专利名称：：用于治疗癌症的协同药物组合的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的治疗癌症的药物组合，其中，所述组合显示协同效应。该药物组合包含选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂，和至少一种选自式I化合物(如本文所述)或其药学上可接受的盐或溶剂化物的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。本发明还涉及治疗癌症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的所述组合。
背景技术：
：癌症是用于描述其中异常细胞不受控制地分化的疾病的通用术语。癌细胞可以侵入周围组织，并且可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。存在不同类型的癌症，如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、白血病、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、曱状腺癌、皮肤癌、非何杰金氏淋巴瘤和黑色素瘤。目前比以往有更多可用的治疗癌症方法，包括化疗、放疗、手术、激素治疗、免疫治疗和基因治疗。化疗是对于多种癌症常规使用的治疗方法。最广泛使用的化疗药物(抗肿瘤剂)包括紫杉醇、多西他赛、阿霉素、依托泊苷、卡铂、顺柏、拓朴替康和吉西他滨。这些以及其它类似的抗肺瘤剂已成功用于治疗不同的癌症。但是，在一定的时间内，发现某些癌症患者产生对于涉及使用这样的标准抗肿瘤剂的单一治疗的抗性。对药物的耐受性或抗性是成功治疗的主要障碍。这种抗性往往被认为是固有的(即，在治疗开始时存在)或获得性的(即，在化疗过程中出现)。涉及人类非小细胞肺癌细胞(NCI-H460)接触浓度逐渐增加的阿霉素的研究报道了对阿霉素(96.2倍)具有抗性和对依托泊苷、紫杉醇、长春花碱和表阿霉素具有交叉抗性的新细胞系5(NCI画H460/R)的出现(J!C7^woAa,2006Feb;18(1)66-73))。在另一项描述非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤培养的体外化疗抗性的流行度研究中，报道了对于包括顺铂、阿霉素、依托泊苷、吉西他滨、诺维本(navelbine)、紫杉醇、泰索帝(taxotere)和拓朴替康的抗肿瘤剂的极端耐药性或中间耐药性(爿朋.T7zorac.2006Feb;81(2):440-6;讨论446-7)。吉西他滨被认为是治疗胰腺癌的临床最有效的药物，但由于大部分肿瘤细胞预先存在或获得对该药物的抗性，它未能明显改善胰腺癌患者的状况((9"coge"e2003May22;22(21):3243-51)。另一个在癌症治疗中观察到的或普遍存在的问题是与大多数抗肿瘤剂相关的严重毒性。在J￡g>^A^/Owe2005Dec—17(4)—291-300中报道了在如阿霉素的药物的情况下严重的副作用如心脏毒性的发生率。尽管发生了与常规的抗肺瘤剂如吉西他滨、紫杉醇相关的抗性和严重毒性，这些药物在癌症治疗中仍然是重要的，因为它们有能力减小肿瘤块。为了提高反应率并防止与常规的抗肿瘤剂的毒性，正在对新的治疗方法进行评估。一种这样的办法是涉及联用具有不同的生物学机制的不同抗癌剂的方案(Jekunen等人,Br.J.Cancer,69，299-306(1994);Yeh等人,LifeSciences,54,431-35(1994))。最佳的联合化疗方案可能导致疗效提高、主体毒性降低和最低或延迟的抗药性。当组合具有不同毒性的药物时，各种药物可以以其最佳剂量使用，有助于最小化不能耐受的副作用，如Oncology(WillistonPark),2002Oct;16:17-22才艮道的对卡培他滨(capecitabine)和多西他赛的组合。已经发现某些抗肿瘤剂在结合其它抗癌剂使用时比作为单一疗法使用时具有协同增效作用。例如，如CancerLett.2001Jan10;162(l):39-48报道，环磷酰胺和5-氟尿嘧啶在卵巢透明细胞腺癌细胞中协同发挥作用。联合化疗也可有利地在难以用单治疗、放疗或手术治疗处理的晚期阶段中用于癌症治疗，例如，已报道紫杉醇与吉西他滨联合用于治疗转移性非小细胞肺癌(Ca"cer，2006Sep1;107(5):1050-4)。最近，为改善药物反应率和解决对抗肿瘤剂的抗性，已尝试了一种或多种标准抗肺瘤剂(如紫杉醇、顺铂等)与治疗癌症的分子靶向抗癌剂的组合。分子耙向药物，例如甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)、夫拉平度(flavopiridol)等，调节其活性更特异性地与癌细胞相关的蛋白质(如激酶)。长期的研究证明，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)家庭的成员在各种细胞过程中发挥关键作用。到现在已知有11个CDK家庭的成员。其中，已知CDK1、2、3、4和6在细胞周期中发挥重要作用(Cyclinsandcyclin-dependentkinases:themeandvariations./UvQwcerM1995;66:181-212)。CDK通过与细胞周期蛋白如A-、B-、C-、D-(D1、D2和D3)和E-型细胞周期蛋白形成非共价复合体而激活。该家族的各种同工酶负责细胞周期的特定方面(细胞信号传导、转录等)，且某些CDK同工酶对于特定种类的组织是特异性的。在许多疾病状态下确认了这些激酶的异常表达和过度表达。已开发和在文献中报道了许多具有潜在有用的CDK抑制性能的化合物。夫拉平度是第一种进入临床试验的有效的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的抑制剂。已经发现夫拉平度在多种癌细胞系中协同增强常规抗肿瘤剂的细胞毒性反应。例如，ActaPharmacolSin.2006Oct;27(10):1375-81已报道用多西他赛、夫拉平度和5-氟尿嘧啶对HCT116结肠癌的连续处理。此外，RadiotherOncol.2004May;71(2):213J1报道了多西他赛与夫拉平度联合用于肺癌细胞的处理和MolCancerTher.2003Jun;2(6):549-55报道了多西他赛与夫拉平度联合用于对胃癌的治疗。尽管抗癌剂的组合已被证明在癌症治疗方案中具有重大的进步，但对于难以治疗或对作为单一疗法的常少见抗肿瘤剂表现出治疗抗性的癌症的治疗，仍有一些未满足的需求和改善癌症的药物治疗的空间。尤其是，开发用于递送具有不同作用机制的已知抗癌剂的新型组合途径是本领域的重要进步。虽然涉及具有不同作用机制的抗癌剂组合的方案可以在某些组合的情况下发挥作用，但相同的方式对于抗癌剂的其它组合可能不起作用，且这样的组合可能不总是产生具有有利治疗效果的组合。不过，本发明人令人惊奇地发现，包含选自式I代表的化合物(如本文所述)的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和用于治疗不同癌症的标准细胞毒性抗肺瘤剂的新型药物组合提供了比单独使用抗癌剂出人意料地高的效果。发明概述一方面，本发明涉及新的药物组合，包含选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂和选自式I的化合物(如本文所述)或其药学上可接受的盐或溶剂化物的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂；其中，所述组合在癌症的治疗中显示协同效应。