的途径。基于此，研究了基于AMPK活性增加的细胞内ATP含量的变化。此外，为了检测壳低聚糖对动物体内能量代谢活性的作用，用壳低聚糖喂食小鼠后，观察运动行为。而且，检测有关疲劳和肝功能的血液指标。体外试验试验例1:壳低聚糖对AMPK活性的作用将分子量为2000和9000的壳低聚糖(100ppm、500ppm)和用AICAR(lmM)处理过的肝细胞(HepG2)加至溶菌缓冲液(50mMTris-HCl、pH7.4、150mMNaCl、0.1%SDS、1.0%TritonX-100、0.25%脱氧胆酸盐、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、lmM苯甲基磺酰氟(PMSF))中，使细胞分裂。将均浆以12000rpm离心分离15分钟，得到蛋白质层。ACC蛋白和p-ACC蛋白的表达程度由蛋白质印迹法来测定。将50吗的蛋白质加样在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳，并将该凝胶转移到硝化纤维膜上。将该膜与封闭液(blockingsolution)(5%脱脂乳、10mMTris、pH7.5、10mMNaCl、0.1%Tween20)反应1小时，以除去非特异性结合，添加AMPK蛋白和p-AMPK蛋白的第一抗体，并在4。C下保持过夜。此后，用封闭液洗涤10分钟三次，向其中添加第二抗体，使它们反应1小时，并按如上所述进行洗涤。添加ECL溶液后，将所述膜暴露在X射线膜上，并测量蛋白质的量。用图象分析仪通过光学密度来计算蛋白质含量的变化。图1显示了用壳低聚糖对肝细胞进行处理并培养时，AMPK蛋白表达量的变化结果。该图显示出，当添加有被称为AMPK激活剂的AICAR时，激活的磷-AMPK的表达增加了两倍以上。通过壳低聚糖也增加了p-AMPK蛋白的表达，并且分子量为2000的壳低聚糖显示出与AICAR相似的活性。在处理组之间，AMPK表达的量没有明显的差别。从上述结果中，可以说明壳低聚糖促进了AMPK的表达。试验例2:壳低聚糖对ACC活性的作用按上述的蛋白质印迹法来检测ACC蛋白和p-ACC蛋白的表达。其结果是，如图2所示，由AICAR和壳低聚糖处理过的ACC蛋白表达的总量没有变化，但由AICAR和壳低聚糖处理的p-ACC蛋白的量具有明显的变化。AICAR使肝细胞内的p-ACC表达的量增至两倍，且由壳低聚糖处理的组也显示出p-ACC表达的增加。基于它的浓度，分子量为2000的壳低聚糖增加了p-ACC的表达，因此100ppm的壳低聚糖显示出与AICAR相似的活性，500ppm的低聚糖提供了比AICAR更高的活性。分子量为9000的壳低聚糖10显示出比分子量为2000的壳低聚糖低的活性，且100ppm的壳低聚糖使p-ACC的表达增至1.5倍。从此结果可以得知，AICAR和壳低聚糖都增加作为ACC失活形式的p-ACC的表达，并因此抑制了乙酰辅酶A向丙二酸单酰辅酶A的转化。这表明壳低聚糖增加了肝细胞内AMPK的活性，并抑制了由AMPK调节的ACC的活性，并因此能够抑制脂肪酸的合成。试验例3:壳低聚糖对脂肪酸氧化的作用为了确定肝细胞内脂肪酸的氧化程度，在96孔板上接种HepG2细胞。在将接种后的板灭菌后，以100和500ppm的浓度添加AICAR和壳低聚糖。培养6小时后，向细胞中添加7ml的化验缓冲液(20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、25mMNaHC03、1.2mMKH2P04、3mM葡萄糖、114mMNaCl、4.7mMKCl、1.2mMMgS04、2.5mMCaCl2、1%无脂肪酸的牛血清白蛋白(ultrafattyacid-freeBSA))，并使它们反应30分钟。然后，将[1-"C]匿棕榈酸盐(3.4pCi;l.O^Ci/nmole)加入其中标记2小时。加入5%的高氯酸来停止反应，并测量辐射量。如图3所示，用AICAR处理的阳性对照组显示了约35%的增加的脂肪酸的氧化；基于壳低聚糖的浓度，使用壳低聚糖处理的组增加了脂肪酸的氧化。可以理解的是，用500ppm的壳低聚糖处理的组所促进的氧化与用AICAR处理的组相似。考虑到由ACC产生的ACC和丙二酸单酰辅酶A被认为抑制了CPT-1的活性，并且CPT-1是涉及脂肪酸氧化的重要的酶，可以看出，ACC失活形式的p-ACC的表达是通过添加壳低聚糖而增加的，因此降低了CPT-1的抑制活性，导致促进了脂肪酸的氧化。试验例4:壳低聚糖对ATP产生的作用通过ATP分析试剂盒检测基于AMPK激活的ATP的产生。将HepG2细胞接种在96孔板上，并将接种后的板灭菌，此后，以5-500ppm的浓度添加AICAR和壳低聚糖。培养24小时后，向各孔内添加通过将底物和缓冲液混合而制得的试剂，并使它们在室温下反应30分钟。通过在定轨振荡器(orbitalshaker)中，将它们混合使细胞分裂，在灭菌10分钟后，对发光进行检测。其结果是，称作AMPK激活剂的AICAR使ATP的产生增至两倍。ATP的产生也可以通过基于它的浓度的壳低聚糖而增加，而且当用500ppm的壳低聚糖处理它们时，ATP的产生增至1.5倍，这表明通过壳低聚糖肝细胞内的能量代谢被激活。体内试验参考例l:试验动物和试验方法购买三周年龄的无毛小鼠，并分成10只小鼠/笼。为了使在强迫游泳试验中鼠毛的影响最小化，使用无毛的小鼠。它们可以自由地摄入食物和水，保持在22土rC的温度和60土5。/。的湿度。以12小时的间隔，改变黑暗与明亮。