分枝杆菌提取物的研究和应用的制作方法

专利名称：：分枝杆菌提取物的研究和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
及微生物制品药物用途领域，一种利用生化提取的分枝杆菌有效成分，以及该制剂在结核病新疫苗预防结核病和结核病免疫治疗中的应用。
背景技术：
：结核分枝杆菌(简称结核杆菌)是结核病的致病菌，每年全世界大约三百万人罹患结核杆菌导致的结核病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，病人人数居世界第二位，仅次于印度。近年来，结核病的发病人数在我国又呈上升趋势。2000年全国结核病第四次流行病学调查显示我国感染人数多(多达5.5亿，感染率45%，明显高出全球平均感染水平)、患病人数多(活动性肺结核患者约500万人)、新发患者多(新发活动性肺结核患者约150万人/年)、死亡人数多(约20万人/年死于结核病)、耐药患者多(约30%患者耐药)。以上数据说明全球、特别是中国结核病控制任务十分艰巨和迫切。结核病是一种呼吸道传染病，对于传染病预防、控制，疫苗是最有效手段。.卡介苗(BCG)是目前唯一的结核病疫苗，其是一种减毒活疫苗，于1921年由法国的Calmette和Guerin对牛型结核杆菌连续13年传代230代后毒力减弱后研制成功的疫苗，为了纪念这两位医生的伟大贡献，将预防结核病的疫苗称为卡介苗(BacilleCalmetteGuerin，简称BCG)。由于当时无冷冻保藏技术，菌抹在斜面上生长，还由于战争等因素，最早研制的BCG菌抹可能已丟失，现在全世界生产BCG疫苗的菌株有多抹，我国BCG菌抹是丹麦株。BCG为新生儿接种疫苗，能预防儿童重症结核病，如结核性脑膜炎、粟粒性结核，《旦它对肺结核预防作用未得到肯定[BailyGV,etal,Ind.J.Med.Res.，72:1-74，1980]。BCG对暴露于环境分枝杆菌和已感染结核杆菌的人群无保护作用[BrandtL.,etal.Infect.Immun.,70:672-678，2002]。鉴于此，我国已于2000年停止成人卡介苗接种。为了提高结核病"^断，在结核病低发病率国家，新生儿已不再接种卡介苗。BCG为活疫苗，不能用于免疫功能低4下人群，例如艾滋病患者的结核病的预防，而免疫功能低下或缺陷的人群又是结核病易感人群。美国在上世纪八十年代中后期，结核病出现回升，结核病新疫苗研制引起全球重^L，WHO在上世纪末成立了结核病疫苗研制小组。我国是结核病高发区，有近5.5亿人感染结核杆菌，其中10%感染者会发展成结核病。预防结核杆菌感染人群发展成结核病，可降低结核病发病率，这在结核病控制中会起到事倍功半的效果。高危人群一般采用口服异烟肼预防，需较长时间服用，不易坚持，并且异烟肼常见周围神经炎、肝功能损害副反应，同时还见致癫痫、致精神障碍、植物神经功能紊乱等特殊副反应[郭丽萍等，中国煤炭工业医学^^志，3(9):940-941，2000]。所以高危人群需疫苗进行预防，这样简单、方便，并且副作用小。报道的结核病新型疫苗分为两大类，即菌体活疫苗(包括减毒活疫苗、重组卡介苗)和非菌体疫苗(包括蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗)。减毒活疫苗一般为营养缺陷菌抹，如亮氨酸合成缺陷的菌林。已报道fadD26基因突变结核杆菌菌株，fadD26基因产物类似乙酰辅酶A,负责phthioceroldimycocerosates合成，fadD26突变引起结核杆菌毒力降低[InfantE,etal.ClinicalandExperimentalImmunology,141:21-28,2005]。