另一方面，本发明涉及药物组合，包含选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素或吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂和选自式I的化合物(如本文所述)或其药学上可接受的盐或溶剂化物的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，用于同时或顺序施用以治疗癌症。在进一步的方面，本发明涉及新的药物组合用于治疗癌症和诱导细胞凋亡的用途。在另外的进一步的方面，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括与治疗有效量的选自式I的化合物(如本文所述)或其药学上可接受的盐或溶剂化物的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂结合向需要治疗的患者施用治疗有效量的选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂。在更另外的进一步的方面，本发明涉及新的药物组合在制备治疗癌症的药物中的用途。本发明的其它方面和进一步的应用范围通过下面的进一步的详细描述而变得明显。附图简述图l说明阿霉素与化合物A组合在体外H-460非小细胞肺细胞的处理中显示协同作用。图A、B、C和D分别代表不同处理组的细胞周期分布，即对照(96小时)、单独的200nM阿霉素(24小时)、单独的800nM的化合物A(72小时)和包括施用200nM阿霉素(24小时)、接着施用800nM的化合物A(72小时)的组合。图2说明阿霉素与化合物A组合在体外H-460非小细胞肺细胞的处理中显示协同作用。图A、B、C和D分别代表不同处理组的细胞周期分布，即对照(120小时)、单独100nM阿霉素(24小时)、单独1200nM的化合物A(96小时)和包括施用100nM阿霉素(24小时)、接着施用1200nM的化合物A(96小时)的组合。图3表明吉西他滨和化合物A的组合在体外胰腺(Panc-1)细胞处理中使用导致协同作用。图A、B、C、D和E分别显示不同处理组的细胞周期分布，即对照(24小时)、对照(96小时)、单独70nM吉西他滨(24小时)、单独300nM的化合物A(72小时)和包括施用70nM吉西他滨(24小时)、接着施用300nM的化合物A(72小时)的组合。图4显示在阿霉素接着化合物A的协同组合中，使用膜联蛋白V染色在120小时处理末期检测的早期细胞凋亡。图A、B、C和D分别显示不同处理组在4个象限的细胞分布，即对照(120小时)、单独1200nM的化合物A(96小时)、单独100nM的阿霉素(24小时)和包括施用100nM的阿霉素(24小时)、接着施用1200nM的化合物A(96小时)的组合。图5说明在集落形成试验中测试时，阿霉素和化合物A的组合在体外H-460非小细胞肺细胞的处理中显示协同作用。图6显示参与细胞周期调控和细胞凋亡的各种蛋白质的蛋白质印迹分析。图7a说明阿霉素(2mpk)在人类非小细胞肺癌(H-460)细胞中及化合物A(20mpk)组合在H-460异种移植模型中的体内效力。图7b说明阿霉素(2mpk)和化合物A(35mpk)的组合在H-460异种移植模型中的体内效力。图8a和8B显示研究结束时来自各组的单个小鼠的8个肿瘤的处理结束时平均肿瘤重量和SE(棒)。各自组的处理结束时的生长抑制百分比(GI)显示在各棒顶端。配对"企验用来评估不同处理组之间的差9异的统计学显著性。统计学显著的差异被认为是P〈0.05。图9显示使用C0X-2抗体的蛋白质印迹。发明详述现在已经发现，包含选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的常规细胞毒性抗肿瘤剂和选自式I的化合物(如本文所述)或其药学上可接受的盐或溶剂化物的CDK抑制剂的本发明的新组合在用于治疗癌症、尤其是实体肿瘤时显示协同效应。用于本发明的药物组合中的CDK抑制剂选自如本文下面所述的式抑制剂。式I的化合物是有希望的CDK抑制剂，其可以抑制许多癌细胞的增殖。用于本发明中的式I的化合物对于各种实体和血液恶性肿瘤是有效的。本发明的发明者观察到，将式I的CDK抑制剂与选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨的常规细胞毒性抗肿瘤剂组合导致细胞凋亡或程序性细胞死亡的增加。用于本发明的CDK抑制剂选自下列式I代表的化合物，其中，Ar是苯基，其是未取代的或被选自以下的1、2或3个相同或不同的取代基取代如氯、溴、氟或硤的卤素、硝基、氰基、C广C4烷基、三氟曱基、羟基、C广C4烷氧基、羧基、C广C4烷氧羰基、CONH2和NR^R2;其中，R!和R2各独立地选自氢或C广Ct烷基。PCT专利公开WO2004004632公开了式I的化合物(其可以是药学式1上可接受的盐和溶剂化物的形式)的制备，和包含上述化合物的口服和/或肠胃外施用的药物组合物的制备。这项专利(本文引入作为参考)披露了式I代表的CDK抑制剂显示明显的抗癌效力。如上文表明，可以以其盐或溶剂化物的形式使用式I的CDK抑制剂。优选的式I化合物的盐包括盐酸盐、曱磺酸盐和三氟醋酸盐。本领域的技术人员可以理解式I的化合物包含至少两个手性中心。因此，式I的化合物以两种不同光学异构体的形式存在(即，(+)或(-)对映异构体)。所有这些对映异构体及其混合物(包括外消旋混合物)都包括在本发明的范围之内。可以通过PCT专利申请公开WO2004004632和申请人的未决国际专利申请PCT/IB2006/052294中所公开的方法获得式I化合物的对映异构体，本文完整引入这些专利申请作为参考。也可以通过本领域熟知的方法如手性HPLC和酶法拆分获得式I的化合物的对映异构体。或者，可以通过使用光学活性原料合成式I化合物的对映异构体。因此，式I的CDK抑制剂的定义包括所有可能的立体异构体及其混合物。式I的定义包括外消旋形式和分离的具有指定活性的光学异构体。用于本发明的新型药物组合中的常规细胞毒性抗肿瘤剂可以选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素、吉西他滨和通过类似的作用机制显示抗癌活性的类似细胞毒性抗肿瘤剂。紫杉醇是一种从短叶紫杉(raxM6rev,/o//a)分离的天然二萜产物(Rowinsky等人，J.Natl.CancerInst"82，1247-1259(1990))。J.Am.Chem.Soc.93,2325(1971)公开了紫杉醇的分离及其结构。它是促进从微管蛋白二聚体组装微管并通过防止解聚稳定微管的抗微管剂(antimicrotubuleagent)。已批准紫杉醇临床用于卵巢癌的治疗(Merkman等人；YaleJournalOfBiologyandMedicine,64:583,1991)和用于乳腺癌的治疗(Holmes等人；J.Nat.cancerInst"83;1797，1991)，但是，它也可用于治疗其它癌症，例如，它已经被认为是治疗头颈癌(Forastire等人，Sem.Oncol"20:56,1990)和肺癌(M.Ghaemmaghami等人；Chest;113;86-91(1998))的潜在候选药物。美国专利5,670,537公开了紫杉醇，本文引入其紫杉醇用于治疗易感性的癌症的用途的记载作为参考。紫杉醇作为注射液Taxol⑧是市售的。作为单药使用紫杉醇通常伴随不希望的副作用，包括过敏反应、低血压、心动过緩、高血压、恶心和呕吐及注射部位反应。多西他赛属于紫杉烷(taxane)家族，是紫杉醇的半合成衍生物。