专利名称：基于内皮细胞表面抗原的肿瘤疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及医用技术领域，尤其是涉及肿瘤免疫疫苗的制备，可应用于肿瘤治疗以及预防其复发的药品。
背景技术：
手术方法和化学疗法对肿瘤治疗的有限性，使得针对肿瘤患者的新治疗方法的进一步开发变得迫切。现在，人们特别关注抗血管生成疗法，其原理M于抑制肺瘤血管的生长。
肿瘤的发展有两个主要阶段血管前期和血管期。在第一个阶段，肿瘤通过扩散作用从病人血管中获得营养和氧气而生长，这使得肿瘤的生长被限制在不足几个立方毫米的空间之内。接下来肿瘤的生长需要过渡至第二个阶段，这个阶#爻为月中瘤血管化(tumor vascularisation) (Folkman J" "What is evidence thattumors are angiogenesis dependent " J. Natl. Cancer Inst" 1990, v.82, 4-6)。血管的出现极大地加强了肺瘤的营养，这导致肿瘤的快速生长，并增大了其转移的可能性(Hanahan D., Folkman J. "Patterns and emerging mechanisms of theangiogenic switch during tumorigenesis". Cell, 1996， v. 86, 353-364 )。抗血管生成物质的应用可预防肺瘤血管生长以及相应地抑制生长的第二阶萃爻。
预防肿瘤生长， 一个众所周知的方法是给患者接种疫苗以克服针对位于血管内膜上内皮细胞(EC)的免疫耐受性。细胞和体液的细胞毒作用引起内皮细胞的死亡，这阻碍了肺瘤血管的形成，并进而破坏了恶性细胞。已知有各种制备这种疫苗的抗原的方法；和本发明最接近的是基于适当的内皮细胞抗原的疫苗。
文献资料表明获得疫苗的方法是基于对异种内皮细胞的利用，即使用另一生4勿物种的内皮细月包(Wei Y" "Immunotherapy of tumors with xenogeneic
4endothelial cells as a vaccine", Nature Medicine, 2000, v. 6， 1160-1166)。这些疫苗的缺点是异种抗原的存在以及实际上压载抗原(ballast antigens)的存在，这
从已知的基于异体抗原的疫苗来源来看，这种疫苗是由同一物种的其他生物细胞产生的(如Scappaticci F.A., Nolan G.P" "Induction of anti-tumor immunityin mice using a syngeneic endothelial cell vaccine" Anticancer Res., 2003, v. 23，1165-1672，文章作者比较了内皮细胞疫苗的不同变种)。疫苗中异体抗原的出现，也会降低对内皮细胞特异性抗原免疫反应的强度及特异性。
最接近的类似物在Okaji Y等的论文中有描述("Vaccination with autologousendothelium inhibits angiogenesis and metastasis of colon cancer throughautoimmunity", Cancer Sci.， 2004, v. 95, 1， 85-90)。后一种方法应用了内皮细月包。上述方法使用了自身内皮细胞，即从免疫后的机体中分离的细胞或来源于遗传基因相同的机体的细胞(例如同系老鼠的细胞)。这样的疫苗可产生强度最高和特异性最佳的免疫反应，这决定了其治疗效果。但是，所有的来源于整体的细胞的疫苗都包含有大量的压载物质(ballastmaterial),即胞浆蛋白、碳水化合物和脂类。压载物(Ballast substances)可明显减少疫苗中抗原的量，而这些抗原才是免疫系统的潜在的作用目标(胞内抗原不能影响免疫系统)。应该注意到， 一种已知的制备疫苗的方法不会引起对肿瘤血管中内皮细胞的特异性免疫应答。
