专利名称：作为传染性病原体或毒素相关疾病的疫苗佐剂的细胞外基质材料的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及包含佐剂的疫苗，并涉及单独的佐剂。特别地，本发明涉及至少部 分地从生物组织诸如细胞外基质、特别是从小肠组织(SIS)由来或获得的佐剂。本发明还 涉及使用包含组织由来的佐剂的疫苗制剂使动物对传染性病原体相关疾病、由所述病原体 引起的感染或毒素免疫的方法。本发明还涉及制备佐剂的方法领域，提供了从小肠组织制 备用作疫苗的一部分的佐剂的方法以使动物对传染剂相关疾病免疫，特别提供了作为用于 治疗和/或预防破伤风的疫苗以使动物对破伤风免疫。
背景技术：
氢氧化铝和磷酸铝(一起被称为明矾)在人用疫苗和兽用疫苗中通常被用作佐剂 (1)。明矾在增加抗体对白喉和破伤风毒素的应答方面的效力被充分确立(2)以及已经使 用明矾来辅佐乙型肝炎病毒抗原疫苗(3)。尽管明矾的有用性在一些应用中被充分确立，但 是明矾具有局限性。例如，明矾是差的Thl细胞免疫应答诱导物，并剌激抗体的产生，这与 Th2细胞免疫应答是一致的(4-6)。令人遗憾地是，基于Th2的免疫应答不可能为几种重要 的传染病(包括肺结核(TB)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)在内)提供 最佳抵御。明矾用于流感接种的有效性差并且缺乏一致性地引发由细胞介导的免疫应答。 在小鼠中，由明矾辅佐型抗原激发的抗体主要是IgGl同种型，其是一些疫苗剂用于抵御的 最佳选择。 破伤风是重要的人病和兽疫，其以痛苦的、非受控的肌肉痉挛以及由呼吸肌麻痹 所致的死亡为特征。该疾病与感染破伤风杆菌(Clostridium tetani)有关并且一般采用预防接种。破伤风疫苗典型地使用明矾作为佐剂。 在医学领域仍然需要可被用来增强和/或改善现有的临床备选方案以治疗和预 防传染剂和毒素相关疾病的材料，例如用于改善现有形式的破伤风治疗疫苗和具有改善的 免疫原性的破伤风疫苗佐剂。
发明概述 通过本发明人对由细胞外基质材料(ECM)制备物诸如从小肠粘膜下层(SIS)分离 的基质所激发的强大的炎性应答的认识，部分地开发了本发明。尽管不受任何特定作用机 理的限制，细胞外基质材料似乎特别地通过其对促炎物质的贡献而提供强大的炎性应答， 所述促炎物质驱动对与其一起被给予的抗原性物质的免疫应答。本发明在设计具有免疫效 力的传染剂疫苗制剂和传染剂佐剂中利用ECM诸如SIS以及来自其它形式的ECM的制备物 的炎性激发活性。 使用ECM及其类似材料制备传染剂疫苗制剂的工艺可与许多不同的传染性病原 体或生物毒素组合使用。例如，在一些实施方案中，生物毒素是破伤风毒素。另外，例如，在 一些实施方案中，生物毒素是蓖麻毒蛋白。 本发明在其特别地牵涉三维细胞外基质材料的改性和使用及其改性制备物以提 供疫苗方面是独特的。例如，在一些实施方案中，疫苗是破伤风疫苗。因此，本发明在一些 实施方案中提供了包含具有可接受的生物适合性的佐剂材料的高度改善的传染剂制备物。
ECM诸如SIS佐剂制备物的佐剂效果延伸到被给予以抵御传染性病原体或生物毒 素相关疾病的疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了包含SIS凝胶或粒状SIS的佐剂。与 破伤风类毒素一起被给予后，这些制剂赋予用破伤风毒素攻击的动物以体内保护性免疫。
传染剂佐剂 在一个方面，本发明提供了作为传染剂疫苗佐剂的细胞外基质(ECM)材料，诸如 SIS的改性制备物。在一些实施方案中，这些制备物可被描述为基本上不含明矾。在一些实 施方案中，ECM材料可被描述为是(稀释)约2倍到约20倍的SIS的改性制备物。
传染剂疫苗 在另一个方面，本发明提供了包含细胞外基质材料的制备物和传染性病原体的抗 原制备物的传染剂疫苗。 在本发明的一个方面，提供了包含以细胞外基质材料(ECM)为特征的免疫原性增 强制备物的佐剂组合物，特别是包含来自小肠粘膜(SIS)或肾囊材料(RCM)的细胞外基质 的制备物的佐剂组合物。在具体的实施方案中，包含细胞外基质材料的佐剂组合物包含小 肠粘膜组织制备物。在一些实施方案中，佐剂组合物包含l份细胞外基质材料(ECM)和9 份药学可接受的载体溶液。例如，这种载体是无菌盐水。 根据另一个方面，提供了包含佐剂和所关心的抗原的组合物。在一些实施方案中， 抗原是类毒素抗原。在一些实施方案中，疫苗可被描述为是抵御传染性病原体的疫苗，所述 传染性病原体为诸如破伤风疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗、病毒性肝炎疫苗、白喉疫苗、炭疽 疫苗、链球菌(Str印tococcus)肺炎感染疫苗、疟疾疫苗、利什曼病(leishmaniasis)疫苗 或葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素B中毒疫苗。
生物毒素 可用于本发明的疫苗制剂中的生物毒素的实例如下被提供
5
相思豆毒蛋白黄曲霉毒素肉毒毒素产气荚膜梭菌e毒素芋螺毒素蛇形菌素蓖麻毒蛋白蛤蚌毒素志贺菌毒素葡萄球菌肠毒素河飩毒素T-2毒素白喉毒素链球菌毒素霍乱毒素百日咳毒素肺炎球菌溶血素。在具体的实施方案中，疫苗可被描述为是抵御与生物毒素诸如蓖麻毒蛋白有关的