多西他赛表明主要用于治疗乳腺癌和非小细胞肺癌。它还可用于治疗其它癌症。美国专利4,814,470公开了这种化合物，本文引入其对于多西他赛的合成和用于治疗易感性癌症的用途的记载作为参考。多烯紫杉醇三水合物(Docetaxeltrihydrate)作为注射液Taxotere⑧是市售的。基于紫杉醇类(taxoid)衍生物(包括多西他赛)的所有治疗可以显示严重和麻烦的毒性如骨髓抑制、中性白细胞减少、超敏反应、周围神经病变和体液潴留等(Fumoleau等人，Bull.Cancer，(82)8:629-636(1995))。阿霉素是Adriamycin⑧的通用名称，且作为注射剂是市售的。阿霉素首先乂人波赛链霉菌青灰变种(5V^ptow^c^y/7ewce"'wsw/rca^s7'ws)的发酵液分离(美国专利3,590,028)。这种细胞毒性抗肿瘤剂主要通过平面蒽环类的核与DNA双螺旋特异性插入结合核酸，导致异常的细胞复制。阿霉素用于治疗乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌和曱状腺癌，骨与软组织肉瘤，淋巴瘤和白血病，以及儿童肺瘤。阿霉素的使用通常伴随着一些副作用，包括骨髓抑制、恶心和呕吐、粘膜与皮肤的和心脏的效应。吉西他滨是2'-脱氧-2'，2'-二氟胞苷(difluorocytidine)的通用名称。它作为单盐酸盐和J3-异构体是市售的。美国专利4,808,614和5，464，826公开了吉西他滨，本文引入其对于吉西他滨的合成和用于治疗易感性癌症的用途的记载作为参考。盐酸吉西他滨的商业制剂作为单一药剂对于局部晚期或转移性胰腺癌或肺细胞癌(NSCLC)的患者是一线治疗药物，且通常用于以前用5-氟尿嘧啶治疗的患者。除非另有说明，上下文使用的一般术语优选在本公开的上下文中具有以下含义单数形式"a，""an，"和"the"包括复数指代，除非文中另有明确指出。12术语"抗肿瘤剂"与"化疗药物"或"抗癌剂"同义，指通过抑制或防止肿瘤生长发挥作用的治疗剂。术语"抗肿瘤剂"或"抗癌剂"一般指防止癌细胞繁殖的化合物(即抗增殖剂)。一般来说，抗肿瘤剂分为两类，抗增殖细胞毒性和抗增殖细胞抑制。细胞毒性药物通过(1)干扰细胞复制DNA的能力和(2)在癌细胞中诱导细胞死亡和/或凋亡而防止癌细胞繁殖。抗增殖细胞抑制剂通过调整、干扰或抑制对细胞增殖进行调控的细胞信号传导的过程发挥作用。在本发明中，包含在本发明的药物组合中的抗肿瘤剂是细胞毒性药物，因此被称为细胞毒性抗胂瘤剂。如本文所用，术语"协同的"是指本发明的方法和组合所取得的效果大于分别使用细胞毒性抗肺瘤剂或其药学上可接受的盐和式I的CDK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物产生的效应的总和。有利地，这种协同作用在相同的剂量下提供更高的效力，和/或防止或延迟多药抗性的建立。如本文所用，术语"治疗有效量"是指以对于非增殖细胞的最小毒性产生增殖细胞的最大凋亡的化疗药物的量。术语"细胞凋亡，，指其中细胞中的一系列分子步骤导致其死亡的细胞死亡类型。这是机体排除不需要或不正常细胞的正常方式。在癌细胞中细胞凋亡的过程可能被阻断。细胞凋亡也被称为程序性细胞死亡。(癌术i吾字典。国立癌症研究所(Dictionaryofcancerterms.NationalCancerInstitute))。如本文所用，术语"增加细胞凋亡"定义为程序性细胞死亡的速度提高，即与暴露于(接触)单独的细胞毒性抗肿瘤剂或单独的CDK抑制剂，更多的细胞被诱导进入死亡程序。本文中所用的术语"受试者"指的是已成为治疗、观察或实验的对象的动物，优选哺乳动物，最优选人类。在一种实施方式中，本发明涉及用于治疗癌症的新的药物组合，其中，所述组合包含选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素或吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂和至少一种选自式I的化合物(如本文所述)或其药学上可接受的盐或溶剂化物的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。在一种实施方式中，如本文所述的包含式I的CDK抑制剂和细胞毒性抗肿瘤剂的药物组合并不专门限于通过所述成分的物理结合获得的那些组合，而是也包括那些允许单独施用的组合，单独施用可以是同时、顺序或在一段时间内间隔施用，以便取得组合的最大的效力。因此，为了进行有效的癌症治疗，可以同时或在一4更时间内间隔施用药物组合。出于本发明的目的，选自式I的化合物的CDK抑制剂可以在例如细胞毒性抗肿瘤剂之前、之后或同时施用。在本发明的优选的实施方式中，在施用CDK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物之前，以下述剂量范围施用细胞毒性抗肿瘤剂或其药学上可接受的盐。然而，可以由本领域的技术人员按照常规技术和本说明书中包含的信息适当地选择给定条件下施用CDK抑制剂和细胞毒性抗肿瘤剂的最佳方法和顺序。在一种实施方式中，由于其不同的物理和化学特性，包含在组合中的成分可以通过不同途径施用。例如，可以口服或肠胃外施用式I的CDK抑制剂以产生并保持其良好的血液水平，而细胞毒性抗肿瘤剂可以通过静脉内、皮下或肌肉内途径进行肠胃外施用。对于口服使用，式I的CDK抑制剂可以，例如，以片剂或胶嚢、粉末、分散颗粒或扁嚢剂的形式，或作为水溶液或悬浮液施用。在用于口服的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖、玉米淀粉、碳酸镁、滑石粉和糖，且通常加入润滑剂如硬脂酸镁。对于胶嚢形式的口服施用，有用的载体包括乳糖、玉米淀粉、碳酸镁、滑石粉和糖。对于肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内的使用，通常采用有效成分(细胞毒性抗肺瘤剂或CDK抑制剂)的无菌溶液，且溶液的pH值应适度调整和緩沖。在另一种实施方式中，本发明涉及癌症的治疗方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的所述组合。因此，在本发明的方法中，通过与治疗有效量的选自式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的CDK抑制剂结合向受试者施用治疗量的有效治疗癌症的细胞毒性抗肿瘤剂治疗受试者的癌症，其中产生协同作用。正如上文指出的，药物组合物中包含的活性成分可以同时或顺序施用。因此，根据本发明，治疗癌症的方法包括与治疗量的式I的化合物代表的CDK抑制剂同时向需要这种治疗的受试者施用治疗量的细胞毒性抗肿瘤剂。在一种实施方式中，癌症的治疗方法包括向需要这种治疗的受试者顺序施用治疗量的细胞毒性抗肿瘤剂和治疗量的式I的化合物代表的CDK抑制剂。在另一种实施方式中，癌症的治疗方法包括在施用式I的化合物代表的CDK抑制剂之前向需要这种治疗的受试者施用治疗量的细胞毒性抗肿瘤剂。本发明的方法和药物组合可用于治疗选自乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结直肠癌和肝细胞癌的癌症。在一种优选的实施方式中，本发明的药物组合可以用于治疗选自非小细胞肺癌和胰腺癌的癌症。组合中包含的活性成分的实际剂量可以随患者的需要和待治疗的病症的严重性而变化。本领域的技术人员可以确定特殊情况的适当剂量。一般来说，以比化合物的最佳剂量低的较小剂量开始治疗。随后，各种成分的剂量少量增加，直至达到在这种情况下的最佳效果为止。