减毒菌才朱存在返祖的隐患[SampsonSL,etal,Infect.Immun.,72:3031-3037,2004]。菌体活疫苗对于免疫功能低下人群不能接种，—同时可能与BCG具有相同命运，即对已感染人群无保护作用。DNA疫苗一出现，由于刺激机体细胞免疫，结核病DNA疫苗研究成为热点，多篇文章报道DNA疫苗[SugawaraI,etal，Tuberculosis,83:331-337,2003]。DNA疫苗是通过编码基因与真核载体连接，构建重组真核表达载体，通过大肠杆菌进行重组质粒扩增后，抽提重组表达载体DNA,DNA经严格纯化后，棵露的DNA经肌肉注射进行免疫。经过不同课题组研究发现，DNA疫苗和蛋白亚单位疫苗作为治疗性疫苗安全、可靠、效果较好。我国耐药患者多，约30%患者耐药，近40年来未见化疗治疗结核病新药上市，-同时化疗面临结核病耐药率居高不下的难题。耐药病人釆用免疫治疗以提高化疗效果是目前解决'耐药病人和难治结核病人的方法之一。目前，临床上用于结核病免疫治疗药主要是注射用胸腺肽和冻干治疗用母牛分枝杆菌菌苗-";徵卡"(其英文名称为thymopolypeptidesforinjection和Freeze-driedM.VaccaeVaccineforTherapy-Vaccae)。胸腺肽有发热、发烧不良反应。母牛分枝杆菌(M.Vaccae)通过破细胞而制备的名为'微卡，的无细胞菌苗[王国治，中国防痨杂志，2002]，已于2001年上市，主要用于结核病免疫治疗，也可以用于结核杆菌感染者预防治疗。分枝杆菌细胞壁和不致病分枝杆菌菌苗(如BCG、母牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等)可用于癌症的免疫治疗，它们用于癌症免疫治疗的主要原因是其能产生细胞免疫，而结核杆菌是胞内致病菌，主要也是通过细胞免疫起作用。BCG用于浅表膀胱癌治疗已多年，研究发现是因为BCG能与fibronectin结合，然后启动超敏反应和巨噬细胞吞噬分枝杆菌，研究发现fibronectin的受体是BCG分子量为55KD的蛋白[RatliffTL，etal，Infect.Immun.,61:1889-1894,1993]。由于只有活卡介苗才有治疗膀胱癌的作用，多;夂灌注会出现类似结核结节的病变。母牛分枝杆菌(M.vaccae)灭活菌体作为肿瘤化疗的辅助治疗，原因是灭活M.vaccae免疫机体可激活单核细胞/巨噬细胞系统，通过降低TNF-a、IL-12、IL-10而逆转因肿瘤诱导的单核细胞[BaranJ,etal，CancerImmunol.Immunother,53:1127-1134,2004]。M.vaccae用于非小细胞肺癌的III期临床试验结果激励人们开发微生物成分(包括非致病的分枝杆菌-M;vaccae等)用于癌症治疗[StandfordJL,etal，Eur.JCancer,44:224-227,2008]。不仅灭活的M.vaccae可用于肿瘤治疗，M.vaccae提取蛋白多糖PS4A也具有抗肿瘤作用，PS4A由一个20KD蛋白作为核心，连接葡萄糖和0-曱基化-4KD多聚糖，总分子量为50KD,常以三聚体形式存在[TianXX:etal,JPh謹.Pharmacol"52:151-157,1999]。我国研制无细胞冻干治疗用母牛分枝杆菌菌苗(商品名孩i:卡)已2001年上市，用于结核病免疫治疗，目前生产商正在开发其在嗜喘和胂瘤方面的应用。分枝杆菌提取物不仅可用于肿瘤治疗，还可作为佐剂用于疫苗研究。