疾病的疫苗。 朊病毒相关疾病 在一些实施方案中，本发明提供了适合与朊病毒相关疾病组合使用的佐剂制备 物。例如，这些朊病毒相关疾病包括所有被分成以下类别的那些，传染性海绵状脑病、牛海 绵状脑病、羊瘙痒病、鹿慢性消耗性疾病和克_雅病。 在其它实施方案中，本发明可被描述为提供了抵御与病毒感染有关的疾病的疫 苗。例如，本发明的疫苗可经过配制以提供可用于治疗和/或预防与流感、狂犬病和病毒性 肝炎有关的病毒感染的组合物。 在其它实施方案中，本发明可被描述为提供了抵御与细菌感染有关的疾病的疫
苗。例如，本发明的疫苗可经过配制以提供可用于治疗和/或预防与诸如白喉、炭疽、脓毒 病、肺炎、中耳炎和脑膜炎的疾病有关的细菌感染的组合物。 在其它实施方案中，本发明可被描述为提供了抵御与寄生感染有关的疾病的疫 苗。例如，本发明的疫苗可经过配制以提供可用于治疗和/或预防与疟疾和利什曼病有关 的寄生感染的组合物。 在其它实施方案中，本发明可被描述为提供了抵御与暴露于生物毒素下有关的病 害和/或疾病的疫苗。例如，本发明的疫苗可经过配制以提供可用于治疗和/或预防与暴 露于生物毒素诸如蓖麻毒蛋白(其引起呼吸困难)下或暴露于葡萄球菌肠毒素B(SEB)(其 导致食物中毒)下有关的病害的组合物。
制备佐剂和疫苗的方法 在另一个方面，本发明提供了用于制备传染剂疫苗的方法。在一些实施方案中，所 述方法包括制备抵御如上文所述的传染剂和生物毒素的接种用佐剂，和将该佐剂与所关心
6的免疫抗原组合。在一些实施方案中，所关心的抗原是破伤风类毒素制备物。 预防、治疗、抑制传染性病原体和/或使动物对传染性病原体免疫的方法 根据本发明的又一个广泛的方面，提供了治疗具有与暴露于传染性病原体下有关
的疾病或病害或处在接触该疾病或病害的风险下的动物的方法。例如，与暴露于传染性病
原体有关的疾病包括破伤风、疟疾、白喉、炭疽、脓毒病、肺炎、中耳炎和脑膜炎。在一些实施
方案中，本发明提供了使动物对破伤风免疫的方法。在又一个实施方案中，本发明提供了抑
制破伤风的严重程度和/或完全预防破伤风的发病的方法。 临床的传染性病原体治疗制剂 在又一个方面，本发明提供了一些独特的传染性病原体治疗制剂。这些传染剂治 疗制剂可为与所关心的适当的抗原相组合的适用于非肠道给药的凝胶、片状物或可注射制
剂的形式。
以下縮写在本发明的通篇说明书中被使用。ECM-细胞外基质；HCV-丙型肝炎病毒；HIV-人类免疫缺陷病毒歉SIS-小肠粘膜下层；TB-肺结核。
图1 ，根据本发明的一些实施方案，代表在大鼠中在手术移植后28天的SIS细胞外 基质材料的剩余。剩余的生物材料被具有偶见的淋巴细胞的巨噬细胞所包围。用H&E，400X 染色。 图2，根据本发明的一些实施方案，代表在经历提前7天使用RCM进行跟腱缺损修 复的大鼠中，在植入物/跟腱表面的接触面处单核炎症的病灶。用H&E，200X染色。
图3，根据本发明的一些实施方案，代表在每只小鼠用lng破伤风毒素进行腹膜内 攻击后，用0.03微克破伤风类毒素进行接种的小鼠的存活数据。处理组未经处理(无)； SIS凝胶(SG) ;SIS粒子(SP);破伤风类毒素(TT) ;TT+明矾(TT/明矾);TT+SIS凝胶(TT/ SG);和TT+SIS粒子(TT/SP)。每组由15只小鼠组成。所有未经处理的小鼠或仅仅用SIS 凝胶或SIS粒子进行接种的小鼠都死亡；六只用无佐剂的破伤风类毒素进行接种的小鼠存 活，并且所有用在明矾、SIS凝胶或SIS粒子中的破伤风类毒素进行接种的小鼠都存活。其 表示在后三组中存活的小鼠数与所有其它组相比显著(P《0. 001)增加。
图4，根据本发明的一些实施方案，代表在每只小鼠用lng破伤风毒素进行腹膜内 攻击后，用0.05微克破伤风类毒素进行接种的小鼠的存活数据。处理组未经处理(无)； SIS凝胶(SG) ;SIS粒子(SP);破伤风类毒素(TT) ;TT+明矾(TT/明矾)；TT+SIS凝胶(TT/ SG);和TT+SIS粒子(TT/SP)。每组由15只小鼠组成。所有未经处理的小鼠或仅仅用SIS 凝胶或SIS粒子进行接种的小鼠都死亡；八只用无佐剂的破伤风类毒素进行接种的小鼠存 活，并且所有用在明矾、SIS凝胶或SIS粒子中的破伤风类毒素进行接种的小鼠都存活。其 表示在后三组中存活的小鼠数与所有其它组相比显著(P《0. 001)增加。
发明详述 在描述本发明之前定义几个术语是有利的。可理解以下定义在本申请中通篇被使 用。 定义 当术语的定义偏离术语的常用含义时，除非特别指明，否则申请人意在采用以下 所提供的定义。 为了本发明的目的，术语"佐剂"被定义为是增强对抗原的免疫应答的物质。
为了本发明的目的，术语"辅佐能力(adjuvancy)"被定义为是试剂增强和/或促 进动物对特定抗原的免疫应答的能力。 为了本发明的目的，术语"生物合成材料"被定义为是部分地或全部由生物组织制 成或部分地或全部来自生物组织的材料。 为了本发明的目的，术语"生物组织"被定义为是包括人在内的动物组织或植物材 料，该植物材料作为或曾经作为活组织或有机物的一部分(例如尸体组织)。
为了本发明的目的，术语"细胞外基质"被定义为是来自能够支持细胞生长或细胞 培养的、经过衍生化的或生物合成的材料。 为了本发明的目的，术语"传染剂"被定义为是任何能够在人或动物感染或分泌物
