鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用 途，属于生物技术领域。
背景技术：
再生障碍性贫血(简称再障，AA)是由多种原因引起的骨髓造血功能衰 竭性疾病，临床上呈全血细胞减少。近年来研究表明，免疫功能紊乱与再障 的发病密切相关。已知某些病毒、药物及射线等因素与再障发病有关。随着 经济建设的发展，环境生活因素的影响，我国再障的发病率逐渐增高，尤多 发生于青壮年、婴幼儿，严重影响国民生产力及国民体质健康。再障分急性 型(AAA)和慢性型(CAA)两类，又根据临床表现分为严重型(SAA)和极重 型(VSAA)。 SAA与VSAA发病急，进展快，易出现严重出血、感染，死亡率高。 CAA以贫血为主，经常出血，反复感染，长期迁延不愈，部分患者输血要求频 繁，CAA也可突然病情加剧，演变成SAA加速死亡。目前对再障的治疗还没有 特效药物，再障至今被视为难治之症。

发明内容
本发明目的是通过杂交瘤技术，利用Balb/c小鼠以胎儿胸腺细胞进行免 疫，用其脾细胞与SP2/0细胞融合筛选出一特异性单抗，即鼠抗人T淋巴细 胞CD:,表面抗原单克隆抗体(简称抗CD3单抗)。该抗体作为细胞免疫调节剂， 在临床上可制成鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体注射液(MMA3)，主 要用于治疗再障及其他细胞免疫功能紊乱性疾病，其疗效显著，副作用轻微， 复发率低。本发明采用的技术方案是首先利用杂交瘤细胞技术以胎儿胸腺细胞作 为免疫原，利用Balb/c小鼠进行免疫，制备杂交瘤细胞，即保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC N0:C200803的抗T淋巴细胞单克 隆抗体杂交瘤细胞株CD3。然后将该杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠体内，抽 取腹水产生鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体。
本发明涉及到的杂交瘤细胞已于2008年3月14日保存于中国典型培养 物保藏中心CCTCC，保存号为C200803,名称为抗T淋巴细胞单克隆抗体杂 交瘤细胞株CD3。
本发明是通过以下过程实现的
一、 杂交瘤细胞CCTCC N0:C200803的产生
1、 制备免疫原在超净台内无菌条件下取胎儿胸腺细胞作为免疫原。
2、 免疫第一次免疫用2X1()7胸腺细胞，腹腔注射，加强免疫二次，每 次间隔3周，融合前3天做末次免疫。
3、 融合与克隆化Balb/c小鼠经胎儿胸腺细胞腹腔注射免疫后，取脾细 胞与Sp2/0细胞与50%PEG作用下融合后，置HAT选择培养基中培养，加 Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞，5天后可见集落长成，10—12天后换 HT培养液，待集落生长至孔面积1 / 4左右时，取上清以APAAP法进行细胞株 筛选，得到抗体分泌阳性的杂交瘤细胞即抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细 胞株CD3。
二、 由上述杂交瘤细胞CCTCC N0:C200803分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD3 表面抗原单克隆抗体的制备通过以下步骤实现的
(1) 预注射液体石蜡
用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，每只腹腔注射0. 5ml石蜡；
(2) 细胞扩培
将获得的杂交瘤细胞CCTCC N0:C200803接种到培养瓶中孵箱培养扩增，收集细胞；
(3) 接种细胞
将上步收集到的细胞用生理盐水稀释调至lXl()6-3X106个/m1,每只小 鼠腹腔注射0.5ml;
(4) 采集腹水
挑出接种细胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水经澄清、分子筛柱层析纯化 后即可获得鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体。