本发明的目的是提供一种制备基于内皮细胞抗原的肿瘤疫苗的方法，以克服机体对肺瘤血管内皮细胞的免疫耐受性。本发明的基础在于正常组织血管内皮细胞和肺瘤内皮细胞之间公知的区别。其中，正常组织血管内皮细胞生理条件下处于的静息状态；而肿瘤内皮细胞是处于激活，即指处于活跃地增殖和转移的状态。已知与正常组织血管中的内皮细胞相比，激活的内皮细胞中许多特异性蛋白的表达增多，如avP3(Gladson C丄.et al.， Am. J. Pathol., 1996， v. 148,1423-1434), E-选择素(E画selectin) (Volm M. et al., Clin. Cancer Res" 2000， v. 6,3236-3240)，内皮糖蛋白(endoglin) (Burrows F. et al., Clin. Cancer Res" 1995， v.1, 1623-1634),内皮p垂液酸蛋白(endosyalin) (Takahashi K. et al., J. Clin. Invest"1994， v. 93, 2357-64)和血管内皮生长因子受体(VEGF-receptor) (Boocock C.et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, v. 87, 506-516)。 一些蛋白表达谱的差异可以从专利 US2006210975 , US2005142138 , US2006127902和国际申讳-WO2004091383中得知。本发明的重点是内皮细胞表面的差异，特别是嗜中性细月包素(neutrophillins )、整合素(integrins)、受体(receptors)等，这些4吏4寻抗原对肿瘤血管内皮细胞具有特异性(见国际申请WO2004001004)。
发明内容
本发明所达到的技术效果在于通过克服了机体对肿瘤血管内皮细胞的免疫耐受性，而破坏胂瘤血管，从而提高了对肿瘤疾病的治疗效果。也就是说克服免疫耐受性就是针对激活内皮细胞的，这使得损害特异性地针对肿瘤血管。
上述技术效果，可通过本发明所提供的利用内皮细胞制备肿瘤疫苗的方法而实现。根据本发明，用蛋白酶对活的内皮细胞进行不使细胞死亡的处理；收集释放的抗原；经过一段时间后对所述活的细胞进行重复处理，该段间隔的时间足以使得细胞表面抗原恢复；积聚表面抗原直至达到满足疫苗接种的剂量；控制制备的疫苗质量。
激活的所述内皮细胞可以为从肿瘤血管中新分离的内皮细胞。
如果从肺瘤血管分离的内皮细胞数量不够，本发明所提供方法也可以包括通过培养来增殖所述内皮细胞的步骤。
根据本发明的优选方式，所述蛋白酶为胰蛋白酶。
所述激活的内皮细胞可从肿瘤血管中分离，并在能保持其激活状态的条件下培养。
所述内皮细胞的激活可通过与肿瘤细胞共培养来维持。根据本发明的优选实施例，所述内皮细胞的激活状态可以通过与肿瘤组织片段进行培养来维持。
根据本发明的另 一实施例，激活的所述内皮细胞取自病人自身肿瘤血管。根据本发明的再一实施例，激活的所述内皮细胞可取自不同患者的肿瘤血
6所述内皮细胞的培养也可通过体外与肿瘤细胞进行共同培养而激活。 所述内皮细胞可由患者自身的肿瘤细胞激活。
根据本发明的另 一实施例，所述内皮细胞可被其他患者的肿瘤细胞激活。 内皮细胞可由适当的肺瘤细胞系激活。
根据本发明的另 一实施例，所述内皮细胞的培养可通过体外加入激活因子 来激活。在这种情况下，所述内皮细胞可由至少一种激活因子激活。特别是4皮
血管内皮生长因子(VEGF)激活。
根据本发明的另 一实施例，所述内皮细胞可通过体外加入来自肿瘤细胞培 养的条件培养液而激活。
免疫应答可以通过在表面抗原中加入佐剂而实现。
以下通过具体实施方式
和附图来进一步说明本发明。