质诸如产生一种或多种毒素后引发疾病的细菌、病毒、朊病毒或寄生物质。该术语还包括这
些传染剂的有毒产物。例如，这些传染剂包括肉毒杆菌，破伤风的病原体。 为了本发明的目的，术语"生物毒素"是由活细胞或有机体产生并且当被引入体组
织时能够引发疾病的有毒物质、特别是蛋白质，诸如蓖麻毒蛋白或葡萄球菌肠毒素B和破
伤风毒素。 为了本发明的目的，术语"致免疫量"是在动物中引发临床上可检测的保护性应答 的所关心的传染性病原体抗原制备物的量或生物毒素的量。例如，在动物中的临床上可检 测的保护性应答可以是在动物中对传染性病原体抗原或生物毒素是特异性的抗体滴度升高。 说明 提供了一种用于提供具有增强的用于抑制和抵御传染性病原体的活性的制剂的 方法。在具体实施方案中，传染性病原体是破伤风。 还提供了一种用于治疗和/或抑制由传染性病原体引起的感染的方法。在一些实 施方案中，该方法采用包括疫苗的组合物，该疫苗包含以细胞外基质(ECM)材料为特征的 促炎物质选单的佐剂和与传染性病原体或生物毒素有关的抗原。在治疗和/或预防传染性 病原体或生物毒素诸如破伤风中，发现这些制备物比使用单独的传染性病原体抗原或生物 毒素抗原疫苗具有更大的免疫原性。 对所述破伤风疫苗的免疫应答通过使用作为佐剂的SIS得以增强。
本发明的描述通过以下的各个实施例进行强化。 实施例1-作为抵御传染性病原体相关疾病的疫苗的佐剂的ECM的材料和方法
本实施例提供了可用于实践本发明的材料和方法的一些实施例。
小肠粘膜下层(SIS) 小肠粘膜下层(SIS)得自Cook Biotech, Inc. (West Lafayette, IN)。实验级材料被提供用在本发明对SIS制备物的研究中，该SIS制备物据述通过收获猪空肠并将10-20 厘米长度放置在盐水溶液中被制备(31-33)。在除去所有系膜组织后，将空肠段外翻，并使 用手术刀把柄和湿润的纱布进行纵向擦拭动作将粘膜擦去。然后使用相同过程轻轻除去浆 膜和肌织膜。用过氧乙酸将剩余的组织进行消毒处理，用高纯度水彻底冲洗，并使用环氧乙 烷进行灭菌处理。SIS粒子由Cook Biotech, Inc. (West Lafayette, IN)提供并且是经过 研磨和过筛的SIS材料。粒子大小为45微米到335微米。SIS凝胶由Cook Biotech, Inc. (West Lafayette, IN)提供并且经过酸消解和纯化方法从SIS材料生产。
破伤风毒素和破伤风类毒素 破伤风毒素和破伤风类毒素购自List Biological Laboratories (Campbell, CA)。 明石凡 明砜作为Alhydrogel ,氢氧化铝凝胶佐剂(Brenntak Biosector， Frederikss皿d， Denmark)被购得。
动物(小鼠)-统计分析 在用破伤风毒素攻击之后，使用具有两个自由度的卡方检验，比较组之间的存活 数非存活数的结果。当P《0. 001时被认为差异具有显著性。
实施例2-在破伤风的抑制中使用佐剂 为了确定SIS是否可以担当抵御传染性病原体或生物毒素相关疾病的疫苗的佐 剂，使用破伤风类毒素(一种灭活形式的破伤风毒素)生产制剂。从一片单层SIS生产的 凝胶SIS和SIS粒子都作为佐剂进行评价。简而言之，对15只Balb/C雌性小鼠(Harlan， Inc. ， Indianapolis, IN)的组最初进行接种(0. lml体积/剂量)并在五周后再次接种以 下之一 粒状SIS
凝胶SIS 破伤风类毒素(TT ;0. 03微克/剂量)
TT (0. 05微克/剂量) TT (0. 03微克/剂量)+明砜(alhydrogel) TT (0. 05微克/剂量)+明砜(alhydrogel) TT(O. 03微克/剂量)+粒状SIS TT(O. 05微克/剂量)+粒状SIS TT (0. 03微克/剂量)+凝胶SIS TT(O. 05微克/剂量)+凝胶SIS 未经处理的对照组 在第二次接种后的五周，通过腹膜内给予在0. 2毫升无菌盐水中的致死剂量的破 伤风毒素(lng/小鼠)对小鼠进行攻击。然后在随后96小时内观察小鼠并记录每组的存 活小鼠数。 该研究的结果如下所示 处理组 在第96小时的存活数/总数
未经处理 0/15:0107] 凝胶SIS 0/15
:0108] 粒状SIS 0/15
:O109] 破伤风类毒素(TT ;0. 03微克/剂量) 6/15
:0110] TT(0.05微克/剂量) 8/15
:0111] 17(0.03微克/剂量)+明砜(alhydrogel) 15/15
:0112] 17(0.05微克/剂量)+明砜(alhydrogel) 15/15
:0113] TT(0.03微克/剂量)+粒状SIS 15/15
:0114] TT(0.05微克/剂量)+粒状SIS 15/15
:0115] TT(0.03微克/剂量)+凝胶SIS 15/15
:0116] TT(0.05微克/剂量)+凝胶SIS 15/15 给予0. 03或0. 05微克/剂量的在alhydrogel、 SIS凝胶或者粒状SIS中的破伤
风类毒进行接种的组中用破伤风毒素进行攻击后存活小鼠数显著高于其它接种组。 这些结果显示了粒状SIS和凝胶SIS 二者都可担当抵御传染性病原体相关疾病诸