最近研究才是出了病原体相关分子才莫式(pathogen陽associatedmolecularpatterns,PAMPs)概念，PAMPs是有效的天然免疫活化剂，它包括脂多糖、肽聚糖、脂磷酸壁、脂蛋白和细菌DNA等。CpG基序是细菌DNA具有免疫刺激活性的结构基础，CpG基序是以非曱基化胞嘧啶、鸟。票呤二核苷酸为中心构成的特定寡核苷酸。CpG寡核苷酸通过激活哺乳动物细胞Toll样受体9(TLR9)引起机体产生天然免疫反应。由于CpG寡核苷S交合成方便，与其它PAMPs相比具有低毒性特点、又以诱导Thl型免疫应答为主，这些原因使得它在感6染、过敏性疾病和肿瘤的防治中将越来越被广泛应用。脂多糖、肽聚糖、脂磷酸壁是细胞壁的主要部分，细胞壁也是较好的佐剂。CpG寡核苷酸的佐剂作用已有报道、细胞壁的治疗肿瘤的研究报道也不少，但两者作为结核病亚单位疫苗研制的佐剂报道较少。分枝杆菌不仅可用于结核病免疫治疗和肿瘤的免疫治疗，研究还发现分枝杆菌及其衍生物是良好佐剂，如卡介苗、单磷酰脂A或MPL、肽聚糖、CpG等。结核病蛋白疫苗和4t'酸疫苗均需要佐剂，蛋白疫苗因蛋白易被机体降解，所以蛋白疫苗必须加佐剂以增强其免疫作用。研究发现核酸疫苗也需要佐剂，因为核酸疫苗的免疫效力不如传统疫苗和减毒活疫苗引起的免疫反应强，DDA作为结核DNA疫苗的佐剂优于MPL,道CoA用于结核DNA疫苗佐剂，IL-2和当归多糖作为结核HSP65DNA疫苗佐剂。国外报道佐剂有DDA、MPL及两者联合使用、AS02、ISCOM、脂质体、微生物及其衍生物作为佐剂(如卡介苗、短小棒状杆菌、单磷酰脂质A或MPL、肽聚糖、寡核苷酸、霍乱毒素、超抗原SEA)、细胞因子等。上述报道的佐剂的动物实验效果很好，但主要是临床使用安全性问题。理想的免疫佐剂应具以下特征能促进体液和纟W包的介导的免疫；毒力低、安全；能以不同途径免疫、可用于不同抗原；稳定、易生产。本发明是对分枝杆菌提取方法进行改进，降低其毒性、开发其在结核病、胂瘤预防或(和)治疗方面的应用。本发明分枝杆菌提取物可作为结核蛋白疫苗和核酸疫苗的佐剂，同时还可作为结核病化疗的辅助治疗，结核病新疫苗可互补或替代BCG,为结核病的预防和治疗提供了一种新的可选择途径。另一方面，还可作为胂癍放疗、化疗的辅助治疗。
发明内容发明概述本发明公开了一种结核分枝杆菌有效成分提取物，该制剂包含蛋白、多糖和核酸。研究发现，细菌胞壁多糖具有很好的免疫刺激作用、富含CpG片段的核酸具有良好的免疫调节功能。但分枝杆菌的脂质含量高，脂质是结核杆菌具有毒力的因素之一，为了提高制剂的安全性，首先对菌体进行脱脂处理。经脱脂处理的菌体易呈成单个菌体，直接用分枝杆菌全菌体会引起一些副作用，首先是菌体颗粒大、胞壁结构复杂，全菌体制剂免疫人体，其有效成分很难释放而发挥作用。常规的细菌破碎方法很难使分枝杆菌充分裂解，经过不同方法的充分比较，选择溶菌酶酶解，这样采用超声破碎菌体效果更好。通过压力破碎或高压勻质破碎目的是菌体蛋白、核酸等释放，并达到一种匀质、可溶状态，通过冻干保护剂的筛选，制成的冻干制剂具有良好的稳定性。通过我们发明的工艺制备的分枝杆菌制剂具有良好的免疫原性、匀质、可溶的制剂，同时具有更好的安全性。在本发明的分枝杆菌制剂，优选冻干制剂，是一种安全、有效的免疫调节剂，可增强正常机体的免疫功能、同时还可增强结核杆菌抗原的免疫原性。对结核病、癌症具有预防或/和治疗效果。在本发明的一个具体实施方案中，所述分枝杆菌制剂由浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、母牛分枝杆菌和卡介苗经裂解制备而成，在裂解过程中首先脱脂、溶菌酶酶解、破碎菌体。脱脂采用3-5倍(V/W)丙酮抽提菌体2次，酶解采用〖mg/ml溶菌酶37。C消化2小时以上，破菌采用高压破碎和超声破碎，优选高压破碎。