如下 图1为本发明疫苗制备的大体流程图2为第一和第二实^^组以及对照组中，BALB/c小鼠中肝癌细胞H22的 生长曲线图(肿瘤直径用士标准偏差表示)；
图3为第一组(A)、第二组(B)和对照组(C)的小鼠肿瘤组织的组织 切片，以及相应的血管生成指数(AI);肿瘤血管壁呈深色(与彩色照片中的 棕色相对应)。
具体实施例方式
图l所示为本发明的具体实施方式
。活的内皮细胞分离自通过活检或手术 取得的肺瘤组织。将活的内皮细胞用于原代培养激活的内皮细胞。需要时对细 胞进行培养以达到足够数量。
本发明所述方法，不仅可以通过使用初始就处于激活状态的肿瘤血管内皮 细胞来实现，也可通过使用处于静息状态的正常血管内皮细胞，还可以通过使 用采用各种方式激活的内皮细胞来实现。
7本发明中，接下来至关重要的一步，是在温和(不使细胞死亡)的条件下 用蛋白酶处理活的细胞。
为了得到满足疫苗接种剂量的抗原，将胰蛋白酶处理细胞的程序重复若干 次，其间间隔几小时到几天，此段时间对表面抗原的修复是必须的。疫苗积聚 是通过特定疫苗制备的特定工艺进行的，即，这些抗原可以根据其组成进行纯 化、浓缩、分析，也可进行修饰或与佐剂混合以增强免疫原性。
根据本发明所述的制备抗原疫苗的方法，具有如下优点 -具有自体疫苗的所有优点，即其相对于特定患者具有特异性； -具有多价疫苗的所有优点，即抗原多样性；
-在免疫接种后，内皮细胞(最好使用激活的内皮细胞)表面抗原疫苗的 富集，可以克服免疫接种带来的对肿瘤血管内皮细胞的免疫耐受性；
-本方法可通过积聚抗原而得到满足疫苗接种剂量的抗原，而不是通过内 皮细胞的增殖。这是非常重要的，因为在体外增殖期间原代细胞培养会逐渐改 变其抗原结构，使其无法用于疫苗接种。
根据本发明得到的表面抗原，其实际应用取决于表达在血管内皮细胞表面 (包括肿瘤)的蛋白质片段的特征，也就是说氨基S^列及其修饰(如糖基化) 的特征。根据本发明所得到的激活的内皮细胞表面抗原，其应用是由表达于内 皮细胞表面，即肿瘤血管呈现的蛋白质片段的特征所决定的。
众所周知，肿瘤的生长离不开肺瘤血管化。积聚和纯化的内皮细胞表面抗 原(优选激活的)与能增强免疫反应的佐剂相混合一并注入人体或动物体内。 由于细胞和体液免疫反应的作用，使得注入体内的抗原失活，因而肺瘤血管中 已有的或新出现的内皮细胞会被交叉破坏，这决定了免疫接种的治疗和预防效 果。为了发挥免疫反应的最大作用，可重复注射表面抗原。
以下为实现本发明所述方法的实施例一，采用人肝癌细胞H22接种于小 鼠，基于自体激活的内皮细胞制备肿瘤疫苗。
依据Belloni等的方法，从BALB/c小鼠肝脏血管中获得自体内皮细胞进 行培养。(Microvasc. Res., 1992, vol. 43， 20-45)在内皮细胞培养基中以1 : 3的 比例加入来自H22细胞的条件培养基来激活内皮细胞。在激活的第5-7天后，根据以下方案，利用内皮细胞制备表面抗原。
1. 从装有培养激活的内皮细胞的细胞瓶中移除生长培养基，用无菌生理 溶液(体积为生长培养基体积的一半)冲洗单层细胞不少于三次。沖洗的目的 是去除残留的生长培养基。
接下来至关重要的一步是用上述细胞所必需浓度的蛋白酶处理细胞，其
中，蛋白酶选择胰蛋白酶(活性~ 3000U/mg )。
2. 将0.0001%的胰蛋白酶溶液加入到单层细胞中，加入量为每25cm2细胞 并瓦的表面lml溶液。
3.37。C下孵育细胞瓶，在孵育到5-7分钟时，移出含有已分离的表面抗原 的胰蛋白酶溶液。
4. 加入新制备的含有血清(通常10%)的生长培养基，再接着进行培养。
5. 为了使积聚的表面抗原达到疫苗接种的剂量，经过24小时，重复步骤 1-4,通过检查培养激活的内皮细胞的适配性，来控制疫苗质量，以得到肿瘤 血管特异性抗原。
用胰蛋白酶处理细胞的条件可以极不相同，例如处理时间可以从几分钟到 数十分钟，胰蛋白酶的浓度可以从0.00001%到0.5%，这些条件分别针对各内 皮细胞的原代培养。如果胰蛋白酶的活性不同于说明书中提供的活性，可以根 据其活性来推算其正确的浓度比例。