上述步骤获得的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体可进一步制 成鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体注射液(MMA3),临床上主要用于 治疗再生障碍性贫血。
本发明临床前研究.-
1. 药效学研究表明，画A3对PBMNC无致丝裂作用，对无造血系统疾病者的 骨髓CFU-GM及再生障碍性贫血患者骨髓CFU-CM的体外生长有明显激活作用， 并呈双向作用。
2. 药理学研究表明，在高于临床拟用剂量条件下，MMA3对猫的精神神系统 以及血压、呼吸、心电等均无影响。
3. 药代动力学表明，IgG,在体内存留8.3天，大部分时间分布于实验动 物的组织中(占总停留时间的53%)，分布体积超过了血浆和间质液体积，给 药后迅速分布于多数器官，肝、脾、肺的平衡时间分别〈2.6min，肠道分布 较慢(<20min)，肌肉分布最慢(260min)，血浆浓度分布比>0.5%，在肌 肉中该比值〉0. 18，降解主要在肠道(72.8%)，其次是肝(20.5%)，脾(3.6 % )。在抗体被降解或分泌之前至少在体液组织之间进行2. 8次/g组织器官重 量的循环。
4. 急性毒性实验表明，小鼠分别经尾静脉、皮下给药未能测出LDs。；当以 MMA:,最高浓度、最大给药体积给药后，实验动物未出现毒性反应症状，I.V.和S.C.给药的LD5。均大于90mg/kg，表明MMA3急性毒性甚低。
5. 亚急性毒性实验表明，小鼠给予临床拟用剂量的40-90倍的MMA3后， 未见对小鼠产生明显毒性作用。小鼠静脉连续大剂量给药的毒性很低。
6. 慢性毒性实验表明，连续注射给大鼠MMA3l2天后，多数实验动物即可 产生抗醒A:，抗体。在连续给药期及停药观察3个月期间，实验动物的一般行 为、症状无明显改变；血液学与血生化指标，系统解剖与病理组织学以及骨 髓象学检查项目均未见毒性反应症状，与溶媒对照组比较均无明显差异。结 果表明固A3对大鼠无明显毒性作用。
7. 全身过敏实验表明，固A3对豚鼠无致敏作用。
8. 连续给药的局部刺激性实验表明，MMA3连续给药对给局部无刺激性作用。
9. 致突变实验表明，薩A3对人二倍体细胞无致突变作用。 MMA:,I期临床研究表明，副作用轻微，安全性较好。
MMA:,根据《药品注册管理办法》规定属生物制品二类新药，经国家药品监 督管理局批准进行临床研究[批件号为(1999)制申体字第34号]，目前已完 成I期临床研究，进入II期临床研究，进一步观察其安全性和疗效。由郑州 大学第一附属医院作为组长单位(原河南医科大学第一附属医院)，河北医科
大学第二医院、兰州大学第一医院、济南军区总医院、兰州军区总医院等作 为参加单位为本产品进行多中心、随机、双肓双模拟、平行对照的临床研究。 本发明创新点
1.MMA3为一新型抗CD3单抗。本发明以胎儿胸腺细胞作为免疫原，通过鼠-鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备得到了 MMA3杂交瘤细胞株。获得的MMA3杂交瘤 细胞株经山东医科大学附属医院鉴定，结果证明其为识别T淋巴细胞分化抗 原CD:,的单抗；抗CD3单抗经中国药品生物制品检所检定证明MMA3为鼠IgG1; MMA:,半成品、成品经中国药品生物制品检定所检定合格。MMA3为特异性明确的抗人T淋巴细胞CD凌面抗原的单克隆抗体，与己知的OKT汲WuT3单克隆抗体 识别抗原的不同表位，对正常骨髓粒-巨噬祖细胞(CFU-GM)体系生长有明显 激活作用，且呈双向调节作用特征。
2.薩A3纯化方法独特，重复性好，收率高。固A3纯化方法选用了小鼠腹水 离心、过滤澄清，100%饱和度(NH4) 2S04沉淀离心，色谱层析。在色谱层析 方法的选择上，发明人比较了离子交换、亲和层析、分子排阻、疏水层析等 方法的优缺点。离子交换层析在样品上柱前需经透析等手段除掉高盐，增加 了操作步骤，且分离效果不理想。亲和层析介质成本高且不够稳定。而用分 子排阻介质S印hacryl S-300 HR初步纯化，洗脱液直接接上Phenyl S印harose 6 FF(high sub)进行疏水层析(HIC)纯化，可以在高盐条件下上样，在低盐
条件下洗脱，得到的MMA3纯度高且重复性好，其纯化效果见表l。
表lMMA3纯化结果汇总
产量回收率纯度石蜡残留量DNA残留量纯化
(mg)(%)(%)(mg/ml)(pg)倍数