本发明将上述破碎方法应用于分枝杆菌制剂的裂解制备，本发明的优选实施方式，采用3倍(V/W)丙酮抽提菌体2次，95%酒精抽提1次，离心收集菌体。用生理盐水洗2次，pH8.020-50mmol/LTris.Cl洗涤1次，优选pH8.020mmol/LTris.Cl洗涤1次。pH8.020-50mmol/LTris.Cl悬浮菌体，优选pH8.020mmol/LTris.Cl悬浮菌体。1mg/ml溶菌酶37°C消化2小时以上。离心、洗涤菌体，用PBS稀释后经高压破碎和超声破碎，优选高压破碎。4000转/分低速离心10分钟去掉未破碎菌体，15000g离心1小时沉淀用冻干保护液稀释制备浓度为50mg/ml-100mg/ml的悬液超声破碎，破碎条件400-2000W、破畔30秒、间隙10秒为一次，共破碎100-300次，优选1000W破碎200次。然后经110-135。C蒸汽处理10-40分钟，优选121。C蒸汽处理20分钟，4000转/分低速离心30分钟，上清即为分枝杆菌制剂。本发明涉及包含所述分枝杆菌制剂的组合物、以及包含所述分枝杆菌制剂的结核病治疗组配药盒。本发明还涉及包含所述分枝杆菌制剂的结核病预防疫苗，或免疫治疗疫苗。该疫苗包括蛋白亚单位疫苗，复合疫苗或DNA疫苗。本发明还涉及包含所述分枝杆菌制剂用于肿瘤化疗的辅助治疗药物，包括用于膀胱癌、肝癌、8黑色素瘤的治疗。本发明的一个技术方案中涉及本发明的分枝杆菌制剂，组合物用于预防或治疗纟;核病，例如，用于为健康人群(包括感染结核杆菌和未感染结核杆菌)接种疫苗，以预防结核病；用于为结核病人正常的抗结核病化学药物治疗——^#辅—虽ilJli'台疗，J提高机紘疫il—^!^的分4tit^^剂，组合物尤其用于未感染结核杆菌人群、感染结核杆菌但未发病的人群、对抗结核病化学药物治疗耐受的结核病人群或迁延不愈的慢性结核病人群的结核病的预防或治疗。本发明的分枝杆菌制剂，组合物可与抗结核病化学治疗药物，例如，常用一线药异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡溱酰胺(PZA)、对氨柳酸钠(PAS);控制用一线抗结核药利福平(RFP)、卡那霉素(KM)、异胺丁醇(EB);常用二线抗结核药巻曲霉素(CPM)、乙硫异菸胺(1314Th)、氨硫脲(TB1);新型抗结核药:，喹诺酮类药物、如氧氟沙星、丙氟哌酸、帕氟沙星等；利福霉素类衍生物，如利福定(RFD)、利福喷丁(RFT)、利福布丁(RBU)、CGP类长效利福霉素(如CGP27557、CGP29861等)；新型大环内酯类药物，如6-甲氧基红霉素、罗红霉素、阿奇红霉素；(3-内酰胺类，如阿莫西林-克拉维酸、氨卡西林-克拉维酸、替卡西林-克拉维酸；氨基糖戒类，如丁氨卡那霉素；数种不同药物按一定量配方的抗结核复合药，如INH与RFP制成月交嚢的Rifamate，INH、RFP、PZA制成糖衣片的卫肺特，同时或顺序联合应用。本发明涉及一种预防或治疗结核病的新方法，该方法包括将本发明的分枝杆菌制剂、组合物、疫苗、药物给药至需要的患者，例如，健康人群，包括感染过结核杆菌和未感染过'结核杆菌的健康人群，以预防结核病；结核病患者，为接受正常的抗结核病化学药物治疗的结核病人提供辅助免疫治疗，以提高机体免疫力；慢性结核病患者，以对抗结核病化学药物治疗耐受的慢性结核病人群或迁延不愈的慢性结核病人群的结核病的提供预防或治疗。