如破伤风的疫苗的佐剂。 实施例3-示例性的传染性病原体 本实施例阐明了本发明在多种传染性病原体和生物毒素相关疾病中的实用性，所 述疾病非限制性地包括例如破伤风、流感、狂犬病、病毒性肝炎、白喉、炭疽、肺炎链球菌感 染、疟疾、利什曼病、蓖麻毒蛋白中毒和葡萄球菌肠毒素B中毒。
0121]表2:常见人用疫苗的分类
0122]疾病或病原体疫苗类型
0123]全生物
0124]细菌细胞
0125]霍乱灭活
0126]瘟疫灭活
0127]肺结核减活BCG+
0128]伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)减活
0129]病毒颗粒
0130]流感灭活
0131]麻疹减活
0132]腮腺炎减活
0133]风疹减活
0134]脊髓灰质炎(Sabin/OPV)减活
0135]脊髓灰质炎(Salk/IPV)灭活
0136]带状疱疹病毒(V. zoster)减活
0137]黄热病减活
0138]+卡介苗(BCG)是牛结核杆菌(Mycobacterium bovis)的抗病毒株。疫苗类型 ](纯化的)大分子
0140]类毒素
0141]白喉灭活外毒素:0142] :0143] :0144] :0145] :0146] :0147] :0148] :0149]
:0150] :0151]
破伤风 灭活外毒素 非细胞百日咳 灭活外毒素
荚膜多糖
流感嗜血杆菌b 多糖+蛋白质载体
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningidis) 多糖 月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) 23个不同的荚膜
表面抗原
乙型肝炎 重组表面抗原
(HbsAg) 用于病毒感染相关疾病的疫苗 1.流感-流感是由感染流感病毒引起的急性发热性呼吸道疾病。目前的流感疫 苗使用铝佐剂。为了增强疫苗的效力，已经考察了几种佐剂。例如，已报道水包油型乳液 MF59改善疫苗的免疫性(Higgins (1996)1 ;Martin (1997) 2)，尽管在老年人中尚未完全地解 决流感疫苗的低效力问题(Banzhoff(2003)3)。合成肽，GK1，来自肥头绦虫囊尾蚴(Taenia crassic印s cysticerci)，据报道在年幼的和年老的小鼠中都增强伴随流感接种的免疫应 答(Segura-Velasquez(2006)4)，但是未公开人的试验。 作为本发明的一部分，可提供流感疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作为 疫苗佐剂和免疫有效量的流感抗原。例如，这种流感抗原可包括目前的H5N1 (红细胞凝集 素[HA]亚型1 ;神经氨糖酸苷酶[NA]亚型1)和H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗 原的流感病毒组合。这种制备物和其它的抗原制备物描述在Palese(2006)33中。该篇文章 和所有其教导作为参考并入本文。 2.狂犬病-狂犬病是由感染狂犬病病毒引起的毁灭性的神经系统疾病。针对 狂犬病进行的接种典型地采用灭活病毒和铝佐剂。当与使用铝盐佐剂进行接种相比较 时，基于角鲨烯的水包油型的类脂佐剂显著增加小鼠对使用灭活病毒疫苗进行接种时的 免疫应答(Suli，2004)。基于提取自龟分支杆菌(Mycobacterium cheloniae)的糖脂质 (glycop印tidolipids)的佐剂增强了用灭活狂犬病病毒疫苗进行接种的小鼠的免疫应答 (de Souza Matos (2000) 6)。 作为本发明的一部分，可提供狂犬病疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作 为疫苗佐剂和免疫有效量的狂犬病抗原。例如，狂犬病抗原可包含灭活狂犬病病毒。可用 于本发明制剂中的灭活狂犬病病毒疫苗的一个实例在de Souza Matos (2000)6中描述。
3.病毒性肝炎-病毒性肝炎，特别是由乙型肝炎病毒引起的病毒性肝炎，是在全 世界范围内影响30000万人的严重的健康问题。接种为有效性预防提供了希望。病毒的肽 表位当与作为佐剂的得自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的热休克蛋白70 融合时剌激显著的免疫应答(Peng (2006) 7)。非甲基化CpG 二核苷酸在老龄化小鼠中有效 作为乙型肝炎抗原的佐剂(Qin(2004)8);并且由乙型肝炎病毒抗原和免疫剌激性DNA序列 组成的疫苗处于人类临床试验阶段(S皿g(2006)9)。在开发鼻内疫苗中，显示了含有脱乙酰 壳多糖的DL-丙交酯/乙交酯共聚物微球体是用于基于重组乙型肝炎表面蛋白的疫苗的有 效佐剂(Jaganathan (2006) 10)。
作为本发明的一部分，可提供病毒性肝炎疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材
料作为疫苗佐剂和免疫有效量的病毒性肝炎抗原。例如，这种肝炎抗原可包括重组乙型肝
炎表面蛋白。例如，这种乙型肝炎表面蛋白抗原在Jaganathan (2006)10中被描述，该参考文