然而，药物组合中各种成分的量通常低于其单独施用时产生治疗作用的量。为方便起见，每日总剂量可以按照需要分成几份并在这一天内按份施用。在一种优选的实施方式中，以注射的形式顺序施用细胞毒性抗肿瘤剂或其药学上可接受的盐，以及式I的化合物代表的CDK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物，从而以10mg-1400mg、优选15mg-1000mg的协同有效剂量施用细胞毒性抗肿瘤剂，和以5mg-750mg、优选10mg-300mg的协同有效剂量施用CDK抑制剂。在本发明的一种优选的实施方式中，当细胞毒性抗肺瘤剂是紫杉醇时，它以30mg-300mg的协同有效剂量施用。在本发明的另一种优选的实施方式中，当细胞毒性抗肺瘤剂是多西他赛时，它以20mg-175mg的协同有效剂量施用。在本发明的更另外的一种优选的实施方式中，当细胞毒性抗肿瘤剂是阿霉素时，它以17.5mg-75mg的协同有效剂量施用。在本发明的更另外的一种优选的实施方式中，当细胞毒性抗肿瘤剂是吉西他滨时，它以70mg-1200mg的协同有效剂量施用。已在某些分析系统中和以几个不同的体外施用时间表对本发明提供的组合进行了评估。实验细节如本文下面所述。本文提供的数据清楚地表明，细胞毒性抗肺瘤剂与式I的CDK抑制剂组合时显示协同效应。清楚地表明，在癌症治疗中抗癌剂联合使用时比仅用单独的式ICDK抑制剂或单独的细胞毒性抗胂瘤剂处理细胞时增殖细胞的细胞凋亡或细胞毒性提高。例如，可以从表2-4提供的数据清楚地观察到，CDK抑制剂(本文称为化合物A的典型的式I化合物)在体外分析中协同提高了阿霉素对于非小细胞肺癌H-460细胞的细胞毒性。代表化合物(用于药理分析的化合物A)指(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟曱基-1-曱基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸，且是一种在公布的PCT专利申请WO2004004632中公开的化合物，本文引入该专利申请作为参考。本发明者也建立了异种移植模型以将体外观察扩展到体内系统。本发明者使用SCID(严重联合免疫缺陷)雄性小鼠的非小细胞肺异种移植模型测试了本发明的组合的体内效力。观察到当与阿霉素顺序组合施用时，CDK抑制剂协同增强阿霉素的效力。从图7a和7b的图解可以明显看出本发明的药物组合在SCID小鼠的非小细胞肺异种移植模型中显示治疗协同作用。在本发明者进行的涉及使用包含常规的细胞毒性抗肿瘤剂阿霉素和另一种已知的CDK抑制剂夫拉平度的组合处理人类非小细胞肺癌H-460细胞系的平行体外研究中，发现阿霉素和夫拉平度的组合(与施用16顺序无关)产生加性效应，没有显示协同作用(表16-A,B，C)。本文下面说明这项研究的细节。因此，不能确定地预言，具有不同的作用机制的抗癌剂的组合总能产生有利的治疗作用。然而，本发明者清楚地证明本发明的新药物组合的协同效力。肿瘤剂和CDK抑制剂的组合的协同效应。应该指出，提供这些只是作为示例，而不是为了限制本发明。药理分析体外细胞毒性分析所用的细胞毒性分析是MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑錄(tetrazolium)，内盐)分析。在96孔板中以1500细胞/孔的密度在180pL培养基中接种人类非小细胞肺癌H-460细胞，并孵育过夜以4吏细胞粘附。向孔中加入在组合中包含的不同浓度的药物，并在单药物暴露的情况下在37。C、潮湿的5。/。C02培养箱中孵育合适的时间。当用两种药物处理时，施用常规的细胞毒性抗肿瘤剂(紫杉醇、多西他赛和阿霉素)3小时或24小时，接着除去培养基并用培养基洗涤细胞一次。洗涤细胞后，向孔中加入两种不同浓度的化合物A,并在37。C、潮湿的5%(302培养箱中孵育板48、72或96小时。用载体处理对照孔。在孵育结束时，从孔中除去培养基，并向各孔加入20pLMTS(2mg/mL,在pH6-6.5和无菌过滤的磷酸盐緩冲盐水中)和1]LiL的吩。秦硫酸曱酯(phenazinemethosulfate)(PMS，在pH7.3和过滤除菌的磷酸盐緩冲盐水中为3mM)，用完全培养基调节总体积至200pL。在37。C、潮湿的5%<:02培养箱中孵育板2-4小时。用分光光度计(SpectraMax，MolecularDevices)在490nM处读板，使用SoftMax(用于SpectraMax的软件)计算细胞毒性百分比和IC50。实施例1:本实施例显示阿霉素与化合物A的组合的协同效应，其中，顺序施用阿霉素和化合物A以使得在化合物A之前施用阿霉素。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物中的任一种单独处理细胞，即单独的阿霉素或化合物A。阿霉素处理首先24小时，接着完全培养基处理72小时；而在化合物A的情况下，首先完全培养基处理24小时，接着化合物A处理接下来的72小时。使用的阿霉素的浓度为100nM和200nM，而化合物A的浓度是800nM(48小时处理后的IC3。浓度)。在组合研究中，首先用200nM或100nM的阿霉素处理细胞24小时，接着800nM的化合物A处理72小时。药物处理完成后，即在96小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照比较计算细胞毒性百分比。结果如下面的表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例2:本实施例显示阿霉素与化合物A的组合的协同效应，其中，顺序施用阿霉素和化合物A以使得阿霉素在化合物A之前施用。在本实施例中，以1200nM的浓度使用化合物A。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物中的任一种单独处理细胞，即单独的阿霉素或化合物A。阿霉素处理首先24小时，接着完全培养基处理72小时；而在化合物A的情况下，首先完全培养基处理24小时，接着化合物A处理接下来的72小时。使用的阿霉素的浓度为200nM和100nM,而化合物A的浓度是1200nM(48小时处理后的IC5Q浓度)。在组合研究中，首先用100nM或200nM的阿霉素处理细胞24小时，接着1200nM的化合物A处理72小时。药物处理完成后，即在％小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照比较计算细胞毒性百分比。结果如下面的表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例3:本实施例显示阿霉素与化合物A的组合的协同效应，其中，顺序施用阿霉素和化合物A以使得在化合物A之前施用阿霉素。在本实施例中，以1200nM的浓度使用化合物A,且间隔的时间是96小时。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物中的任一种单独处理细胞，即单独的阿霉素或化合物A。阿霉素处理首先24小时，接着完全培养基处理96小时；而在化合物A的情况下，首先完全培养基处理24小时，接着化合物A处理接下来的96小时。使用的阿霉素的浓度为100nM和200nM，而化合物A的浓度是1200nM(48小时处理后的ICso浓度)。在组合研究中，首先用100nM或200nM的阿霉素处理细胞24小时，接着1200nM的化合物A处理96小时。药物处理完成后，即在120小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照比较计算细胞毒性百分比。