在上述方法中，本发明的分枝杆菌制剂可以与结核杆菌杆菌重组抗原联合，然后再于抗结核病化学治疗药物联合应用，所述抗结核病化学治疗药物，例如，常用一线药异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡溱酰胺(PZA)、对氨柳酸钠(PAS);控制用一线抗结核药利福平(RFP)、卡那霉素(KM)、异胺丁S斧(EB);常用二线抗结核药巻曲霉素(CPM)、乙硫异菸胺(1314Th)、氨硫脲(TB1);新型抗结核药「喹诺酮类药物、如氧氟沙星、丙氟哌酸、帕氟沙星等；利福霉素类衍生物，，如利福定(RFD)、利福喷丁(RFT)、利福布丁(RBU)、CGP类长效利福霉素(如CGP27557、CGP29861等)；新型大环内酯类药物，如6-曱氧基红霉素、罗红霉素、阿奇红霉素；(3-内酰胺类，如阿莫西林-克拉维酸、氨千西林-克拉维酸、替卡西林-克拉维酸；氨—基4MD4斗-氨丰那霉素-;^t神；同药物^^量配方^h抗4N^复合药,如INH与RFP制成胶嚢的Rifamate，INH、RFP、PZA制成^f唐衣片的卫肺特。所述联合应用包括同时或以任何顺序的联合应用。发明详述本发明涉及分枝杆菌有效成分的提取并制备成分枝杆菌制剂，该方法不仅适合所有分枝杆菌还适合^它细菌有效成分提取(包括短d、棒状杆菌、诺卡氏菌等)。分枝杆菌制剂由浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、母牛分枝杆菌和卡介苗等分枝杆菌经裂解制备而成，在裂解过程中首先脱脂、溶菌酶酶解、破碎菌体。脱脂采用3倍(V/W)丙酮抽提菌体2次，酶解采用1mg/ml溶菌酶37。C消化2小时以上，破菌采用高压破碎和超声破碎，优选高压破碎。本发明将上述破碎方法应用于分枝杆菌制剂的裂解制备，本发明的优选实施方式，采用3倍(V/W)丙酮抽提菌体2次，离心收集菌体。用生理盐水洗2次，pH8.020-50mmol/LTris.Cl洗涤1次，优选pH8.020mmol/LTris.Cl洗涤1次。pH8.020-50mmol/LTris.Cl悬浮菌体，优选pH8.020mmol/LTris.Cl悬浮菌体。lmg/ml溶菌酶37。C消化2小时以上。离心、洗涤菌体，用PBS稀释后经高压破碎和超声破碎，优选高压破碎。4000转/分低速离心IO分钟去掉未破碎菌体，15000g离心1小时沉淀用冻干保护液稀释制备浓度为50mg/ml-100mg/ml的悬液超声破碎，破碎条件400-2000W、破碎30秒、间隙10秒为一次，共石皮碎100-300次，优选1000W石皮碎200次。然后经110-135。C蒸汽处理10-40分钟，优选121。C蒸汽处理20分钟，4000转/分低速离心30分钟，上清即为分枝杆菌制剂。本发明的分枝杆菌提取物具有刺激机体产生针对结核分枝杆菌的免疫应答的作用，具有免疫原活性，可有效剌激机体针对结核杆菌的免疫应答。本文所述的"免疫原活性"是指抗原刺激机体免疫系统，使之产生抗体和/或效应淋巴细胞的性能。能刺激机体产生免疫应答的外原性抗原刺激机体产生免疫应答的种类分为体液免疫和细胞免疫[林学颜，等.现代细胞与分子免疫学，1-11，1999]。体液免疫检测可利用本领域已知的各种检测方法来检测，例如，琼脂双扩散法、ELISA法。细胞免疫可通过例如淋巴细胞增殖、转化、淋巴细胞分泌细胞因子水平、皮试超敏反应实验等本领域常用方法来检测[OlsenAW,etal，Infect.Immun.，72:6148-6150，2004]。术语"免疫—^6LS"是措当-外来物质或微生-物i4^i輪体对免疾象统的反应。一般情况下，免疫应答分为特异性和非特异性反应，而这两部分紧密地交叉关联。非特异性免疫应答被认为是抵抗各种各样外来物质和感染物质的即时防,卩。特异性免疫应答是表征生物体抵抗外来物质的一种高效防御机时，特异性免疫应答对于保护从特异性感染恢复的个体在将来抵抗这种特异性感染的现象中也起着决定作用。