献作为参考并入本文。 用于细菌感染相关疾病的疫苗 1.白喉_以乏力、虚弱和发热为特征的呼吸道疾病，白喉由感染白喉棒杆菌 (Corynebacterium diphtheriae)所致，白喉棒杆菌是产生的毒素由身体进行血液传送 的细菌。针对白喉的免疫接种经常与针对破伤风和百日咳的免疫法相结合；这些疫苗典 型地包含铝盐佐剂(Sugai(2005)11)。非甲基化CpG二核苷酸在白喉-破伤风-百日咳 菌苗中有效用作佐剂并且在经过腹膜内免疫的小鼠中使免疫应答移向由细胞介导的免 疫(Sugai(2005)11)。减少与由白喉类毒素、破伤风类毒素和纯化的百日咳博德特氏菌 (Bordetella pertussis)抗原(包括百日咳类毒素在内)组成的疫苗的铝盐佐剂有关的 有害的副作用的试验表明，降低疫苗中的铝盐含量导致对相关抗原的几何平均抗体浓度降 低，但是不导致局部的或总体的副作用降低(Theeten(2005)12)。单膦酰脂肪A在小鼠中表 现为有效充当小鼠的白喉毒素的佐剂(Caglar (2005) 13)。 作为本发明的一部分，可提供白喉疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作为 疫苗佐剂和免疫有效量的白喉抗原。例如，白喉抗原可包括白喉类毒素。可用于实践本发 明的白喉类毒素的一个实例在Theeten (2005)12中描述。 2.炭疽-炭疽是由细菌炭疽杆菌(Bacillis anthracis)引起的疾病。具体地 说，该细菌产生的毒素导致淋巴结出血性坏死、血原性扩散、休克和死亡。包含该毒素的 一个亚单位(保护性抗原)的疫苗显示当其与通过肌内或鼻内途径被给予的微粒佐剂组 合使用时对小鼠有保护作用(Flick-Smith(2002)14。另外，接种使小鼠避免感染炭疽杆菌 (B.anthracis)孢子。尽管在美国，使用铝盐作为佐剂并吸附炭疽的疫苗是唯一被许可的 炭疽疫苗，但是，存在主要缺点，包括非常冗长的和复杂的剂量给药过程，然后每年进行加 强注射。另外，炭疽疫苗的铝佐剂与参加1991战争的退伍军人中的海湾战争病(Gulf War Illness)有关(Petrik(2007))15。 作为本发明的一部分，可提供炭疽疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作为 疫苗佐剂和免疫有效量的炭疽抗原。例如，这种炭疽抗原可包含炭疽杆菌细菌的一个亚单 位(保护性抗原)。 一个这种具体的抗原性亚单位在Flick-Smith (2002)14中描述。
3.肺炎链球菌_ 一种对老年人和年轻的成人具有特别重要性的细菌性病原体， 肺炎链球菌引起包括脓毒病和肺炎、中耳炎和脑膜炎在内的疾病。疫苗典型地牵涉将肺炎 链球菌抗原吸附到铝盐佐剂上，并且降低的铝盐含量导致肺炎链球菌疫苗的免疫原性降 低(Levesque(2006)16。在人类试验中，IL-12不能改善对肺炎球菌多糖疫苗的免疫应答； 并且IL-12与人中的高发的局部副作用和系统副作用有关(Hedl皿d(2002)17。针对肺炎 链球菌的鼻内免疫接种表明是一种有效预防感染和疾病的方法，使用非甲基化CpG二核 苷酸充当用于鼻内给药的多糖-蛋白质缀合物疫苗的有效佐剂(Sen(2006) 18)。同样地， IL-12和霍乱菌毒素的B-亚单位二者都显示增强鼻内给药的肺炎链球菌抗原制备物的效 力(Sabirov(2006)19 ;Pimenta (2006) 20)。 作为本发明的一部分，可提供肺炎疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作为疫苗佐剂和免疫有效量的肺炎球菌抗原。例如，这种肺炎球菌抗原可包括肺炎球菌多糖抗 原。 一种形式的肺炎球菌多糖抗原在Hedhmd(2002)"中描述。该肺炎球菌抗原可在疫苗 制剂中用作与本文所述的佐剂结合使用的部分。
用于寄生感染相关疾病的疫苗 1.疟疾-疟疾每年在全世界影响数百万人，l-2百万人死于由恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)引起的疾病。因此，对预防措施的需要导致对抗症疫苗具有 较大的兴趣。顶膜抗原(一种疟疾疫苗候选物)据报道由于铝盐佐剂Alhydrogel (HC1 Biosector， Denmark)而具有增强的免疫原性；并且这一佐剂效果通过包含佐剂CpG寡脱 氧核糖核苷酸被进一步增强，并使Thl应答移向混合的Thl/Th2应答(Mullen(2006)21)。 Alhydrogel和Montanide ISA 720 (S印pic， France)在恒河猴中作为基于得自恶性症原虫 环子孢子蛋白的保护性表位的疫苗的佐剂进行比较。尽管Montanide ISA 720诱导优异 的免疫应答，但是在注射部位处形成无菌的脓肿被认为是主要缺点(Langermans(2005)22)。 在恒河猴中使用环子孢子蛋白进行的其它研究表明一些新型的水包油型佐剂与免疫剌 激剂3-脱乙酰化单磷酰脂肪A (3D-MPL)和皂草苷皂树肥皂草21 (s即onin Qui 1 laja s即onaria 21) (QS21)的组分是安全的并剌激改善的抗体应答(Stewart (2006) 23)。 一些 这些相同的水包油型佐剂改善了对由恶性疟原虫抗原肝期抗原-1组成的疫苗的免疫应答 (Brando (2006) 24)。 作为本发明的一部分，可提供疟疾疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作为 疫苗佐剂和免疫有效量的疟疾抗原。例如，这种疟疾抗原可包括恶性疟原虫抗原肝期抗 原-1。这一抗原在Brando (2006)24中被详细描述，该文章作为参考被特别地并入本文。该 抗原可与本文所述的作为佐剂的细胞外基质材料组合使用以提供本文所述的抗疟疾疫苗。
