专利名称：：千层纸素在制药中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于制药领域，涉及千层纸素在制药中的应用，特别是涉及千层纸素在制备抑制血管生长的药物中的应用。
背景技术：
：世界上恶性肿瘤的发生率继续呈上升趋势，2000年世界卫生组织统计全球的癌症新发病例达到1千万例，有600万例癌症死亡。癌症已经成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。近年来肿瘤化疗取得了很大的进展，肿瘤患者生存时间明显延长，但由于化疗药物的毒副作用，使临床应用受到一定限制。目前细胞毒性药物依然是抗肿瘤的基础和主要途径，同时真正能够达到高效低毒目标的药物少之又少，因此寻找高效低毒的天然药物或新化学药物已是各国药物学家追寻的目标。中药或中药提取物一般具有毒性低，价格便宜的优点。中药黄芩(Scutellariaeradix)系唇形科(Labiatae)植物黄苳(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。黄芩在祖国医学史上早有记载性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。在临床中属常用中药，用于治疗上呼吸道感染、泌尿系统感染、菌痢、肝炎、高血压等。实验研究表明黄芩除了传统意义上的抗炎、抗变态、抗病毒以及解热和保肝等生物活性之外，近年来对其抗氧化作用、心血管作用以及抗肿瘤作用的研究日趋深入。黄芩主要含黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)、汉黄芩苷(wogonoside)和千层纸素(OroxylinA)等活性成分。目前不少文献对千层纸素的抗肿瘤作用及诱导凋亡和周期阻滞进行了系统的研究，发现千层纸素对体外培养的人肝癌细胞HepG2有显著的生长抑制作用，且对ICR小鼠实验性移植瘤S咖也具有显著的生长抑制作用，抑制率最高可达40%以上，作用于低分化人胃腺癌细胞株BGC-823导致其周期阻滞于G2/M期，提示千层纸素可以诱导肿瘤细胞凋亡，并且可以针对细胞周期检测点调控肿瘤细胞生长。另外，肿瘤快速生长往往和新生血管的生长有关，抑制肿瘤血管的生长，也能有效地抑制肿瘤生长，但目前没有千层纸素对血管生长影响的研究报道。
发明内容本发明的目的是提供千层纸素在制备抑制血管生长药物中的应用。本发明的技术方案是千层纸素在制备抑制血管生长药物中的应用，特别是千层纸素在制备抑制肿瘤血管生长的药物中的应用。有益结果本发明提供了提供千层纸素在制备抑制血管生长的药物中的应用，特别是千层纸素在制备抑制肿瘤血管生长的药物中的应用，实验表明千层纸素对血管生长有较强的抑制作用，对肿瘤血管的生长也有较好的抑制作用，为制备抑制血管生长的药物提供了更多的选择。图1:千层纸素对MGC-803人胃癌裸鼠异种移植肿瘤重量的影响。其中A、空白对照组，B、羟基喜树碱对照组，C、5-FU对照组，D、千层纸素(80mg/kg),E、千层纸素(40mg/kg)。图2:千层纸素抑制内皮细胞迁移。其中A，对照；B，l(T6mol/L千层纸素；C，10—Smol/L千层纸素;D，1CrViol/L千层纸素。图3:千层纸素抑制内皮细胞小管生成。其中A，对照；B，10—6mol/L千层纸素；C，10—5mol/L千层纸素;D，1(^mol/L千层纸素。图4:千层纸素抑制内皮细胞划痕修复。其中A，对照；B，l(r6m0I/L千层纸素；C，1(y5mol/L千层纸素；D，1()4mol/L千层纸素。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1:千层纸素抑制人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长。方法人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤，由人胃癌MGC-803细胞株接种于裸小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为lx106，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mn^左右，在无菌条件下匀浆后制备成lxlO"ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100mi^后将动物随机分组，每组6只。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每隔一天测一次。给药体积为0.1ml/20g。阴性对照组静脉注射等量生理盐水溶液。给药14天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为-TV=l/2xaxb2其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV)，计算公式为RTV=Vt/VQ。其中Vo为分笼给药时(即d())测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%)，计算公式如下TrtvT/C(o/o)=-xlOOCrtvTrtv:治疗组RTV;CRTV:阴性对照组RTV。