100ml腹水2001002080〉1001
硫酸铵沉淀18090700.5〉1003.5
S-300HR1608091无<1004.6
HIC1507598无<1004.9
3.对适应症再障碍性贫血的选择合理。发明人对薩A3治疗AA的机理迷行 了一第系列的研究，结果表明，机体免疫调解机制紊乱在AA发病中起重要作 用，特别是无明显诱因的患者。具体再现为a.T淋巴细胞亚群分布异常，CD8 +细胞比例的增大，CD4/CD8比值下降；b.异常细胞克隆；c.负造血调控因子(干 扰素Y、肿瘤坏死因子a等)表达增强；d.HLA-DR表达增强。
TCR/CD3复合体是T细胞特异性的主要调节者，抗TCR-CD3单克隆抗体能模 拟其重量性配体并与之结合，然而这些抗体导致T细胞呈现两个相反效应一T细胞的活化和抑制。MMA3用于治疗就是基于抗CD3单克隆抗体的上述两个生物 学效应。MMA:,对正常及AA患者骨髓CFU-GM体外生长作用研究表明，MMA3对正 常及AA患者骨髓CFU-GM有明显激活作用，且呈双向调节效应。本项目曾作 为科研项目，研究结果表明MMA甜AA的治疗总有效率为79. 3。％,且起效迅速、 毒副作用较小。
MMA:，是国内唯一主要用于治疗再障的单抗制剂，美国0KT3和国内WuT3产 品尽管在技术和质量指标上与画A3有相同之处，但它们作用的抗原决定簇位 点与丽A.,不同(经竞争抑制试验表明位点不同)，来源均是鼠源性，前两者主 要用于治疗器官移植中的抗排斥反应。 治疗典型病例
例一邢某，男，56岁，患慢性再障12年，经常规治疗多年无效，Hb 41g/L'WBC2.5X109， Pit 6X 109需输血维持， 一周输血200ml。经用醒3治疗 两疗程好转，血常规基本恢复正常，无需输血，继用固A3巩固治疗一疗程， 随访至今，情况良好。
例二赵某，男，45岁，患慢性再障3年，经用司坦唑醇、达那唑、再 障升血片治疗无好转。丽A3治疗两疗程好转，随访至今，Hb 101g/L，WBC 4.5 X10 Plt 126X10、随访至今病情稳定。
例三李某，女，12岁，患急性再障一月，高热，Hb 32g/L,WBC 1.5X 109，Plt 11X109，用MMA3治疗三疗程好转，Hb 100g/L，WBC 4.7X109,Plt 112 X109，至今情况良好。


附图1为杂交瘤细胞制备基本程序框图。 附图2为MMA3生产技术路线框图。
具体实施例方式
一、杂交瘤细胞CCTCC N0:C200803的产生1. 材料
① 亲本细胞骨髓瘤细胞SP2/0，由澳大利亚引进；Balb/c种属，不合 成免疫球蛋白，染色体数为72条。
② 免疫亲代细胞动物种系与来源Balb/c小鼠，雄性，8 — 10周龄， 山东医科大学实验动物中心提供。
③ MMA:,细胞株免疫原——胎儿胸腺细胞胎儿胸腺来源于济南市历下区 人民医院妇产科，胎儿为女婴，孕龄为7个月，系手术引产。胎儿母亲李某， 年龄28岁，系第二胎，计划生育引产；胎儿母亲身体健康，HBsAg阴性，肝 功、血常规正常，问诊无家族遗传史。胎儿引产后尚有弱呼吸，无畸形，健 康0
2. 方法
2. 1制备免疫原在超净台内无菌条件下先取出胎儿胸腺，获取胎儿胸腺 细胞为免疫原。
2.2免疫第一次免疫用2X1()7胸腺细胞，腹腔注射，加强免疫二次，每 次间隔3周，融合前3天做末次免疫。
2. 3融合与克隆化Balb/c小鼠经2乂107胎儿胸腺细胞腹腔注射免疫3 次，于末次免疫3天后，取脾细胞与Sp2/0细胞与50XPEG (分子量1540, Sigma)作用下融合后，置HAT选择培养基中培养，加Balb/c小鼠腹腔巨噬 细胞作词养细胞，5天后可见集落长成，10 —12天后换HT培养液，待集落生 长至孔面积1 / 4左右时，取上清以APAAP法进行细胞株筛选，对抗体分泌阳 性的杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆3次，至所有亚克隆细胞均成阳性 反应(阳性克隆率100%)。
2.4杂交瘤细胞检定细胞核学特征检査细胞分裂中期染色体，应符合 杂交瘤细胞的核型。
①试剂秋水仙素；0. 075mol / L氯化钾低渗溶液；细胞固定液(甲醇3份，冰乙酸l份)；姬姆氏染色液；树脂
② 器材尖底离心管(lOml)，吸管，载玻片，盖玻片，离心机(水平式 转头)，显微镜。