结果如下面的表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例4:本实施例显示同时施用阿霉素和化合物A的组合120小时的协同效应。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物中的任一种单独处理细胞120小时，即单独的阿霉素或化合物A。使用的阿霉素的浓度为30nM和100nM，而以800nM和1200nM的浓度使用化合物A(48小时处理后的IC3o和IC5o浓度)。在该组合研究中，分别一起加入30nM或100nM的阿霉素和1200nM或800nM的化合物A处理120小时。药物处理完成后，即在120小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照比较计算细胞毒性百分比。结果如下面的表4所示。表4药物处理阿霉素浓度CDK抑制剂C化细胞毒(nM)合物A)浓度(nM)性％阿霉素100019300CDK抑制剂(化合物A)01200440細24阿霉素和CDK抑制剂(化合物10080061A)—起120小时30120060实施例5:本实施例表明在细胞毒性抗肿瘤剂阿霉素前施用化合物A时没有20协同效应。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物中的任一种单独处理细胞，即单独的阿霉素或化合物A。化合物A处理首先96小时，接着完全培养基处理24小时；而在阿霉素的情况下，首先完全培养基处理96小时，接着阿霉素处理24小时。使用的阿霉素的浓度为30nM、70nM、100nM和200nM，而以800nM和1200nM的浓度使用化合物A(48小时处理后的IC3o和ICs。浓度)。在该组合研究中，加入1200nM或800nM的化合物A首先96小时，接着加入30nM、70nM、100nM或200nM的阿霉素24小时。药物处理完成后，即在120小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照比较计算细胞毒性百分比。表6表明这种组合中的细胞毒性百分比低于单独施用时化合物A的细胞毒性。因此，该顺序效应是拮抗的，因为阿霉素不会增强第一种药物(在本情况中是化合物A)的效应。结果如下面的表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例l-4清楚地表明，当在细胞毒性药物之后或同时施用时，CDK抑制剂协同增强阿霉素的效应。实施例5也表明顺序处理的重要性。据发现阿霉素处理接着CDK抑制剂处理具有协同作用，而相反顺序则是无效的。实施例6:本实施例显示多西他赛与化合物A的组合的协同效应，其中，顺序施用多西他赛和化合物A以使得在化合物A之前施用多西他赛。以3000细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物的任一种单独处理细胞，即单独的多西他赛或化合物A。多西他赛处理首先3小时，接着完全培养基处理45小时；而在化合物A处理的情况中，首先完全培养基处理3小时，接着化合物A处理接下来的45小时。使用的多西他赛的浓度为0.1nM和3nM,而以700nM浓度(48小时处理后的IC3。浓度)使用化合物A。在该组合研究中，首先用0.1nM或3nM的多西他赛处理细胞3小时，接着700nM的化合物A处理45小时。药物处理完成后，即在48小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照比较计算细胞毒性百分比。结果如下面的表6所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例7:本实施例显示多西他赛与化合物A的组合的协同效应，其中顺序施用多西他赛和化合物A以4吏得在化合物A之前施用多西他赛。以3000细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物的任一种单独处理细胞，即单独的多西他赛或化合物A。多西他赛处理首先3小时，接着完全培养基处理45小时；而在化合物A处理的情况中，首先完全培养基处理3小时，接着化合物A处理接下来的45小时。使用的多西他赛的浓度为0.1nM和3nM，而以1000nM浓度〗吏用化合物A(48小时处理后的ICso浓度)。在组合研究中，首先用0.1nM或3nM的多西他赛处理细胞3小时，接着1000nM的化合物A处理45小时。板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照相比计算细胞毒性百分比。结果如下面的表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>实施例8:本实施例显示紫杉醇与化合物A的组合的协同效应，其中顺序施用紫杉醇和化合物A以使得在化合物A之前施用紫杉醇。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先用两种药物的任一种单独处理细胞，即单独的紫杉醇或化合物A。紫杉醇处理首先3小时，接着完全培养基处理45小时；而在化合物A处理的情况中，首先完全培养基处理3小时，接着化合物A处理接下来的45小时。使用的紫杉醇的浓度为10nM,而以700nM浓度〗吏用化合物A(48小时处理后的IC3。浓度)。在组合研究中，首先用10nM的紫杉醇处理细胞3小时，接着700nM的化合物A处理45小时。药物处理完成后，即在48小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照相比计算细胞毒性百分比。结果如下面的表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例9:本实施例显示吉西他滨与化合物A的组合的协同效应，其中顺序施用吉西他滨和化合物A以^使得在化合物A之前施用吉西^f也滨。以1500细胞/孔的密度接种来自人类胰腺(Panc-1)细胞系的细胞。首先用两种药物中的任一种单独处理细胞，即单独的吉西他滨或化合物A。吉西他滨处理首先24小时，接着完全培养基处理72小时。而在化合物A处理的情况中，首先完全培养基处理24小时，接着化合物A处理接下来的72小时。以70nM浓度使用吉西他滨，而以300nM浓度(48小时处理后的IC3。浓度)使用化合物A。在组合研究中，首先用70nM的吉西他滨处理细胞24小时，接着300nM的化合物A处理72小时。药物处理完成后，即在96小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照相比计算细胞毒性百分比。结果如下面的表9所示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>吉西他滨(24小时)，接着CDK抑制剂(化合物A)(72小时)200300971003008270300743030053细胞周期分布和流式细胞分析在25mm3的组织培养瓶中接种人类非小细胞肺癌H-460。24小时后，用化合物A单独处理细胞72小时或96小时，和用细胞毒性抗肿瘤剂阿霉素单独处理24小时。对于组合研究，首先用细胞毒性抗肿瘤剂阿霉素处理细胞处理24小时，接着在除去细胞毒性抗肿瘤剂并用PBS洗涤细胞两次后，用化合物A处理72小时或％小时。保留对照细胞不处理96小时或120小时。在不同时间点收获分离的和粘附的细胞。通过以1000rpm离心10分钟用大约5mL的PBS洗涤细胞两次。将纟田月包再悬浮于500pL的PBS中，并在500pL冰冷的70。/。乙醇中固定。固定的细胞在室温下孵育30分钟，以1000rpm旋转IO分钟。