结果与评价千层纸素对人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见表l，2和图1。实验结果显示瘤体明显縮小，镜下观察见肿瘤血管显著减少，说明千层纸素对人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤有较好的抑瘤作用，并对肿瘤血管有一定的生长抑制作用。千层纸素以80mg/kg，40mg/kg静脉注射给药，连续给药14天时，对人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的T/C(。/。)分别为42.34%，71.61%，抑瘤率达61.1%，10.8%。同样条件下氟尿嘧啶以20mg/kg腹腔注射、羟基喜树碱以0.5mg/kg静脉注射时对人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的T/C(。/。)为29.51%，28.16%，抑瘤率为61.1%，70.8%。实施例2:千层纸素抑制内皮细胞迁移。目的和原理内皮细胞迁移实验采用transwdl细胞培养小室进行。孔径为8pm的多聚碳酸盐滤膜将小室分隔成上下两层。在生长因子刺激下，内皮细胞通过阿米巴运动穿过8pm的滤孔，附着在滤膜的背面。利用该模型可评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。方法将内皮细胞给予含有不同浓度千层纸素的1640培养基作用30分钟，然后将2.5xl()5个/mlHUVEC的细胞悬液400^1，加入到上室，下室加入600nl含刺激因子的1640培养液，于5XC02孵箱37'C中培养4小时。结果与评价取出滤膜，刮去膜上未迁移细胞，用100%甲醇固定滤膜，并5以苏木精一伊红染色，甘油封片，最后利用显微镜观察并拍照，结果见图2，其中A为对照组；B为l(T6mol/L千层纸素组；C为10'5mol/L千层纸素组；D为10—4mol/L千层纸素组。与对照组相比，给予千层纸素后，内皮细胞的迁移能力受到抑制，说明千层纸素可以抑制内皮细胞的运动，并呈剂量依赖性。实施例3:千层纸素抑制内皮细胞小管生成。目的和原理matrigel为大鼠ESH肉瘤细胞外基质提取物，富含IV型胶原，其成分与基底膜十分相似，可代替天然基底膜。利用内皮细胞在matrigd上爬行、融合形成小管来观察研究药物对血管生成的影响。方法将matrigd铺到96孔板上，80pl/孔，37°C，放置30min使其凝固。将内皮细胞分别给予含有不同浓度千层纸素的培养基作用30分钟，然后每孔加入lxl()S个/ml内皮细胞悬液10(^1。于5%(202孵箱37。C培养8小时后在相差显微镜(x400)下观察小管生成情况并拍照，每孔选择五个不同部位，计数小管生成量并进行统计学分析。结果与评价内皮细胞在matrigel中生长8小时后，细胞会由原来的多角形变成长梭形，并向凝胶基质中延伸生长，呈线形排列而形成管状结构，多个小管相互连接形成三维网状结构。结果见图3，其中A为对照组；B为10—Snol/L千层纸素组；C为10-Smol/L千层纸素组；D为10—Vwl/L千层纸素组。与对照组相比，给予千层纸素后内皮细胞网络状结构受到破坏，说明千层纸素可以抑制内皮细胞小管生成，并呈剂量依赖性。实施例4:千层纸素抑制内皮细胞划痕修复目的与原理在无菌条件下用移液器枪头在融合生长的内皮细胞上划痕，造成损伤模型。利用该模型可评价药物对内皮细胞划痕修复能力的影响。方法将内皮细胞接种至6孔板，待细胞生长覆盖率达到90%以后，用移液器枪头在孔板底部划"一"字形划痕，PBS冲洗除去漂浮的细胞和细胞碎片，分别给予含有不同浓度千层纸素的培养基，在倒置显微镜下拍照，然后置于5%C02孵箱37'C培养。结果与评价12，24h后在倒置显微镜下观察孔内细胞迁移能力的变化并拍照。结果见图4，其中A为对照组；B为10—6mol/L千层纸素组；C为10—5mol/L千层纸素组；D为1(T"mol/L千层纸素组。对照组损伤边缘有较多的细胞向划痕间隙迁出。与对照组相比，给予千层纸素后划痕边缘细胞迁出较少，说明千层纸素可以抑制内皮细胞划痕修复，并呈剂量依赖性。表l千层纸素对MGC803人胃癌裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响(X士SD，n-6，肿瘤体积单位mm3)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2千层纸素对MGC-803人胃癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、千层纸素在制备抑制血管生长药物中的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管生长药物为抑制肿瘤血管生长的药物。全文摘要本发明属于制药领域，公开了千层纸素在制药中的应用。本发明针对现有技术中没有千层纸素对血管生长影响的研究，提出了千层纸素在制备抑制血管生长药物中的应用的技术方案，根据本发明的技术方案，可将千层纸素用于制备抑制血管生长的药物。文档编号A61P35/00GK101244055SQ20081002035公开日2008年8月20日申请日期2008年3月3日优先权日2008年3月3日发明者云凌,娜卢,尤启冬,李志裕,郭青龙,颖高申请人:中国药科大学