③ 方法在细胞传代培养48小时后，加秋水仙素，最终浓度为0. 1 U g/ml， 继续培养3小时。移入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清液；加入5ml 预温至37。C的0.075mol/L氯化钾低渗液，用吸管吹打均匀，置37。C水浴20 分钟；每管加入lml新鲜配制的固定液混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清 液。再加5ml固定液，静止30分钟后，1000r/min离心10分钟，弃上清；沉 淀物中加5ml固定液，轻轻吹散细胞，吸取2—3滴细胞悬液，滴于预冷的洁 净载玻片上，立即轻轻吹散，使细胞分布均匀，并在火焰上通过几次，使细 胞平铺于载玻片上，自然干燥；用姬姆氏染液染色10分钟，经自来水洗去染 色液，自然干燥，树脂封片后，用显微镜检测；每个标本计数100个完整的 中期细胞核，记录染色体数，分析染色体数的分布。并作显微镜摄影。
二、由上述杂交瘤细胞CCTCC N0:C200803分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD3 表面抗原单克隆抗体的制备 l.材料
① 细胞培养用小牛血清支原体检测应为阴性，经小量试验适于杂交瘤
细胞生长。
② 培养液采用RPMI — 1640培养液，G1BC0生产。
③ 化学试剂各种生产应用化学试剂应达到分析纯化上。
0.4MNaCl:干烤NaC146. 752g，加无热原水2000ml，用0.2MNaOH调pH 至6. 8-7.0;
0.2 MNaOH: NaOH4g，加无热原水500ml;
100%饱和硫酸铵(ASA):硫酸铵400g，放入大烧杯中，加无热原水500ml， 用电炉子加热助溶，边加热边搅拌至硫酸铵完全溶解，稍冷却，过滤。④动物种系与来源Balb/c小鼠，8周龄以上，由北京军科院提供。制 备腹水动物使用Balb/c小鼠，生产用鼠必需经过检査，应无鼠源病毒污染， 并有合格证明。在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者均应废弃。
2.方法
2.1预注射液体石蜡。进入实验室后，穿隔离服，戴好帽子、口罩、手 套，将适量液体石蜡倒入干烤过的小瓶内，用酒精棉球消毒手套，用注射器 吸取适量石蜡，用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，腹腔注射0. 5ml/只石蜡，(7 天之后注射细胞)作好标记。
2.2接种细胞。
2. 2. 1物品高压蒸汽灭菌小号培养瓶、弯头吸管、直头吸管、刻度吸管、 尖底离心管，121°C， 20min; 2.2.2无菌室紫外线消毒；
2.2.3打开水浴箱，设定39°C,水浴箱中放一盛开水的大烧杯，使其温 度为39°C。
2.2.4复苏杂交瘤细胞(需无菌操作)
2. 2. 5向小号培养瓶中加入含15%小牛血清的1640培养液10ml。
2. 2. 6用刻度吸管取8ml1640培养液，放入尖嘴离心管中。
2. 2. 7从液氮罐中取出要复苏的细胞，迅速放入盛有39'C温水的烧杯中，
再将烧杯迅速放入39。C水浴箱中，用镊子夹住冻存管下部快速转动，使其迅
速融化(以稍稍带一点冰核为好)。
2.2.8打开冻存管，用直头吸管将其内细胞液吸出，放入盛1640培养液
的尖底离心管中，混匀，盖好盖，用封口膜封住离心管口， 1000转/分，离心
10min。
2.2.9离心后，在超净台内弃去上清，吸取培养瓶内的培养液将离心底的细胞轻轻吹起，放入盛有培养液的培养瓶中，拧好瓶塞(不要太紧，以
拧开时稍有阻力为好)，轻轻晃匀，作好标记(种类，日期)，放入37°CC02
孵箱培养。
2.2.10换液。4-6小时后，给刚复苏的细胞换一次液。轻轻摇晃两下培 养瓶，倒去培养液(视细胞多少来决定倒去多少培养液)，补加含15%小牛血 清的1640培养液至lOml，放入孵箱继续培养。
2.3细胞扩增。细胞经几次传代后，选出效价高的扩培制备腹水。
2.3.1物品高压蒸汽灭菌大号培养瓶、弯头吸管、刻度吸管；
2.3.2无菌室紫外线消毒。
2.3.3细胞扩培(需无菌操作)。
2.3.4用弯头吸管轻轻吹打细胞，形成细胞悬液。
2.3.5向大号培养瓶中加入适量细胞悬液(具体依细胞数量而定)。
2. 3. 6用刻度吸管分别向每个大号培养液中加入35ml含10%小牛血清的 1640培养液，轻轻摇匀，拧好瓶盖，作好标记(种类，日期)，放入孵箱培养。