在用胰蛋白酶处理以前，应对细胞进行快速沖洗，例如用生理溶液，以去 除残留的生长培养基。经胰蛋白酶处理后，释放出的抗原为表面蛋白片段，可 以用任何适当的方法收集这些蛋白片段，如用移液器倾析。
在细胞培养期间，与任何培养细胞一样，内皮细胞的抗原组成会发生变化， 这会使得细胞培养的抗原与患者肿瘤血管的内皮细胞表面抗原之间产生差异。 为了避免制备出不适合的疫苗，抗原积聚中内皮细胞培养的适当性，按照欧亚 专利No.009326"测试细胞培养质量的方法"所述进行评定。
众所周知，用不会使细胞死亡的一定浓度的蛋白酶处理细胞，会引起细胞 表面抗原的分离(见欧亚专利No.009325"肿瘤疫苗、制备肿瘤疫苗的方法以
9及抗肿瘤免疫治疗法")。因此根据本发明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶使得内皮 细胞表面抗原释放到溶液中。在胰蛋白酶的作用下释》文的内皮细胞表面抗原 (表面蛋白片段)，大部分适用于免疫接种，用于肿瘤患者的免疫接种。
注意，最好在细胞脱离细胞瓶表面之前收集含有细胞表面蛋白分离出的抗 原的胰蛋白酶溶液，这样会避免细胞出现在抗原溶液中，从而避免了不必要的 纯化步骤。
必需的蛋白酶在合适的浓度下处理细胞后不会使其死亡，由此可用胰蛋白 酶重复处理原代内皮细胞培养，从而积聚得到疫苗接种所需剂量的抗原。
在用胰蛋白酶处理细胞的间隔期间，根据方案培养细胞(如在37。C的C02 培养箱中，用含有血清的生长培养基培养，以保持添加物的激活状态)。
根据疫苗的制备技术处理积聚的表面抗原，即可经过纯化、浓缩、组成分 析，也可经修饰或者与佐剂混合以增强免疫原性。
在本发明的其他实施例中，用胰蛋白酶处理细胞的步骤可与细胞的接种步 骤(用胰蛋白酶处理细胞，细胞釆集和分离)相结合。
胰蛋白酶溶液可用无菌生理溶液制备，也可用任何适当的盐溶液或緩冲液 制备。
在本发明的其他实施例中，可采用其他蛋白酶来代替胰蛋白酶，如胰凝乳 蛋白酶(chemotrypsin)、蛋白酶K等。
本发明所述制备肿瘤疫苗的方法可用于各种类型的内皮细胞培养，尤其是 基于基质(matrix)或基于底物(substrate)培养；也可用于不同组合的共培 养以及新分离的内皮细胞。
下面进一 步地在实施例二中描述采用人结肠癌血管中分离出的激活的内 皮细胞进行原代培养，来制备肺瘤疫苗的方法。
1、 在外科切除肺瘤手术期间取一块结肠肺瘤组织，将其放入内有含抗生 素的RPMI 1640培养基的无菌管中，送至实-验室。
2、 在无菌条件下将肺瘤组织转移至有盖培养皿(Petri dish)中，用器械 去除坏死部分、血块、残留脂肪以及结締组织。3、 将肿瘤组织用剪刀剪成小片。
4、 将肿瘤组织的碎片在37。C下置于0.2。/。的胶原酶溶液中，所用溶液体积 足以覆盖肿瘤片段。
5、 移去胶原酶溶液，用PBS溶液轻轻冲洗肺瘤组织碎片。
6、 加入3ml的RPMI 1640培养基，用移液管强力吹打，使得肺瘤组织碎 片分解成小的细胞团块。
7、 较大的团块沉于底部，余下的细胞被转移到一个新的试管中，并在室 温下以170g离心。
8 、用RPMI 1640培养基将细胞团重新悬浮。
9、 在室温条件下，lml的细胞悬浮液在Percoll梯度下以670g离心20分钟。
10、 收集Percoll梯度密度在1.033-1.047范围内(与内皮细胞相符)的细 胞碎片，加入10ml的RPMI 1640,重新悬浮混合物，然后以170g离心5分钟
后收集细胞。
11、 将内皮细胞重新悬浮于生长培养基(RPMI 1640,肝磷脂，内皮生长 因子，肿瘤细胞条件培养液，10%的胎牛血清)中，并在培养细胞并瓦中培养。
12、 从瓶中移除生长培养基，用培养基一半体积的生理溶液或者PBS溶 液沖洗细胞三次。沖洗后应将来自生长培养基中的血清清除。
