专利名称：凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒制备方法及用途； 具体的说是涉及一种能快速使用，具有迅速止血、粘合和封闭创面作用的药物复合物，是一 种生物止血材料。
背景技术：
过度失血是事故和战伤致死的主要原因，也是外科手术治疗过程中致死的主要原因之 一，控制失血是手术、急救和野外创伤护理的关键环节。不幸的是，来自各种原因的出血(流 血)是非常见的，日常生活和工作中的意外受伤出血(流血)、外科手术中的创伤出血(流血)、 来自战争的受伤出血(流血)等，如不能控制及时控制，则将有可能造成巨大损失甚至死亡。 因此，止血日益成为医学界研究热点。常规的止血方法有人工挤压、烧灼术和伤口缝合但这 些方法有时并不能有效止血，而延长了止血时间。目前临床上，在皮肤刨伤和脾、肾等软组 织器官损伤及手术的出血治疗中，大都采用天然衍生可降解止血材料，主要有明胶海绵、氧 化纤维素、微纤维胶原粉末、纤维蛋白胶，胶原海绵等。而这些止血产品，在止血效果、止 血时间、创面愈合、生物相容性等方面都存在一定的不足。如明胶和胶原的组织黏附力较差， 两者的止血功能均依赖于足量的血小板和凝血因子，故应用受到限制。在第二次世界大战的 最后一年血纤蛋白原和凝血酶被广泛使用。不过后来受到了禁止，因为它会传播肝炎。自美 国红十字会以及其他机构开发出了血浆蛋白纯化方法，而且这些方法能消除肝炎的危险以 后，单一供体血纤蛋白密封剂被广泛地在临床上使用，不仅用于出血控制，而且用于各种手
术场合的手术室辅助物。在九十年代，广州倍绣科技公司率先以动物血作为原料，生产纤维 蛋白胶产品在国内获得大规模的应用。其原料是哺乳动物血液，具有来源广泛、价格低廉、 避免人类传染病等优点。但亦存在以下问题①环境稳定性差，需要低温贮存；②使用不便， 需要10-15分钟的准备时间；③功能单一，不能用作药物载体，如在肿瘤切除术中不能用作
局部化疗的载体等；④来自动物的血纤维蛋白胶其生物相容性差；⑤而且血纤维蛋白胶源自 血液，不能排除导致病毒感染的可能。因此，如何使用新技术、新材料，优化制备工艺，研 制一种具有生物安全性、生物相容性，且有较强的止血功能的新型止血材料，实现止血材料 的多功能性，便成为当前亟待研究和探索的重要课题。
4当前，天然多糖引起了国内外研究人员的极大重视，在止血领域，壳聚糖因为其优良的 止血、组织黏附、抗感染、促进伤口愈合等功能和良好的生物相容性和生物降解性，成为一 个研究热点。
壳聚糖[e — (1—4)—2—氨基—2—脱氧—D—葡萄糖]是一种独特的碱性多糖，其结构 见图l，是由甲壳素脱乙酰化而制备。甲壳素[e—(l一4)一2 —乙酰氨基一2—脱氧一D—葡萄 糖]广泛存在于甲壳纲动物虾、蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌和植物的细胞壁中，其结构中， 基于酰胺基团的三维空间氢键使得甲壳素具有较高的结晶度。由于壳聚糖源自生物体，具有 无毒、无抗原性和生物相容性，可在体内降解、吸收等特性，在医药方面的用途越来越引起 人们的重视。壳聚糖本身具有凝血特性，壳聚糖的凝血效果与它的物理性状和化学性质有关。 当异质材料和血液接触时，血浆蛋白迅速吸附在材料表面，主要包括白蛋白、y—球蛋白、 血纤维蛋白原和凝血原酶等，被吸附的血浆蛋白介导了血小板在材料表面的黏附。接着，血 小板发生形变并被激活，同时引起血小板内容物的释放(包括e —血小板球蛋白、5—羟色胺、 腺苷核苷酸和促凝血激活物等)。其中，腺苷核苷酸能促使更多的血小板在材料表面的黏附， 最终形成的血小板聚集体和不溶性血纤维蛋白以及被截留的血细胞共同形成了血栓。许多生 物大分子，如黏多糖、磷脂及细胞外基质蛋白都显负电性；在pH《6.8的环境中，壳聚糖即 质子化而显正电性。大量文献表明，壳聚糖的血栓形成能力部分归结于它和生物大分子之间 的静电相互作用。壳聚糖止血相关化学性质还包括分子量、脱乙酰度、质子化程度和结晶度。 高度有序的分子链三维结构赋予了壳聚糖优良的止血能力。壳聚糖本身的止血作用主要是通 过以下几个途径①壳聚糖和血小板相互作用；②壳聚糖和红细胞相互作用；③壳聚糖和补 体系统作用；④壳聚糖和血液其他成分作用。