向细胞团中加入1mL冷冻的70%乙醇，然后将细胞团保存在冰箱中直至进一步分析。用PBS洗细胞两次以除去固定剂，并再悬浮于250|liLPBS中。向其中加入50inL的碘化丙啶(在PBS中为4mg/mL)和12.5核糖核酸酶A(1mg/mL)。在37。C下孵育30分钟后，使用流式细胞仪分析细力包。按照制造商的建议使用BectonDickinsonFACSCalibur流式细胞仪。使用设定在488nm的氩离子激光器作为激发源。通过红色荧光水平确定，具有2n和4n之间的DNA含量的细胞被认定处于细胞周期的G!、S和G2/M期。显示少于2n的DNA含量的细胞认定为亚G!细胞。各个细胞周期分区中的细胞数表示为存在的细胞总数的百分比。实施例10:本实施例给出图1所示的各种处理的细胞周期分布。对于处理组，在组织培养瓶接种大约1-2x106细胞。分析方案是在上文"细胞周期分25布和流式细胞分析"中提到的。细胞周期分为4个部分，在图1中用Ml、M2、M3和M4来代表。M1对应于亚G1期，M2对应于S期，M3对应于G2-M期，和M4对应于亚G1期，其代表发生凋亡的细胞。其中没有药物处理的96小时对照显示出只有2%的可忽略的细胞凋亡，而单独的任一药物的处理组显示对于单独的化合物A和阿霉素都只有10%的细胞凋亡。两种药物的组合显示34%的更高的细胞凋亡。实施例11:本实施例给出图2所示的各个处理组的细胞周期分布。对于处理组，在组织培养瓶接种大约1-2x106细胞。分析方案是在上文"细胞周期分布和流式细胞分析"中提到的。细胞周期分为4个部分，在图中用M1、M2、M3和M4来代表。M1对应于G1期，M2对应于S期，M3对应于G2-M期，和M4对应于亚G1期，其代表发生凋亡的细胞。其中没有药物处理的120小时对照显示只有8%的可忽略的细胞凋亡，而单独的任一药物的处理组显示对于化合物A和阿霉素分别有32%和3%的细胞凋亡。两种药物的组合显示65%的更高的细胞凋亡。实施例12:本实施例给出图3所示的各个处理组的细胞周期分布。对于处理组，在组织培养瓶接种大约1-2x106胰腺细胞(Panc-1)。分析方案是在上文"细胞周期分布和流式细胞分析"中提到的。细胞周期分为4个部分，在图中用M1、M2、M3和M4来代表。M1对应于G1期，M2对应于S期，M3对应于G2-M期，和M4对应于亚G1期，其代表发生凋亡的细胞。其中没有药物处理的96小时对照显示只有2.1%的可忽略的细胞凋亡，而单独的任一药物的处理组显示对于化合物A和吉西他滨分别有4.3%和1.7%的细胞凋亡。两种药物的组合显示25.4%的提高的细胞凋亡。实施例13:膜联蛋白V-FITC染色(对于早期凋亡的检测)膜联蛋白V-FITC是用于识别凋亡细胞的灵敏探针。在早期细胞凋亡过程中，膜磷脂磷脂酰(phosphotidyl)丝氨酸(PS)从质膜的内小叶(leaflet)转移到外小叶，从而将PS暴露于外部细胞环境。膜联蛋白V是35-36kDa的钩磷脂结合蛋白，其对于PS具有高亲和性并与具有暴露的PS的细胞结合。碘化丙啶(PI)是通过渗漏的膜(leakymembranes)进入细胞的极性染料，并因此用于与FITC结合而检测晚期凋亡。在25mm3的组织培养瓶中接种人类非小细胞肺癌H-460。24小时后，分别用1200nM的化合物A或100nM的阿霉素单独处理细胞96小时和24小时。对于组合研究，首先用100nM的细胞毒性抗肿瘤剂阿霉素处理细胞24小时，接着在除去细胞毒性抗肿瘤剂(阿霉素)并用培养基洗涤细胞一次后，用1200nM的化合物A处理96小时。保留对照细胞不处理120小时。收集含有漂浮细胞的培养基，并在不同时间点用胰蛋白酶收获后与粘附细胞合并。通过以1000rpm离心IO分钟用冷的PBS洗涤细胞两次。将细胞团以1x106细胞/毫升的浓度再悬浮于IX结合緩沖液(10mmHEPESpH7.4，140mMNaC1,2.5mMCaCl2)中。100|il溶液(lxl()S细胞)用膜联蛋白V-FITC和碘化丙口定染色。在室温下、黑暗中孵育细胞15分钟，并通过流式细胞仪分析样品。按照制造商的建议，BectonDickinsonFACSCalibur流式细胞仪用于这些研究。使用设定在488nm的氩离子激光器作为激发源。图4表明4个象限的细胞分布。位于左下角(LL)的象限1显示FITC和PI阴性的细胞，表明细胞是健康的。位于右下角(LR)的象限II是仅对PI阳性的细胞，表明这些细胞是完全凋亡的。右上角(UR)的象限III是对膜联蛋白和PI都是阳性的细胞，表明这些细胞正从早期凋亡进入晚期凋亡。左上角(UL)的象限IV显示只有膜联蛋白阳性的细胞，表明这些细胞处于早期凋亡。如果细胞即使在终止接触化合物之后仍继续进入细胞凋亡，它们会对于膜联蛋白染色阳性。细胞一旦处于早期凋亡，则转入程序性细胞死亡并且处于非反转点(apointofnoreturn)。结果如表10所示。据发现，相比于两种药物单独处理，组合中比例最高的细胞处于早期或早期到晚期凋亡。表10药物处理活细胞膜联蛋白+膜联蛋白和PI十PI+载(%)(健载体(％)(处栽体(％)(处于体(％)康细胞)于早期凋亡早期到晚期凋(死亡的的细胞)亡的细月包)细胞)对照90.5342.3阿霉素(100nM)6030.48.61CDK抑制剂(化合5338.58.20.3物A)(1200nM)阿霉素，接着CDK14.158.227.31抑制剂(化合物A)实施例14:集落形成试验(Clonogenicassay):以750-1000细胞/35mm组织培养级平板的密度接种人类非小细胞肺癌细胞(H-460)。在37。C下孵育过夜以使细胞粘附于平板。用细胞毒性抗肿瘤剂处理细胞处理24小时，接着洗涤细胞，并加入包含化合物A的新鲜培养基96小时。在处理结束时，培养基再次用新鲜的包含10%FCS的完全培养基替换，并孵育7-14天以形成集落。一旦平板上出现可见集落，除去培养基，并用2:1比例的曱醇:乙酸混合物固定集落5分钟。用水洗涤板，并重复固定程序。干燥板，并用0.1%结晶紫染色3-5分钟。用水仔细漂洗板，干燥并在Geldoc对集落计数。分别单独用1200nM的化合物A或100nM的阿霉素处理细胞96小时和24小时，或者用100nM的阿霉素，接着1200nM的化合物A的组合处理96小时。图5表明了组合的协同效应，因为相比于对照或单独的任一药物，在组合中只看到一个集落。28处理后的恢复实验化合物A和阿霉素的单独处理或联合处理的分析方案与细胞周期分布的分析中所述一样。药物处理后，使得这些细胞在新鲜的含有10%FCS的完全培养基中恢复。在任一药物单独处理和组合处理的0、6、18、24和48小时的时间点，通过FACS分析恢复中的细胞。在下面的实施例中，细胞的恢复由发生凋亡的细胞的百分比表示。实施例15:只用细胞毒性抗肿瘤剂阿霉素处理细胞24小时，接着除去培养基并用新鲜的完全培养基替换。如特别用来确定药物处理结束后的恢复期中发生凋亡的细胞的百分比的方法中所述的进行FACS分析。在恢复期的0、6、18、24和48小时测定细胞凋亡。在24小时药物处理结束时，细胞凋亡的百分比是3%，其在恢复期没有明显增加，表明细胞最终从药物处理中恢复。结果如表ll所示。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>实施例16:如方案中所述进行分析。只用化合物A处理细胞96小时，接着除去培养基并用新鲜的完全培养基替换。如用来测定药物处理结束后的恢复期中发生凋亡的细胞的百分比的方法中所述的进行FACS分析。在恢复期的0、6、18、24和48小时测定细胞凋亡。在96小时药物处理结束时，细胞凋亡的百分比是32%，其在48小时的恢复结束时从24%下降到19%,表明细胞在恢复期间恢复逐渐增加。结果如表12所示。