13、 将0.0001%的胰蛋白酶溶液(酶活性~ 3000U/mg )加入到细胞中， 加入量为每25cm2细胞瓶的面积lml溶液。
14、 37。C孵育细胞瓶。在孵育到5至7分钟时，收集含有所释放的表面抗 原的溶液。从细胞瓶中移除溶液期间，内皮细胞应紧贴瓶底。如果一部分细胞 由于胰蛋白酶的作用脱离了细胞瓶壁而漂浮于液体中，则需对溶液以400g离 心5分钟，取无细胞的上清备用。
15、 为灭活具有内皮细胞的培养细胞瓶中剩余的胰蛋白酶的活性，应加入 新的含有小牛血清的培养基，并继续在37。C以及5% C02的条件下孵育。
16、 由步骤14获得的溶液在45。C条件下进行利用真空浓缩机进行浓缩。 浓缩前应用适当方法对溶液脱盐，如反相色谱法、凝胶过滤法等。
ii17、为了得到所需数量的抗原，经过几小时到几天的时间间隔，重复步骤 12-16。在这期间，制备疫苗的质量通过评定内皮细胞与患者肺瘤血管抗原特 异性的适配性来控制。
根据本发明的一个实施例，所述内皮细胞，与同该内皮细胞分离出的相同 肿瘤来源的肿瘤细胞共培养。
根据本发明的另一个实施例，所述内皮细胞，与其他患者来源的肿瘤细胞 共培养，或者与特定的肺瘤细胞系共培养。
根据本发明的另一个实施例，所述内皮细胞，与用以分离该内皮细胞的肺 瘤片段共培养，或与其他病人的肿瘤片段共培养。
根据本发明的另一个实施例，所述激活的内皮细胞来自其他病人(同种异 体内皮细胞)。
根据本发明得到的培养内皮细胞表面抗原， 一定对供体肺瘤内皮细胞有特 异性。但是细胞培养改变了细胞表型，这是因为体外不可能创造与肿瘤细胞在 患者身体内相同的生长条件。因此，应以强制手段控制用以疫苗接种的积聚抗 原的内皮细胞培养的适配性，并根据上述欧洲专利"检测细胞培养质量的方法" 中所述方法进行。
为了确定根据本发明而得疫苗的抗肺瘤活性，利用小鼠进行模型试验，选 择三组年龄和体重相同的BALB/c小鼠(每组6只雄性)。
根据实施例一，采用自体的激活和非激活的内皮细胞培养，得到抗原。将 分离的抗原用葡聚糖凝胶(Sephadex) G-10进行凝胶过滤脱盐，继而用真空 浓缩器浓缩。
给小鼠皮下注射1百万肝癌细胞H22。注射后第七天，预先将抗原与完全 弗氏佐剂以1 : 1 (体积比)的比例混合，取150吗给小鼠以皮下注射的方式 进行疫苗接种。随后每周一次用完全弗氏佐剂进行免疫接种，持续4周。第一 实验组的动物用本发明实施例一制备的疫苗进行接种，也就是用自体的激活的 内皮细胞。第二实验组的动物用本发明实施例一制备的疫苗接种，但是所用为 自体的非激活内皮细胞。对照组注射相同量的混合有完全弗氏佐剂的PBS。
在接种胂瘤后三个月，分别观察对照组和试验组的生长状况。测量结果(见图2)显示，实验组动物体内的肿瘤缩小并消失，这证明含有内皮细胞表面抗
原的疫苗有显著的抗肿瘤效果，基于激活的内皮细胞的表面抗原加工而成的疫 苗显示出更明显的效果。
为了证实疫苗的抗血管机制，通过对死亡的肿瘤血管壁的组织切片和免疫
酶法，来检测对照组和试验组的肿瘤血管生成指数(每1000个胂瘤细胞的血 管数量)。
在接种后的第30天，分离新鲜肿瘤组织碎片，用含10%曱醛的PBS (pH7.0-7.2)溶液固定，用石蜡包埋。制备成4pm厚的切片用于免疫组化^见 察。为显示血管，切片用标准的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂，用鼠 抗人CD31抗体染色。用乙醇去除石蜡。使用3%的过氧化氢阻断内源性过氧 化物酶的活性。用含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS来阻止抗体的非特异性 结合。随后将切片与CD31的一抗、生物素标记的小鼠IgG抗体和抗生物素蛋 白链霉素-生物素-过氧化物酶复合物共同孵育。切片用新制备的二氨基联苯胺 染色，用苏木素复染(poststain)。每步之后，用PBS冲洗切片。根据上述方 法对阴性对照组切片染色时，其中 一抗用小鼠IgG替代。