壳聚糖除本身具有优良的止血作用外，壳聚糖还具有较好的成膜性，成膜后具有良好的
生物通透性和相容性；壳聚糖还可以作为药物载体，壳聚糖纳米级聚合物粒子作为药物传递 和控释的载体，由于其超微小的体积，合理的体内分布和高效的药物利用率，能够通过组织 上皮，从而更有效地对药物进行靶向输送和控制释放，因而成为包埋多肽、蛋白质、核酸、 疫苗等生物活性大分子药物的理想载体。从结构来看，壳聚糖具有水溶性和带正电荷的特性， 这具有非常重要的意义。这些特点使其在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一
些聚阴离子相互作用，由此发生的溶胶一凝胶转变过程则可方便地用于纳米微粒的制备。从 生物药剂的观点看，壳聚糖还能黏附于黏膜表面，这又提供了它作为一个黏膜给药体系的可 能。壳聚糖的还有一个特性是它能打开上皮细胞的紧密结合处，因此能很好地将大分子穿过 紧密的上皮层，随着新型药物给药系统的发展，作为无毒、来源丰富、具有良好生物相容性 及生物可降解性的天然物质，壳聚糖成为了应用广泛的新型辅料，利用壳聚糖所制成的纳米粒具有靶向、缓释、增加药物吸收、提高药物稳定等作用，成为新剂型研究的热点。
通过添加其它成分来对壳聚糖进行改性，在一定条件下，改性后的壳聚糖会在溶液中形 成自簇集组装结构从而来制备出壳聚糖纳米粒。由于这种制备纳米粒的方法不仅制备条件温 和而且纳米微粒表面存在大量亲水性或离子基团， 一类亲水性较强的大分子药物，便容易通 过氢键或静电相互作用结合在该微粒表面。因而蛋白、多肽等适合用该方法制备的纳米颗粒 来释放。而且制得的该纳米颗粒的载药量可高达50%，可达到给药剂量。
凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，它能水解血纤维蛋白原的4个Arg—Gly 肽键，产生不溶性的血纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固.在临床上，凝血酶是广泛使 用的局部止血药，可用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血以及外伤出血等。为局 部止血药，凝血酶与大多数酶类药物一样，稳定性较差，其水溶液在室温保存24d便完全失 活。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于克服凝血酶作为局部止血药稳定性较差的不足，发 挥壳聚糖的止血、成膜、药物载体、生物相容性及生物可降解性的多重功能，从而提供一种 具有迅速止血、粘合、封闭组织、使用快捷方便的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方 法。
本发明的技术方案是
一种凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特特征在于包括以下顺序步骤
(1) 将壳聚糖加入到乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，形成壳聚糖乙酸水溶液；
(2) 将凝血酶加入至p朋.0-8.0缓冲液中，搅拌溶解，形成凝血酶溶液；
(3) 将凝血酶缓冲溶液加入到壳聚糖乙酸水溶液中，加入交联剂至浓度为0.01%-0.10%, 升温至30°C-50°C ，以100转/分钟-800转/分钟的速度搅拌20分钟-60分钟，将其倾倒入 至液体石蜡中，搅拌，再加入分散剂至浓度为1%_10%，以300转/分钟-1500转/分钟的速 度高速搅拌2小时-8小时进行乳化；