2.利什曼病-利什曼病是由来自利什曼原虫的寄生虫物质引起的感染相关的寄 生性疾病。广谱的临床疾病形式可由感染引起，从皮肤病变到致命的内脏形式不等。因为 缺乏有效的无毒的治疗，已进行大量的努力来开发疫苗。基于寄生虫的DNA的疫苗已显示 诱导部分保护；磷酸铝佐剂对这一疫苗的体液应答没有效果，但是据报道在小鼠模型中轻 微增加细胞免疫应答和预防感染(Rosado-Vallado(2005)25)。在使用可溶性利什曼原虫抗 原和明矾以及IL-12作为佐剂的恒河猴中进行评估时，表明所述佐剂改善保护性免疫，尽 管在皮下注射部位处形成瞬时的小结(Ke皿ey(1999)26)。 CpG寡脱氧核糖核苷酸充当由单 独的活的非减活硕大利什曼原虫(L. major)有机物或其与热杀灭的硕大利什曼原虫前鞭 毛体的溶解产物组合组成的疫苗(不结合或结合明矾)的有效佐剂(Mendez (2003)27)。剌 激了部分的保护性免疫，但是接受包含明矾的疫苗的小鼠发展为较大的皮肤病变，其需要
长达io周被治愈。 作为本发明的一部分，可提供抗寄生感染相关疾病的疫苗，其包含作为疫苗佐剂 的细胞外基质材料与免疫有效量的利什曼病抗原或任何上述的其它抗原性物质。例如，利 什曼病抗原可包括在Kenny (1999)26中被详细描述的利什曼病抗原，该文章作为参考被特 别地引入本文。 用于生物毒素相关疾病的疫苗 1.蓖麻毒蛋白-蓖麻毒蛋白是由蓖麻子植物篦麻(Rici皿scomm皿is)的种子自然 产生的毒素。当人或动物暴露于该毒素下时，可发生严重的呼吸困难和死亡。因为蓖麻毒蛋
13白的效力以及可通过气雾剂、摄取或注射被给药，因此蓖麻毒蛋白被认为是强力的生物武器。尽管目前没有经过批准的用于蓖麻毒蛋白的商业疫苗，但是在人的前导试验中考察了蓖麻毒蛋白的亚单位之一的重组无毒形式的使用(Vitetta(2006)28)。该制剂在无佐剂条件下被给予并在一些供试体中产生蓖麻毒蛋白中和抗体，特别是在较高剂量下。然而，所有的剂量组被发现导致显著的副作用，包括肌痛和头痛在内。通过脂质体包封进行辅佐的蓖麻毒蛋白类毒素被发现当在气管内被给予时比使用铝盐佐剂进行辅佐的疫苗相比诱导更强大的免疫应答(Griffiths (1997)29)。由脱糖基化链A蓖麻毒蛋白(DCAR)和佐剂LTR72 (大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的热不稳定的肠毒素的突变株)组成的疫苗，导致被接种的小鼠对蓖麻毒蛋白发生更强大的抗体反应，但是当用蓖麻毒蛋白进行攻击时不导致对肺损伤的预防有所改善(Kende(2006)30)。 作为本发明的一部分，可提供抗蓖麻毒蛋白疫苗，其包含本文所述的细胞外基质材料作为疫苗佐剂和免疫有效量的蓖麻毒蛋白类毒素抗原。例如，这种蓖麻毒蛋白类毒素抗原在Griffiths (1997)29中被详细描述，该文章作为参考被特别地并入本文。
2.葡萄球菌肠毒素B (SEB) -SEB由细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)产生并且与食物中毒有关。将SEB类毒素引入到生物可降解的(DL-丙交酯-乙交酯)共聚物微球体中使小鼠的免疫应答提高到与被吸附到明矾上并与完全弗氏佐剂相组合使用的SEB类毒素相似的程度(Eldridge，1991)31)。类似地，SEB类毒素通过被并入到聚乳酸聚羟基乙酸共聚物纳米球中而被有效辅佐；得到的免疫应答可与由使用明矾作为佐剂所实现的免疫应答相媲美(Desai(2000)32)。 作为本发明的一部分，可提供抗毒素相关疾病疫苗，其包含本文所述的细胞外基
质材料作为疫苗佐剂和免疫有效量的诸如蓖麻毒蛋白类毒素或SEB类毒素作为抗原。例
如，这种抗原在Vitetta (2006)28和Eldridge (1991)31中被详细描述，它们的教导作为参考
被特别地并入本文。 用于朊病毒相关疾病的疫苗 在一些实施方案中，本发明提供了适用于与朊病毒相关疾病组合使用的佐剂制备物。例如，这些朊病毒相关疾病包括所有被分成以下类别的那些，传染性海绵状脑病、牛海绵状脑病、羊瘙痒病、鹿慢性消耗性疾病和克_雅病。 尽管朊病毒使用免疫细胞和淋巴网状内皮细胞到达脑(Aguzzi， 2003)36，目前的证据显示体液免疫应答可抑制该感染。特别地，对抗细胞朊病毒蛋白质(PrPc)的抗体已知抑制朊病毒增殖(Petetz， 200137 ;Enari， 200138)。另外，宿主对内源性PrPc的耐受性仍然是活性接种的主要障碍。在小鼠中，使用重组PrPc抗原诸如肽和多肽的接种仅仅剌激弱的免疫应答。朊病毒抗原与佐剂诸如弗氏佐剂(Polymenidou， 200439 ;Koller，200240 ;Sigurddson，200241 ;Gilch， 200342 ;Hanan， 2 0 0 1 43 ;Hanan， 200144 ;Souan， 2 0 0 1 45 ;Arbel， 200346) ;Montanide IMS-1313 (Schwartz, 200347) ;TiterMax ;专有的嵌段共聚物CRL-8941、角鲨烯、可代谢的油、和独特的微粒子稳定剂(Gilch， 200342);和CpG低聚核苷酸(Rosset， 200448)的组合全都不能诱导强的免疫应答。 可以预料，本文所述的细胞外基质材料的佐剂制备物可与朊病毒蛋白质(PrPc)组合使用以提供针对朊病毒相关感染的改善的疫苗。 本申请引用的所有的文件、专利、杂志文章和其它材料作为参考并入本文。