图3示出了第一试^r组(A)、第二试-险组(B)和对照组(C)中的肿瘤 组织切片，这些试验组相对应的血管生成指数(AI)分别为16、 32和80。这 一事实证实，用内皮细胞表面抗原进行疫苗接种，具有抑制血管化作用的效果， 需要注意的是激活的内皮细胞具有更强的抑制效果。
需要强调的是动物实验的结果并不受到所使用的动物的限制，由于免疫反 应的机理在人和动物都是相同的。
抗原的使用方法和其每公斤体重的使用剂量，保证了其在人类免疫疗法中 的作用，但是针对每一个病人，免疫治疗方案(剂量，重复注射的次数和佐剂 的使用)可以根据每个特殊病人进行个性化，综合考虑疾病的发展、肿瘤疾病 的阶段、肿瘤的血管化程度、机体对伴行于化学疗法的明显的抗原免疫反应的 能力等。
以下说明如何得到基于内皮细胞表面抗原的肿瘤疫苗，该疫苗是根据本发 明的实施例二而制备的，用于人的抗肿瘤疫苗接种。
13疫苗包含lmg抗原混合物(根据本发明实施例二而制备)溶于0.5ml的 PBS中，并与1ml的佐剂山小星蒜碱(Montanide) ISA-51 ( Syntex厂基于水 油乳浊液和角豊烯、PlunoricL121、吐温-80而制成的佐剂)相混合。
给患者皮下注射一个剂量的疫苗，每周一次，持续三周以及每月一次，持 续五个月。
免疫接种的效果通过对注射的表面抗原的免疫的强度来评估。在注射2-3 天后，针对注射抗原的过敏性反应通过注射局部红斑的尺寸来衡量。以首次注 射后局部出现的红斑尺寸作为基数。经过重复疫苗接种，过敏反应明显强化， 证明免疫反应的发展。
可以采用静脉内或肌内注射疫苗，也可注射不含佐剂的疫苗。
使用根据本发明提供的方法制备的疫苗后，免疫反应的发生是由于疫苗中 含有内皮细胞表面抗原。疫苗中存在的许多抗原，即表面蛋白片段，可对所有 的、表面蛋白上有与之相同的氨基Sl/f列的细胞产生免疫反应。
根据本发明，用患者自身的激活的内皮细胞和用其他患者的内皮细胞制备 的肿瘤疫苗，均可具有效果。
上述两种情况都可达到治疗效果，这是因为来自不同患者的肿瘤血管的内 皮细胞表面上，具有相同的氨基酸序列。而且，使用根据所述方法制备的自体 疫苗时，效果更为明显，这是因为疫苗含有的抗原对特定患者的肺瘤血管内皮 细胞具特定性。
使用来自正常组织的静息的和通过各种方法激活的内皮细胞，均可达到治 疗效果。这是由于所有内皮细胞均具有的相同的表面抗原，也是由于通过各种 方法激活的内皮细胞的抗体组分变化具有部分相同的特性。
应当注意，根据本发明所述方法制得的疫苗，使用时与单价疫苗相比，治 疗效果可提高许多倍。
根据本发明提供的方法制备的疫苗，在使用中可以克服机体对肿瘤血管内 皮细胞的免疫耐受性，这是由于疫苗富含对肺瘤血管内皮细胞具有特异性的抗 原。
这种情况是因为用蛋白酶对细胞进行处理，蛋白酶处理细胞的这些细胞蛋白酶浓度是活性的(非致死的)。活性的蛋白酶浓度的使用，能仅使内皮细胞 表面抗原分离，而不会使细胞死亡。细胞死亡会伴随质膜损坏，从而导致疫苗 被细胞质成分污染，特别是被大量胞内蛋白污染，这些蛋白对疫苗接种来说是 无益的。这会减少已知的疫苗中的特异性肺瘤血管抗原的量，引发非靶向性免 疫反应，从而降低表面抗原的特异性。
由于使用富含表面抗原的疫苗，本发明所提供的疫苗可提高抗肿瘤治疗的 效果。
此外，免疫疗法效果的提高，也可通过积聚^目同内皮细胞活的抗原制备 而成的表面抗原来实现。这种制备肿瘤疫苗的方法，可以通过每次使用蛋白酶 处理，获得实际上成分不变的抗原，并且积聚抗原使得其量满足免疫接种所需。 可以通过控制疫苗质量，来保证仅对特定肿瘤血管有特异性的抗原混合入疫苗。
因此，本发明提供了获得内皮细胞表面抗原的方法，利用此抗原可以对肿 瘤疾病进行免疫接种治疗。
1权利要求