2. 3. 7扩培的细胞培养2-3天，观察细胞生长情况，当细胞几乎覆盖整 个瓶底时，开始收集。
2.3.8用弯头吸管轻轻吹打细胞，动作要轻，形成细胞悬液，倒入塑料 离心管中，盖好盖，用封口膜封口。
2.3.9离心1600转/分，10min。
2.3.10洗涤在超净台内弃掉上清，用生理盐水吹打均匀，合并入l-2 个离心管里，加生理盐水混匀，盖好盖，用封口膜封口， 1600转/分离心10min。
2.3.11计数在超净台内弃掉上清，离心管底部的细胞用生理盐水作适 当定量稀释，显微镜下记数，然后用生理盐水调整细胞浓度为1X106-3X106 个/ml，迅速送至动物室给小鼠注射。
2.4接种细胞将培养的细胞调至1Xl()6个/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，注射细胞前要先摇匀，放射要迅速，细胞放置时间不宜过长， 记录细胞种类、注射数量、日期等。
2.5釆集腹水挑出接种细胞后约7-12天，腹部胀大，变紫，四肢及尾 部发白，行动迟缓，精神不振的小鼠待抽腹水。在超净台内，用酒精棉球消 毒小鼠腹部皮肤，右手捏住针头中间，斜面向上刺入小鼠腹腔，变换针头同 小鼠的相对位置，使腹水快速流入离心管，可多次采集。抽取腹水时注意不 要触及针头两端，离心管口及内壁等，保证腹水不被热原污染。
2.6腹水处理腹水内含有红细胞、细胞碎渣、纤维蛋白凝块及脂质等, 需离心除去。4°C， 3000转/分，15分钟，吸取上部澄清腹水放入无热原盐水 瓶内，作好标记，-2(TC冻存，沉渣弃去。
2. 7腹水在处理前需提前12小时从-2(TC拿出放4。C冰箱融化。
2. 8腹水处理
2.8.1吸取石蜡融化的腹水液面有一层石蜡，用无热原吸管吸出弃掉， 尽量吸干净。留样检测效价。
2.8.2腹水处理，Xml腹水加入Xml0.4MNaCl溶液，再加入2Xmll009()饱和 硫酸铵(少量多次加入，边加边摇匀)用氨水调pH至6. 8—7. 0， 4""C放置4小时
或过夜o
2.8.3在4。C， 10 000转/分离心20分钟，上清弃去(检测效价为阴性)， 沉淀留下。
2. 9分子筛柱层析
① 柱型号35X1000 (mm)。
② 胶型号S印hacryl S-300 HR (Pharmacia) 750ml全部装入，按说明
书装胶。
③ 流量；3ml/min。
流动相0. 2mNaCl (MMA8)或0.4mNaCl (MMA3) pH7.0。 '⑤ 上样量1一5%柱床体积(7. 5 37. 5ml)，样品中总蛋白浓度〈40mg/ml。
⑥ 样品处理样品沉淀用流动相溶液吹打均匀，总体积在20 30ml左右为宜。
⑦ 加样方式用无热原移液管把样品液沿绕柱内壁小心的加入。不要冲 击着胶表面，待样品刚刚进入胶面后，向柱内加约10cm高流动相，洗脱，收峰。
⑧ 胶在位清洗(每上3次样约300rnl腹水清洗一次)冲无热原水约300ml， 流速3ml/min —冲0. 2mNaOH 400ml，流速lml/min—冲无热原水至pH为水 的pH值，流速lml/min —冲流动相。
2. 10半成品检定
上步中纯化后得到的抗体进行效价检定、无菌试验、蛋白含量测定、热 原试验、电泳等检测。 2. 10. 1效价
① 细胞上清1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160
② 腹水1:10; 1:100; 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:16000
③ 铵沉上清1:10; 1:100; 1:200; 1:400
半成品、成品1:10; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1600
步骤
① 准备片子将血膜片从-2(TC冰箱中取出，室温下放置30min;打开包 装，将正面对着风扇吹干，约30min;
② 固定将固定液从4。C冰箱中取出，放入血膜片(保证所用的圈完全浸 入固定液中)固定30秒后立即用自来水冲洗(冲洗时要小心，防止将细胞冲 掉)，吹干；
③ 镜检在显微镜下观察各圈内的细胞，选出可使用的，用记号笔在小 圈的周围画上网格线，作好标记； 加一抗把片子放在湿盒内，将稀释好的样品即一抗，按稀释倍数由 大到小依次加入各圈内(注意不要使样品溢出圈外相混，也不能太少，以免 样品干涸)，室温放置l小时；用pH7.2 ， 0.01MPBS缓冲液冲洗片子，吹干；