本发明的分枝杆菌提取物可激发或者增强针对结核分枝杆菌的免疫应答，从而可制备成结核病预防性疫苗或治疗性疫苗，例如，亚单位疫苗、DNA疫苗或复合疫苗，用于卑疫未感染结核分枝杆菌的人群，以赋予该人群对结核分枝杆菌的免疫力；也可以施用于已感染结核分枝杆菌、但没有发病的人群，以预防其发病；还可以施用于结核病发病人群，以辅助抗结核病药物的治疗，"提高疗效，缩短疗禾呈，减少抗结核药物的副作用。本发明分枝杆菌提取物可来源于所有的分枝杆菌，但优选一一致病分枝杆菌，更优选母牛分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、BCG、耻垢分枝杆菌等。本发明的融合蛋白可作为复合疫苗的成分用于免疫或治疗结核病。例如本发明的疫苗可与多种抗原或不同疫苗同时或依次免疫预防结核病，从而提高保护作用。图t为分枝杆菌免疫小鼠的脾脏T淋巴细胞体外培养产生的IFN-y。0:生理盐水对照，1:0.3mg分枝杆菌提取物组，2:0.6mg分枝杆菌提取物组，3:1.2mg分枝杆菌提取物组。低剂量、中剂量、高剂量组免疫小鼠，其IFN-y分泌显著高于对照组。图2为分枝杆菌免疫小鼠的脾脏T淋巴细胞体外培养产生的IL-12。0:ii0.6mg分枝杆菌提取物组，3:1.2mg分枝杆菌提取物组。中剂量组、高剂量组免疫小鼠，其IL-12分泌显著高于对照组。图3为分枝杆菌免疫小鼠的脾脏T淋巴细胞体外培养产生的IL-4。0:生理IU^对照—，—丄O丄mg会-技i于-iL提取物组，J;04jn告余拔杆遵提取物组3:1.2mg分枝杆菌提取物组。低剂量组免疫小鼠，其IL-4分泌显著低于对照组。，图4分技杆菌免疫小鼠的腹腔巨噬细胞体外培养产生的NO。0:生理盐水对照，1:0.3mg分技杆菌提取物组，2:0.6mg分枝杆菌提取物组，3:1.2mg分枝杆菌提取物组。高剂量组免疫小鼠，其腹腔巨噬细胞合成NO显著高于对照组。实施例在下文中，本发明参考实施例进行具体阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。实施例l:分枝杆菌制剂的制备根据分枝杆菌菌体成分、细胞壁结构及其有效成分，制定其提取工艺。以浅黄分枝杆菌为例进行说明，改良苏通培养基进行培养的卡介苗、浅黄分枝杆菌、母牛分枝杆菌等过滤收集菌体，用生理盐水洗涤离心2次，一精确称菌体湿重，按体积重量加3倍(V/W)的丙酮，抽提2-10小时，共抽提2次。用生理盐水洗2次，pH8.020mmol/LTris.Cl洗涤1次。pH8.020mmol/LTris.Cl悬浮菌体，1mg/ml溶菌酶37°C消化4-10小时。离心、PBS洗涤菌体，用PBS稀释悬浮菌体至20mg/ml。高压破碎制备分枝杆菌制剂上述菌悬液经高压匀质机的高压气流剪切技术匀浆破碎菌体，条件为40bar、破碎50次，低温低速离心去除大颗粒和未破碎菌体，离心条件2-8°C、3000-6000转/分离心20分钟，上清15000转/分离心l小时，沉淀用PBS稀释悬浮至20mg/ml，经高压匀质机的高压气流剪切技术匀浆破碎菌体，条件为40bar、石皮碎30次，经121°C蒸汽灭菌处理20分钟。低温低速离心去除大颗粒和未破碎菌体，离心条件2-8°C、3000-6000转/分离心10分钟，上清即为分枝杆菌制剂为保持更好的稳定性，优选采用冷冻真空干燥制备成分枝杆菌冻干制剂。超声破碎制备分枝杆菌制剂上述菌悬液经超声破碎仪破碎，条件12800W、破碎30秒间隙10秒为1次，共破碎200次。低温低速离心去除大颗粒和未破石卒菌体，离心条件2-8°C、3000-6000转/分离心20分钟，上清15000转/分离心1小时，沉淀用PBS稀释悬浮至20mg/ml，经超声破碎仪破碎，条件800W、破碎30秒间隙10秒为1次，共石皮碎100次；经121。