1、一种肿瘤疫苗的制备方法，包括用蛋白酶在不使细胞死亡的温和条件下处理活的内皮细胞；收集释放的细胞表面抗原；用蛋白酶重复处理所述活的内皮细胞，间隔的时间足以使得表面抗原被所述内皮细胞恢复；积聚释放的抗原，直至达到所需的抗原数量；控制疫苗质量。
2、 如权利要求1所述的制备方法，其中，所述内皮细胞为激活的内皮细胞。
3、 如权利要1或2所述的制备方法，其中，所述内皮细胞为从肿瘤组织血管中新分离出来的内皮细胞。
4、 如权利要求1所述的制备方法，其中，所述内皮细胞经过培养使其增殖。
5、 如权利要求1所述的制备方法，其中，所述蛋白酶为胰蛋白酶。
6、 如权利要求l、 2、 4中任意一项所述的制备方法，其中，激活的所述内皮细胞是从肿瘤血管中分离的，并在保持所述内皮细胞激活状态的条件下培养。
7、 如权利要求l、 2、 4、 6中任意一项所述的制备方法，其中，培养过程中所述内皮细胞的激活状态是通过与肺瘤细胞共同培养而维持的。
8、 如权利要求l、 2、 4、 6中任意一项所述的制备方法，其中，培养过程中所述内皮细胞的激活状态是通过与肿瘤组织片段共同培养而维持的。
9、 如权利要求l、 2、 4中任意一项所述的制备方法，其中，激活的所述内皮细胞为取自病人自身肿瘤血管的内皮细胞。
10、 如权利要求l、 2、 4中任意一项所述的制备方法，其中，激活的所述内皮细胞为取自其他病人肺瘤血管的内皮细胞。
11、 如权利要求l、 2、 4中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞的培养是通过体外与肿瘤细胞共同培养而激活的。
12、 如权利要求l、 2、 4、 11中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞是被患者自身的肿瘤细胞激活的。
13、 如权利要求l、 2、 4、 11中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞是^L其他患者的肿瘤细胞激活的。
14、 如权利要求l、 2、 4、 11中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞是被肺瘤细胞系激活的。
15、 如权利要求l、 2、 4中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞的培养是通过体外在生长培养基中加入激活物质而激活的。
16、 如斥又利要求l、 2、 4、 15中^f壬意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞被至少 一种激活因子激活。
17、 如权利要求l、 2、 4、 16中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞是一皮血管内皮生长因子激活的。
18、 如权利要求l、 2、 4中任意一项所述的制备方法，其中，所述内皮细胞的培养是通过体外加入来自肿瘤细胞培养的条件培养液而激活的。
19、 如权利要求l所述的方法，其中，所述表面抗原中加入佐剂。
全文摘要
本发明提供了一种用内皮细胞制备肿瘤疫苗的方法，该方法包括在不使细胞死亡的温和条件下，用蛋白酶处理活的内皮细胞；收集分离出的表面抗原；再次用蛋白酶重复处理活的内皮细胞，间隔的时间长度足以使得内皮细胞表面抗原恢复；收集释放出的抗原，直至达到所需数量；控制疫苗质量。本发明的技术效果在于，由于克服了对肿瘤血管内皮细胞的机体免疫耐受性，从而破坏了肿瘤血管，提高了肿瘤疾病的治疗效果。也就是说克服免疫耐受性就是针对激活的内皮细胞，从而使得免疫系统的破坏作用主要针对肿瘤血管。
文档编号A61K38/00GK101663042SQ200780052639
公开日2010年3月3日 申请日期2007年10月16日 优先权日2007年4月27日
发明者彼得·詹里耶维奇·卢克霍夫 申请人:彼得·詹里耶维奇·卢克霍夫