⑤ 加二抗向各圈中加二抗(羊抗鼠Ig抗血清)，在湿盒内放置30min; 用pH7. 2 ， 0. 01M PBS缓冲液冲洗片子，吹干；
⑥ 加三抗向各圈中加三抗(鼠抗碱性磷酸酶)，在湿盒内放置30min; 用pH7. 2 , 0. 01M PBS缓冲液冲洗片子，吹干；
⑦ 染色临用时现配制显色液(底物缓冲液lml加入坚固红lmg)，在混 合器上充分混匀(以稍显橙黄色为宜)，立即滴加到每个小圈内，将装有片子 的湿盒放入37t:水浴箱内作用30miri;自来水冲洗片子，吹干；
⑧ 复染向每个小圈中滴加复染液，作用30秒，立即用自来水冲洗干净， 吹干；
⑨ 封片将封片剂用热水溶解，滴在片子上，加盖玻片封片(防止产生 气泡)；
⑩ 观察结果在显微镜下观察细胞，阳性者细胞膜被染成玫瑰红色，细 胞核被染成蓝色。依据细胞膜被染色的程度由深到浅，依次用#、 +++、 ++、 +、 ±、一来表示。
2. 10.2无菌试验每个青霉素小瓶加3 4ml培养基，加lml药液，37 。C培养48h。
2. 10. 3热原试验兔热原检查法。在兔子耳朵静脉注射MMAs量为2mg/kg。
① 选择健康家兔雌雄均可，雌应无孕，体重1.7—3.0kg，体重差异不 超过700g。
② 室温变化《3。C,避免噪音干扰，室温18—28'C。
③ 家兔在测试前1小时开始停食并置于家兔固家盒中，至试验完毕。
④ 温度记录用肛温计插入肛门6cm，时间》1.5分钟，记录。⑤实验用器皿应置烘箱中25(TC加热30分钟或18(TC加热2小时。 (D正常体温测定与家兔分组家兔固定至少1小时后，每隔30分钟测体
温一次， 一般测定两次，两次之差不超过0.2'C，以这两次体温平均值作为该
兔的正常体温(38—39.6°0，各兔体温之差不超过rc 2. 10.4蛋白质含量测定
① 4呢碳酸钠溶液。取4g碳酸钠，加蒸馏水溶解成100ml
② 0. 2mol/L氢氧化钠溶液。取0. 8g氢氧化钠加蒸馏水溶解成100ml
③ 0. 04mol/L硫酸铜溶液。取0. 5gCuS04 5H20加蒸馏水溶解成50ml 2%酒石酸钾(或酒石酸钠)，加蒸馏水溶解成50ml
⑤ 碱性铜液。临用前取试剂①和②各25ml，试剂③和④各0. 5ml混匀配制 而成。
⑥ 酚试剂称取100g钨酸钠，25g钼酸钠，置1500ml烧杯瓶中，加入 700ml蒸馏水，50ml85y。磷酸及100ml浓硫酸，上联回流管微沸回流10小时， 取下回流管，加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水，几滴溴液，煮沸约15分钟， 驱除过量的溴。冷却，加蒸馏水稀释至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。酚 试剂贮备液经标准氢氧化钠滴定，测定酸浓度，而后用蒸馏水稀释相当lmol/L 盐酸浓度，即为酚试剂。
⑦ 标准蛋白质溶液。取牛血清白蛋白标准品，准确稀释至lmg/ml(含ml 于0.02呢NaN3)，为标准蛋白质贮备液。精确量取标准蛋白质贮备液2.5ml于 25ral容量瓶中，用含0.02%NaN3的蒸馏水稀释至刻度，为标准蛋白溶液
(勤ug/ml)。
⑧ 样品。精确量取一定体积样品(含蛋白质50ug左右)于试管中，加5ml 碱性铜溶液，混匀，于室温放置10分钟，快速加入0.5ml酚试剂，摇匀，于 室温放置30分钟，用650nm波长滤光片比色(呈色后，如发现浑浊，经3000rpm 离心15分钟后再比色)。⑨标准曲线。精确量取标准蛋白质溶液(100ug/ml) 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l,Oml，分别置于试管中，加蒸馏水补至lml，其余操作同样品，可得一 标准曲线。
2. 10. 5电泳还原及非还原SDS-PAGE法
① 浓縮胶浓度5%，分离胶浓度15%
② 浓縮胶电流15mA,分离胶电流20mA
③ 电极缓冲液50mol/L Tris-38m mol/L甘氨酸，PH8. 3， 0. 1%SDS
④ 电泳时间:lh
⑤ 样品处理样品与处理液3: 1混合，IO(TC， 3min，进行还原和非还 原处理，上样量每孔〉5.0ug
⑥ 染色方法考马斯亮兰染色。 2. 11过滤除菌 2.11.1过滤除菌前准备工作