尽管本发明已经参考附图连同其几个实施方案进行了充分描述，但可理解的是可 由本领域技术人员进行显而易见的改变和更改。这些改变和更改可被认为被包含在由权利 要求书所限定的本发明的范围内，偏离该范围的那些除外。 书目 以下所列的参考文献已经说明书中引用的全部参考文献以它们为本文所采用的
方法论、技术和/或组合物提供了增补、说明和背景或教导的方法的程度被并入。 l.Higgins DA，等人，(1996) ， Vaccine, 14 :478-484. 2.Martin JT. (1997) ， Biologicah， 25 :209-213. 3. BanzhoffA， Nacci P， Podda A. (2003) ， Gerontology, 49 :177-184. 4. Segura-Velasquez R，等人，(2006) ， Vaccine, 24 :1073-1080. 5.Suli J，等人，(2004) ， Vaccine 22:3464-3469. 6.de Souza Matos DC，等人，(2000) ， Vaccine, 18 :2125-2131. 7. Peng M，等人，(2006) ， Vaccine, 24 :887-896. 8.Qin W，等人，(2004)，Cell Mol Immunol, 1 :148-152. 9. Sung JJ，等人，(2006) ， Curr Opin Mol Ther 8:150-155. 10. Jaganathan KS，等人，(2006) ， Vaccine, 24 :4201-4211. ll.S卿i T，等人，(2005) ， Vaccine, 23 :5450-5456. 12.Theeten H，等人，(2005) ， Vaccine, 23 :1515-1521. 13.Caglar K，等人，(2005) ， APMIS， 113 :256-263. 14. Flick—Smith HC， et a / (2002) ， Infect. Immun. 70 :2022—2028. 15. Petrik MS，等人，(2007) ， Neuromolecular Med. 9 :83-100. 16. Levesque PM，等人，(2006) ， Hum. Vaccin. 2 :IA-II. 17.Hedlund J，等人，(2002) ， Vaccine 20:164-169. 18. Sen G，等人，(2006) ， Infect. Immun. 74 :2177-2186. 19.Sabirov A， Metzger DW. (2006) ， Vaccine,24 :5584—5592. 20. Pimenta FC，等人，(2006) ， Infect. Immun. ， 74 :4939—4944. 21. Mullen GED，等人，(2006) ， Vaccine, 24 :2497-2505. 22. Langermans JAM,等人，(2005) ， Vaccine, 23 :4935-4943. 23. Stewart VA，等人，(2006) ， Vaccine, 24 :6483-6492. 24. Brando C，等人，(2006) ， Infect. Immun. Epub. 25. Rosado-Vallado M，等人，(2005) ， Vaccine, 23 :5372-5379. 26. Kenney RT，等人，(1999) ， J. Immunol, 163 :4481-4488. 27.Mendez S，等人，(2003)， Infect. Immun. ，71 :5121-5129. 28.Vitetta ES，等人，(2006) ， Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) ， 103 :2268-2273. 29. Griffiths GD，等人，(1997) ， Vaccine, 15 :1933-1939. 30. Kende M，等人，(2006) ， Vaccine, 24 :2213-2221. 31. Eldridge JH，等人，(1991) ， Infect. Immun. ， 59 :2978-2986. 32.Desai MP，等人，(2000) ， J. Microenc即sul， 17 :215-225. 33. Palese (2006) ， Emerg. Inf. Dis. ， 12 (1) :61—65.