表12只用化合物A处理96小时后，在0、6、18、24和48小时的细胞恢复<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例17:如方案中所述进行分析。只用阿霉素处理细胞24小时，接着化合物A处理细胞96小时，接着除去培养基并用新鲜的完全培养基替换。如用来测定药物处理结束后的恢复期中发生凋亡的细胞百分比的方法中所述的进行FACS分析。在恢复期的0、6、18、24和48小时测定细胞凋亡。在药物处理结束时，细胞凋亡的百分比是55%。在恢复期间，在6小时结束时，另外的32%进入细胞凋亡，细胞凋亡百分比在恢复期的48小时结束时增加到57%，表明细胞在恢复期没有恢复，反而继续发生凋亡。结果如表13所示。表13用阿霉素处理24小时，接着用化合物A处理96小时后，在0、6、18、24和48小时的细胞恢复<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>0小时恢复556小时恢复3218小时恢复3424小时恢复4948小时恢复57实施例18:蛋白质印迹分析人类非小细胞肺癌(H-460)细胞未经处理(即，对照细胞)或用100nM的阿霉素单独处理24小时或用1200nM的化合物A单独处理96小时。在组合处理中，细胞首先用100nM的阿霉素处理24小时，接着1200nM的阿霉素处理96小时。在处理期结束时，细胞裂解，并使用布拉德福德试剂(Bradfordreagent)估计裂解产物的蛋白质含量。将40昭的蛋白质加载在SDS-PAGE上，并转移到PVDF膜。用p53、Bax、Bcl-2、细胞周期蛋白D1、Cdkl和肌动蛋白抗体探测膜。一级抗体用辣才艮过氧化物第二抗体检测，并经westpico化学发光试剂处理。图6显示涉及细胞周期调控和细胞凋亡的各种蛋白质的蛋白质印迹分析。等量的蛋白质是加载在4条道中。用图例(figurelegend)描述孔中加载的不同样品。结果表明，与任一药物单独处理相比，在组合处理中抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调，这几乎等同于对照。这与在FACS分析的组合处理中可见的凋亡增加相关。在所有处理样品中，促凋亡蛋白Bax相对于对照略有上调。在组合处理中肿瘤抑制蛋白p53相比于对照明显上调，但不如其它两个处理组那么多。Cdkl-Bl是有丝分裂的引发剂。这种酶的去调节(deregulation)导致肺瘤发生。因此，抑制Cdkl将抑制其活性并因此启动有丝分裂和细胞增殖。图表明，阿霉素明显诱导Cdkl水平，而加入化合物A降低Cdkl至可忽略的水平，从而阻止细胞进入有丝分裂。单独的化合物A显示与对照相等的水平。细胞周期蛋白Dl的水平在各处理组中没有显示明显变化。在组合处理中，水平等同于对照，而在化合物A和阿霉素单独处理中，发现水平略有下降。31实施例19:本实施例显示阿霉素和CDK抑制剂(化合物A)的组合在非小细胞肺(H-460)异种移植模型中的体内效力测试。从美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC),USA获得的人类非小细胞肺癌(H-460)细胞系用于这项研究。通过将化合物溶于盐水制备用于腹腔注射(i.p.)的阿霉素和化合物A。使用体重为20g的一组36只雄性的6-8周龄的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。在37。C、5。/。C02培养箱中，人类非小细胞肺癌(H-460)细胞在含有10%的胎牛血清的RPMI1640培养基上生长。通过以1000rpm离心10分钟使细胞沉淀。细胞再悬浮于盐水中，以得到25X106细胞/毫升的计数，通过皮下(s.c.)途径向SCID小鼠注射0.2毫升的这种细胞悬液。每隔一天观察小鼠的可触知的肿瘤块。一旦肿瘤的大小达到5-7毫米直径，动物随机分入如下面表14标明的各处理组。如表15所示，每周施用阿霉素一次，而连续5天每天一次施用化合物A。首次施用阿霉素6小时的间隔后施用化合物A，接着在构成一个周期的5天的时间中每天施用化合物A。在两天的间隔后，开始下一周期。处理包括总共2个周期。每天记录体重。每隔一天记录肿瘤大小和其它毒性症状。没有发现明显的体重减轻或病态症状。按长椭球公式估计肿瘤重量(mg):(长度(mm)x[宽度(mm)"x0.5)，假设比重是1且兀是3。在化合物处理的动物中的肺瘤生长计算为T/C(处理/对照)x100%，且生长抑制百分比(GI%)为[100-T/C。/0]。结果如图7a、7b、8和9中图形所示。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>S-盐水，P-化合物A，D-阿霉素。M、T、W、T和F:周工作日(星期一、星期二、星期三、星期四和星期五)">，，表示在化合物A之前施用阿霉素。实施例20:使用COX-2抗体的蛋白质印迹分析图9表明使用COX-2抗体的蛋白质印迹分析。用图例描述孔中加载的不同的样品。结果表明对照显示低的COX-2的基础水平。单独的化合物A也显示COX-2的低水平。阿霉素强烈诱导的COX-2,其通过NFKB信号传导途径导致药物抗性。在阿霉素之后加入化合物A明显下调COX-2。因此，化合物A对NFkB介导的C0X-2抑制可能参与抑制肿瘤的生长和在人类非小细胞肺癌(H-460)肺瘤异种移植物中阿霉素诱导的药物:沆性。实施例21:阿霉素和夫拉平度在人类非小细胞肺癌细胞系(H-460)中的组合研究本实施例说明，在施用细胞毒性抗肺瘤剂阿霉素后(表16A)、前(表16B)或伴随(表16C)施用夫拉平度没有协同效应。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。按照表16A,首先单独使用任一药物(即，单独的阿霉素或单独的夫拉平度)处理细胞。阿霉素处理进行首先24小时，接着完全培养基处理96小时；而在夫拉平度的情况中，首先完全培养基处理24小时，接着夫拉平度处理接下来的96小时。所用的阿霉素的浓度为30nM、70nM、100nM和200nM,而以200nM和350nM的浓度使用夫拉平度(分别是48小时处理后的IC3o和ICso浓度)。在组合研究中，首先用30nM、70nM、100nM和200nM的阿霉素处理细胞24小时，接着200nM和350nM的夫拉平度处理96小时。药物处理完成后，即在120小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照相比计算细胞毒性百分比。结果如下面的表16A所示。按照表16B，首先单独使用任一药物(即，单独的阿霉素或单独的夫拉平度)处理细胞。首先夫拉平度处理进行96小时，接着完全培养基处理24小时；而在阿霉素的情况中，首先完全培养基处理96小时，接着阿霉素处理24小时。所用的阿霉素的浓度为30nM、70nM、100nM和200nM,而以200nM和350nM的浓度使用夫拉平度(48小时处理后的IC3。和IC5o浓度)。在该组合研究中，加入200nM或350nM的夫拉平度前96小时，接着30nM、70nM、100nM或200nM的阿霉素24小时。药物处理完成后，即在120小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照相比计算细胞毒性百分比。结果如下面的34表16B所示。表16C显示，同时施用阿霉素和夫拉平度的组合120小时没有协同效应。以1500细胞/孔的密度接种人类非小细胞肺癌H-460细胞。首先单独使用任一药物，即，单独的阿霉素或单独的夫拉平度处理细胞120小时。