① 过滤前需干烤物品磨口瓶(2500ml) 2个；盐水瓶若干；量筒；吸管； 刻度吸管；小烧杯；药匙；青霉素瓶；NaCl;漏斗；钢盘；饭盒；滤器；过
滤用玻璃管及套管。
② 过滤前需泡NaOH物品盐水瓶塞；青霉素瓶塞；过滤管；密封垫。
③ 用干烤的钢盘、无热原水泡大滤膜。
④ 过滤前需高压灭菌物品培养基；盐水瓶；吸管；整套滤器。 2.11.2加保护剂检定合格的半成品用相应的流动相稀释至蛋白浓度为
0.5mg/ml，按O. 1% (V/V)的量加入吐温-80，按2% (W/V)的量加入甘氨酸， 摇匀。
2.11.3过滤除菌在无菌条件下用0.22um微孔滤膜过滤除菌，先用无热 原水预过滤，确保滤膜无破损后再过滤药液，作无菌试验。 2. 12定量分装2. 12. 1分装前的准备工作
① 分装前需干烤物品安瓿瓶；小漏斗(装在搪瓷缸内)；分装瓶；饭盒; 磨口瓶(2500ml) 2个；大平皿、小平皿。
② 需泡双氧水物品分装器；针头；针头套。
③ 分装前需高压灭菌物品衣服；帽子；口罩；培养基；青霉素小瓶； 吸管；分装用针头；安瓿瓶；漏斗；整套分装器。
2.12.2分装在无菌条件下，5ml易折安瓿瓶定量分装，5.0ml/支，即 为成品。过敏试验针为lml/支，200ug, 5支成品配1支。 2. 13成品检定项目效价；无菌试验；热原试验。
具体方法与半成品检定方法一样。 2. 14包装，入库。
权利要求
1、鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体，其特征在于，该抗体是由保藏于中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC NOC200803的抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3分泌的单克隆抗体。
2、 根据权利要求1所述的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体， 其特征在于，制备方法步骤如下(1) 预注射液体石蜡 用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，每只腹腔注射0.5ml石蜡；(2) 细胞扩培将获得的杂交瘤细胞CCTCC N0:C200803接种到培养瓶中孵箱培养扩增， 收集细胞；(3) 接种细胞将上步收集到的细胞用生理盐水稀释调至1X106-3X106个/m1,每只小 鼠腹腔注射0.5ml;(4) 采集腹水挑出接种细胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水经澄清、分子筛柱层析纯化 后即可获得鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体。
3、 根据权利要求1或2所述的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗 体，其特征在于，所述抗体为IgG,亚类。
4、 根据权利要求1或2所述的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗 体，其特征在于，可进一步制成鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体注 射液(MMA:,)，临床上主要用于治疗再生障碍性贫血。
全文摘要
本发明公开了鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明利用杂交瘤细胞技术以胎儿胸腺细胞作为免疫原，利用Balb/c小鼠进行免疫，制备鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体。然后利用该抗体在Balb/c小鼠体内制备腹水，进一步制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)。该注射液在临床上主要用于治疗再生障碍性贫血，其疗效显著，副作用轻微，复发率低。
文档编号A61P37/02GK101307109SQ200810016668
公开日2008年11月19日 申请日期2008年6月4日 优先权日2008年6月4日
发明者张传林 申请人:张传林