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权利要求
用于增强传染性病原体或生物毒素的免疫原性的佐剂，所述佐剂包括细胞外基质材料。
2. 权利要求1的佐剂，其中疫苗是用于破伤风、流感、狂犬病、病毒性肝炎、白喉、炭疽、肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)感染、疟疾、利什曼病、蓖麻毒蛋白中毒、朊病毒或葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素B中毒的疫苗。
3. 权利要求l的佐剂，其中疫苗是用于破伤风的疫苗。
4. 适合用作传染性病原体或生物毒素疫苗的组合物，其包括致免疫量的所关心的传染性病原体抗原制备物；禾口传染性病原体疫苗佐剂，其中所述传染性病原体疫苗佐剂包括细胞外基质材料，并且其中在存在所述传染性病原体疫苗佐剂的条件下所关心的传染性病原体抗原制备物引发可检测的保护性应答的致免疫量低于在缺乏所述传染性病原体疫苗佐剂的条件下所关心的传染性病原体抗原制备物引发可检测的保护性应答的致免疫量。
5. 权利要求4的组合物，其中所关心的传染性病原体抗原制备物包括破伤风类毒素。
6. 权利要求1的组合物，其中传染性病原体疫苗佐剂包括小肠粘膜组织由来的细胞外基质材料。
7. 权利要求4的组合物，其通过包括以下的方法制备获得传染性病原体疫苗佐剂，其包括能够增强所关心的传染性病原体抗原的免疫原性的细胞外基质材料；将所述传染性病原体疫苗与致免疫量的所关心的传染性病原体抗原组合，其中所述传染性病原体疫苗佐剂包括细胞外基质材料，并且其中在存在所述传染性病原体疫苗佐剂的条件下所关心的传染性病原体抗原足以剌激保护性应答的致免疫量低于在缺乏所述传染性病原体疫苗佐剂的条件下所关心的传染性病原体抗原足以剌激保护性应答的致免疫量。
8. 权利要求4的组合物，还被定义为是破伤风疫苗。
9. 权利要求4的组合物，其中细胞外基质材料包括肾囊组织。
10. 权利要求4的组合物，其中细胞外基质材料包括小肠粘膜下层组织或筋膜细胞外基质材料。
11. 权利要求4的组合物，其中所关心的传染性病原体抗原制备物包括所关心的传染性病原体抗原的灭活制备物或其有毒产物。
12. 权利要求4的组合物，其中生物毒素制备物包括所关心的生物毒素的灭活制备物。
13. 权利要求4的组合物，其中细胞外基质材料从小肠粘膜下层组织、肾囊材料或筋膜细胞外基质材料由来。
14. 权利要求13的组合物，其中细胞外基质材料从小肠粘膜下层组织由来。
15. 权利要求13的组合物，其中细胞外基质材料从猪小肠粘膜下层组织由来。
16. 权利要求13的组合物，其中细胞外基质材料佐剂包括以1 : IO比率存在的细胞外基质材料(ECM)和药学可接受的载体溶液。
17. 使动物对所关心的传染性病原体免疫的方法，包括给予致免疫量的组合物，该组合物包含所关心的传染性病原体抗原和足以在所述动物中剌激对所述所关心的传染性病原体或由所述所关心的传染性病原体产生的有毒产物的免疫应答的传染性病原体疫苗佐剂，其中所述组合物的足以在动物中剌激免疫应答的致免疫量低于所关心的传染性病原体抗原在缺乏传染性病原体疫苗的条件下足以剌激免疫应答的致免疫量。
18. 权利要求17的方法，其中所关心的传染性病原体抗原包括破伤风类毒素制备物。
19. 权利要求17的方法，其中组合物的致免疫量包括0. 03微克到0. 05微克的破伤风类毒素。
20. 权利要求17的方法，其中经过免疫的动物与未经免疫的动物相比具有提高的存活率。
全文摘要
本文公开了可用于治疗和/或预防传染性病原体相关感染和疾病诸如破伤风以及生物毒素相关疾病的疫苗和疫苗佐剂。还提供了制备佐剂和包含该佐剂的疫苗的方法。还提供了针对传染性病原体相关疾病诸如破伤风和其它的生物毒素相关疾病对动物接种/使动物免疫的方法。提供了从细胞外基质材料制备的佐剂材料。佐剂被证明增强所关心的传染性病原体抗原或生物毒素抗原的免疫原性，以及增强经免疫的动物的存活。
文档编号A61K39/02GK101730541SQ200780052437
公开日2010年6月9日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年1月30日
发明者保罗·J·哈尔, 威廉·R·沃尔特, 马克·A·苏科 申请人:圣母大学;库克生物技术公司