C蒸汽i萄处理—20分钟—低^1^4离-心去除^^伞未^#—菌l-离—心辜件2—-8。C、3000-6000转/分离心10分钟，上清即为分枝杆菌制剂。优选采用冷冻真空干燥制备成分枝杆菌冻干制剂。本发明优选磷酸盐缓沖液作为冻干保护液，其组成和配伍如下1)钾盐味精15g海藻糖30g氯化钠8g无水碌酸二氢钾4.35g去离子水1000ml2)钠，盐-味精2.5g海藻糖30g氯化钠8g无水磷酸氬二钠18.3g去离子水1000ml3)冻干保护液9卯ml钾盐和660ml钠盐混合，混合液pH为7.2，混合液经0.2(am滤膜过滤，115。C蒸汽灭菌30分钟。上述高压破菌或超声凌菌，制备分枝杆菌用于结核病、肿瘤的治疗的优选剂量为0.1mg/ml-10mg/ml分枝杆菌制剂/剂，优选0.2mg/ml-1mg/ml分枝杆菌制剂/剂。0.1mg/ml-10mg/ml分枝杆菌制剂是指相应的湿重分枝杆菌经上述方法裂解产物制备的分枝杆菌制剂。脱脂和酶解去掉了大部分脂肪，使分枝杆菌安全性更好。使菌体呈单个菌更易破碎。表1脱脂对分枝杆菌脂类含量的影响脂肪酸分枝杆菌制剂结核杆菌十四烷酸—+十六一^酸+卡-誠酸+异十七烷酸—+十七烷酸—+十八烷酸+十八一烯酸++十八二烯酸±+10-曱基十八烷酸—+二十烷酸—+二十二威酸一_+二十四烷酸—+二十六烷酸—+实施例2:分枝杆菌制剂免疫小鼠对小鼠脾淋巴细胞产生细胞因子的影响以不同剂量免疫小鼠，以注射等体积的生理盐水作为对照，末次免疫后2周，无菌取脾脏研磨后调整脾细胞浓度为5xl06/ml，分装96孔板，每孔100|^1,37。C、5。/。C02培养72小时离心取上清，-20。C保存。BD公司生产的小鼠IL-12、IL-4、IFN-yEL，ISA试剂盒检测脾淋巴细胞培养上清中的细胞因子，结果见图1-3。细胞因子结果表明分枝杆菌制剂可以刺激Thl类细胞因子IL-12、IFN-y的分泌，降低Th2类细胞因子IL-4的表达量。这对结核病预防具有重要意义。实施例3:本发明分枝杆菌制剂免疫小鼠对小鼠巨噬细胞产生NO的影响14一氧化氮(nitricoxide,NO)，由一氧化氮合成酶(NOsynthase)合成，是一种非常重要的生理性的细胞内及细胞间的信号分子，其水平提高有利于机体对寄生在细胞内细菌、病毒的杀伤和清除作用。一氧化氮本身极不稳定，目前还没有很好的办法直接测定。NaNO+是一氧化—氮代谢形成的一-辨4l^-产41所以—效拔-NaNQ2扭当—于测定了一氧化氮的累积产量。巨噬细胞体外培养可诱导产生NO,产生的NO快速氧化成NO"通过才企测N(V可反应NO的产生水平。以不同剂量免疫小鼠，以注射等体积的生理盐水作为对照，末次免疫后2周，无菌取腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度为5xl05/ml,分装24孔板，每孔lml，，37。C、5。/。C02培养24小时离心取上清，-20。(3保存。江苏碧云天生物技术研究所生产一氧化》灰检测试剂盒(Griess试剂)检测上清NO，结果见图4。高剂量组与对照组比较NO合成显著增加。实施例4:本发明分枝杆菌提取物的治疗作用小鼠静脉注射活结核分枝杆菌H37Rv5x107以制备结核分枝杆菌感染模型，本发明分枝杆菌提取物进行肌肉注射进行免疫保护效果的研究。结核杆菌感染小鼠后，每周治疗1次，共治疗4次，阴性对照注射生理盐水，实验组为分枝杆菌提取物，治疗后3周进行解剖，取肺进行研磨匀浆后稀释接种培养，37。C培养4周进行菌落计数。并对相应脏器的病变情况进行病变评分。