将实验动物分成运动组和非运动组(见表1)，并分析单独喂食或喂食后运动的变化。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>对于试验组，给予含有试验物质的食物4周。对于非运动组，给予4周后，对血液和组织进行化验，对于运动组，通过进行游泳运动(两次/周)4周来训练小鼠适应。给予4周后，进行强迫游泳试验，并在强迫游泳后对得到的血液和组织进行分析。参考例2:食物的组成在食物中，试验物质壳低聚糖的含量为0.5%。提供4周的常规喂食/试验喂食。食物的组成如表2所示，通过添加玉米淀粉来调节由添加壳低聚糖而产生的重量差异。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>试验例5:运动组中对小鼠的抗疲劳的作用一强迫游泳试验(FST)FST是通常用于动物以测定衰弱程度的方法，并已应用于临床前期的试验。而且，该试验已应用于证明某些物质对抗疲劳和耐力的作用的方法(KooHN等，BiolPharmBull,27，117-119,2004;ShinHY等，BiolPharmBull,27,1521-1526，2004)。FST中，在6分钟内检测小鼠固定不动的持续时间。将两个不透明玻璃圆筒(高度25cm;直径10cm)装水至高度为10cm，使两只小鼠进行试验。稳定2分钟后，在后续的4分钟内记录固定不动的持续时间。当头部浮在水面以上而不活动时，认为小鼠是固定不动的。如图5所示，与对照组(161±46秒)相比，在壳低聚糖处理的组中固定不动的持续时间显著减少(128±42秒，124±49秒)。在用分子量为2000的壳低聚糖处理的组中的作用与用分子量为9000的壳低聚糖处理的组中的作用相似。这表明，通过给予壳低聚糖，影响了小鼠体内有关疲劳的代谢和生物系统。试验例6:血液指标的变化用壳低聚糖喂养的4周期间，使小鼠在第二周、第三周和第四周适应性游泳10分钟(两次/周)。4周后，在相同条件下强迫小鼠游泳80分钟，然后进行安乐死以抽血。在非运动组中，在4周喂养后立刻抽血。已知，血液中的酶如LDH等由过度运动引起的压力而变化，并且由于压力引起的血液内皮质类固醇的增加影响了脂质代谢。基于这种认识，从血液中分离出血清后，检测谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、乳酸脱氢酶(LDH)、游离脂肪酸和总胆固醇。结果示于表3和表4。表3非运动组中的血液分析血清GOTGPTLDHFFA总胆固醇非运动组161.9±39.4145.7±75.7964.7±189.94396.7±827.8153.7±21.2非运动组-壳2000186.3±74.3164.5±82.1923.3±198,34396.5±690,1168.2±14.8非运动组-壳9000166.3±23.6122.2±99.7908.0±507.04946.1±265.4176.5±30.714表4运动组中的血液分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表3所示，在给予壳低聚糖的非运动组中，血清中的GPT和LDH水平有降低的倾向。与非运动对照组相比，在喂食壳低聚糖后强迫小鼠游泳时，GOT和LDH水平有提高的倾向。然而，在给予壳低聚糖9000的组中，个体之间在GOT、GPT和LDH的水平上的变化减少，并且平均值降低至正常水平。通过运动的能量消耗，血液中脂肪酸的值显著降低。此外，在给予壳低聚糖9000的组中，脂肪酸和胆固醇的含量与对照组中的相比显著降低。这表明壳低聚糖有效地改善了血液中脂质的代谢效率、并抑制了由运动引起的疲劳，并且提示出，分子量为9000的壳低聚糖更为有效。工业实用性通过AMPK激活而增加了能量的产生，因此，在需要能量的情况下(如运动或在日常生活中)增加能量的产生，使运动能力得到改善并降低了疲劳。因此，可以开发出含有壳低聚糖的用于促进AMPK活性的组合物，来提供作为耐力促进剂的或用于预防和改善疲劳的食品或医药产品。权利要求1、一种用于增强AMPK活性的组合物，该组合物含有壳低聚糖作为活性成分。2、根据权利要求1所述的组合物，其中，以该组合物的总重量为基准，所述壳低聚糖的含量为10-90重量％。3、根据权利要求1所述的组合物，其中，所述壳低聚糖的分子量为700-9000。4、根据权利要求1所述的组合物，其中，该组合物能够抑制ACC活性并促进脂肪酸的氧化。5、根据权利要求1所述的组合物，其中，该组合物能够增强肝细胞内的能量代谢。6、一种保健食品组合物，该保健食品组合物含有权利要求1-5中的任意一项所述的组合物。7、含有壳低聚糖的组合物在增强AMPK活性中的应用。8、含有壳低聚糖的组合物在改善疲劳的恢复中的应用。全文摘要本文公开了一种用于增强AMPK活性的组合物，该组合物含有壳低聚糖作为活性成分。本发明的组合物对AMPK和与脂质代谢有关的酶有影响，因此有助于通过多功能的控制代谢而从缺乏能量的状况中恢复。因此，本发明的组合物可以促进能量代谢，从而使该组合物能够有效地改善运动能力并降低疲劳。本发明的组合物可以用于制备作为耐力促进剂或者用于预防和改善疲劳的食品或医药产品。文档编号A61K31/716GK101534841SQ200780042346公开日2009年9月16日申请日期2007年10月23日优先权日2006年11月30日发明者孙钟熙,徐大方,李尚骏,李明和,申宜锡,赵南勋,金完起申请人:株式会社太平洋