所用的阿霉素的浓度为30nM、70nM、100nM和200nM,而以200nM和350nM的浓度使用夫拉平度(48小时处理后的IC3()和~1<:50浓度)。在该组合研究中，分别一起加入30nM、70nM、100nM或200nM的阿霉素和200nM或350nM的夫拉平度进行处理120小时。药物处理完成后，即在120小时结束时，板进行处理以进行MTS生存力分析，并与对照相比计算细胞毒性百分比。结果如下面的表16C所示。表16在H-460细胞系中的阿霉素和夫拉平度的组合研究A)阿霉素，接着CDK抑制剂(夫拉平度)Doxo(24小时)>FP(200nM)(96小时)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>B)夫拉平度，^接着阿霉素FP(96小时)(200nM)>Doxo(24小时)FP(96小时)(350nM)>Doxo(24小时)Doxo,浓度细胞毒性％Doxo,浓度细月包毒小生%200nMFP>Doxo26200nMFP〉Doxo80100nMFP>Doxo26100nMFP〉Doxo7570nMFP>Doxo2670nMFP>Doxo7930nMFP>Doxo2430nMFP>Doxo77FP200nM29FP350nM73'〉'表示在另一药物之前施用一种药物,c)同时施用的夫拉平度和阿霉素Doxo+FP(200nM)(120小时)Doxo,浓度细胞毒性％200nMDoxo.48Doxo.+FP68100nMDoxo.24Doxo.+FP6270nMDoxo.28Doxo.+FP6530nMDoxo.2Doxo.+FP35FP200nM39Doxo+FP(350nM)(120小时)Doxo,浓度细胞毒性%200nMDoxo.48Doxo.+FP88100nMDoxo.24Doxo.+FP8570nMDoxo.28Doxo.+FP8730nMDoxo.2Doxo.+FP80FP350nM81Doxo=阿霉素，FP二夫拉平度"+"表明同时施用药物。3权利要求1.一种药物组合，包含选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂，和CDK抑制剂或其对映异构体或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述CDK抑制剂由下面的式I代表；式1其中，Ar是苯基，其是未取代的或被选自以下的1、2或3个相同或不同的取代基取代选自氯、溴、氟或碘的卤素、硝基、氰基、C1-C4烷基、三氟甲基、羟基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4烷氧羰基、CONH2和NR1R2；其中，R1和R2各独立地选自氢或C1-C4烷基。2.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述CDK抑制剂是式I的化合物，其中，所述苯基被选自以下的l、2或3个相同或不同的取代基取代选自氯、溴、氟或硤的卤素、C广C4烷基或三氟甲基。3.如权利要求2所述的药物组合，其中，所述CDK抑制剂是式I的化合物，其中，所述苯基被选自氯、溴、氟或石典的l、2或3个卤素取代。4.如权利要求3所述的药物组合，其中，所述CDK抑制剂是式I的化合物，其中，所述苯基被氯取代。5.如权利要求2所述的药物组合，其中，所述CDK抑制剂是式I的化合物，其中，所述苯基被l、2或3个三氟甲基基团取代。6.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述由式I的化合物代表的CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-l-曱基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或其药学上可接受的盐。7.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述细胞毒性抗肿瘤剂是紫杉醇。8.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述细胞毒性抗肺瘤剂是多西他赛。9.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述细胞毒性抗肿瘤剂是阿霉素。10.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述细胞毒性抗肿瘤剂是吉西他滨。11.如权利要求1所述的药物组合，其中，所述组合适合用于治疗选自乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卯巢癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和肝细^<癌的癌症。12.如权利要求11所述的药物组合，其中，所述癌症是非小细胞肺癌或胰腺癌。13.—种治疗需要治疗的受试者的选自乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和肝细胞癌的癌症的方法，其中，所述方法包括施用权利要求1所述的药物组合。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述癌症是非小细胞肺癌或胰腺癌。15.—种治疗需要治疗的受试者的选自乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌和肝细胞癌的癌症的方法，其中，向需要治疗的受试者施用权利要求1所述的药物组合，使得同时或顺序施用治疗量的选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂，和治疗量的由式I的化合物代表的CDK抑制剂或其对映异构体或药学上可接受的盐或溶剂化物。16.如权利要求15所述的方法，其中，同时施用治疗量的选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂，和治疗量的由式I的化合物代表的CDK抑制剂或其对映异构体或药学上可接受的盐或溶剂化物。17.如权利要求15所述的方法，其中，顺序施用治疗量的选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肺瘤剂，和治疗量的由式I的化合物代表的CDK抑制剂或其对映异构体或药学上可接受的盐或溶剂化物。18.如权利要求17所述的方法，其中，在治疗量的由式I的化合物代表的CDK抑制剂或其对映异构体或药学上可接受的盐或溶剂化物之前施用治疗量的选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素和吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂。19.如前述权利要求13-18中的任一项所述的方法，其中，所述组合显示治疗的协同作用。全文摘要本发明涉及包含一种选自紫杉醇、多西他赛、阿霉素或吉西他滨或其药学上可接受的盐的细胞毒性抗肿瘤剂，和至少一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的新的药物组合；其中，所述组合在用于治疗癌症时显示协同效应。本发明还涉及使用治疗有效量的所述组合治疗癌症的方法。文档编号A61K31/522GK101677567SQ200780052995公开日2010年3月24日申请日期2007年5月15日优先权日2007年5月15日发明者H·克汉瓦尔卡尔,K·乔施,M·拉索斯,S·沙玛申请人:皮拉玛生命科学有限公司