生理盐水组肺、脾呈现胡显病变，而分枝杆菌^是:取物免疫组明显改善病变情况，降低肺结核杆菌载菌数。结果见表2。表2:本发明分枝杆菌提取物免疫治疗小鼠肺脏结核杆菌分离数对数值结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>:PO.05实施例4:本发明分枝杆菌提取物的预防作用本发明分枝杆菌提取物免疫豚鼠，末次免疫后皮下注射结核杆菌，攻击后4-8周进行解剖，取脾进行研磨匀浆后稀释接种培养，37°C培养4周进行菌落计数。并对相应脏器的病变情况进行病变评分。生理盐水组脾呈现明显病变，而分枝杆菌提取物免疫组明显脾病变明显改善，降低脾结核杆菌载菌数。结果见表3。表3:本发明分枝杆菌提取物预防豚鼠脾脏结核杆菌分离数对数值结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>:P<0.0权利要求1.分枝杆菌有效成分制剂，所述制剂由分枝杆菌脱脂、酶解、裂解制备而成。2.权利要求l所述的制剂，其为冻干制剂。3.权利要求1所述分枝杵菌，优选为浅黄分枝杆菌、母牛分枝杆菌、草分枝杆菌等快速生长不致病(或条件致病)的分枝杆菌和卡介苗。4.权利要求1所述的制剂制备，其中所述脱脂采用有机溶剂提取。所述有机溶剂，优选丙酮、曱醇和酒精。5.权利要求4所述脱脂，其包括步骤收集培养的分枝杆菌，.用3-5倍体积的有机溶剂，优选丙酮，抽提2次，生理盐水洗涤菌体。6.权利要求1所述的制剂制备，其中所述酶解采用溶菌酶或蛋白酶酶解。7.，利要求1所述的制剂制备，其中所述裂解采用超声破碎。8.权力要求8所述的制剂，其中所述的超声破碎为脱脂、酶解的分枝杆菌，用PBS稀释后超声破碎菌体，低速离心去掉未破碎菌体。高速离心沉淀用冻干保护液稀释后超声破碎，然后经110-135。C蒸汽处理10-40分钟，优选121。C蒸汽处理20分钟，低速离心上清即为分枝杆菌制剂。9.权利要求1所述的制剂制备，其中所述裂解采用高压破碎。10.权力要求10所述的制剂，其中所述的高压破碎为脱脂、酶解的分枝杆菌，用PBS稀释后高压匀质机破碎菌体，高速离心沉淀用冻干保护液稀释后高压破碎，然后经110-135。C蒸汽处理10-40分钟，优选121。C蒸汽处理20分钟，低速离心上清即为分枝杆菌制剂。11.—权利要求9、11所述.的冻千保护液为磷酸盐緩冲液，优选钾盐和钠盐按一定比例混合，其中1000ml钾盐味精2.5g，海藻糖30g,氯化钠8g，无水磷酸二氢钾4.35g;其中1000ml钠盐味精2.5g，海藻糖30g，氯化钠8g,无水磷酸氬二钠18.3g;990ml钾盐和660ml钠盐混合，混合液pH为7.2，混合液经0.2ium滤膜过滤，115。C蒸汽灭菌30分钟。12.权利要求1-11所述的药物组合药盒，用于结核病预防和治疗，其还包含结核杆菌重组抗原，以及用于治疗结核病的使用说明。13.权利要求1的分枝杆菌制剂、权利要求4-11所述的分枝杆菌有效成分的提取方法。14.权利要求12所述的组合物在制备预防或治疗结核病个体的药物或疫苗中的用途。权利要求12的用途，其中所述个体为未感染结核杆菌人群、结核杆菌感染人群、对抗结核药物耐受的结核病患者或迁延不愈的慢性结核病患者。全文摘要本发明涉及分枝杆菌有效成分的提取方法，目的是去掉脂质成分、降低副作用，保留其有效成分，使其具有免疫佐剂的作用。包括分枝杆菌菌种及其提取成分在结核病预防和治疗中的应用。文档编号A61K35/66GK101518549SQ20081000785公开日2009年9月2日申请日期2008年2月26日优先权日2008年2月26日发明者何秀云,庄玉辉,张小刚,李新荣,汪海滨,王春美,王艳军,黄香玉申请人:中国人民解放军总医院第二附属医院