(4) 取上述乳化液再加入交联剂至浓度为0. 5%-5. 0%，搅拌20分钟-60分钟，使其分散均 匀，置于3(TC-50'C水浴中进行交联，8小时-12小时，将产物冷却至室温，取出，进行过滤；
(5) 产物用丙酮洗涤2-5次，使得丙酮表面无漂浮油斑，即得凝胶状半透明纳米微粒； 以乙醇洗涤脱水，即得固态纳米微球；
(6) 将制备产品置于真空干燥器中1(TC-4(TC温度下真空干燥，得凝血酶一壳聚糖类白色 或白色自组装纳米微粒。所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(1)中乙酸水溶液的浓度为 0. 5%_2. 5%。
所述的凝血酶壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(l)中壳聚糖乙酸水溶液的壳 聚糖浓度为0. 5°/。-8%。
所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(3)中凝血酶缓冲溶液与壳聚 糖乙酸水溶液混合，其中壳聚糖与凝血酶的投料比为4: 0.5-2.0。
所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(2)中凝血酶可以是人凝血 酶、猪凝血酶、牛凝血酶或羊凝血酶。
所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(3)中将凝血酶缓冲溶液加入 到壳聚糖乙酸水溶液中时，对溶液缓慢搅拌。
所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(3)、 (4)中的交联剂可以是 聚乙二醇、海澡酸钠或戊二醛。
所述的凝血酶壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其步骤(4)中的分散剂可以是司盘80、 吐温80或泊洛沙姆。 _
根据上述方法制得的凝血酶-壳赛糖自组装纳米微粒，应用时可通过具有喷射功能的装 置将其喷涂到创伤面上，用于普通外科、.骨科、心胸外科、神经外科、脑外科、妇产科的组 织止血、组织封口和组织粘合。
为了制备成高活性、高稳定性、高机械强度的固定化酶，从而扩大酶类药物的应用范围， 本发明以壳聚糖(chitosan，即脱乙酰壳多糖)作载体.通过添加聚乙二醇、海澡酸钠、戊二 醛等成分来对壳聚糖进行改性，在一定条件下，壳聚糖在溶液中形成自簇集组装结构从而来 制备出壳聚糖纳米粒；由于这种制备纳米粒的方法不仅制备条件温和而且纳米微粒表面存在 大量亲水性或离子基团，将亲水性较强的大分子药物凝血酶很容易地通过氢键或静电相互作 用结合在该微粒表面，因而制备出固定化酶的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒。该纳米止血 材料，既发挥了壳聚糖本身的止血功效，又将凝血酶固定化，使凝血酶的止血效果更佳。同 时又提高了凝血酶的稳定性，使凝血酶以固体形式可常温保存。而且纳米微粒具有较好的流 动性，易在创面形成薄层，发挥壳聚糖的成膜功能，对出血创面组织起粘合和封闭作用。
本发明的优点和效果在于选择了适当的凝血酶与壳聚糖的投料比例、合适的反应条件首 次制备得到了能够在乙酸水溶液中自组装成纳米微粒的凝血酶-壳聚糖，此纳米微粒的凝血 酶非常稳定。本发明具有如下特点
l.本发明通过多糖乙酸水溶液自组装形成核壳结构的原理制备成高活性、高稳定性、高 机械强度的固定化酶新型纳米止血材料；2. 本发明这种制备纳米粒的方法不仅制备条件温和而且纳米微粒表面存在大量亲水性 或离子基团，将亲水性较强的大分子药物凝血酶通过氢键和静电相互作用结合在该微粒表 面，既提高了凝血酶的稳定性，又保存了凝血酶的活性；
3. 本发明制得产品既具有高分子微球类止血材料的特点(分子筛及提供凝血表面)，又 充分融合了生物类止血材料的优势(补充凝血因子，加速生理止血)，从而显著提高止血效 果；
4. 本发明制得产品中的壳聚糖既是形成纳米微粒的载体材料，又是本身具有止血功效 药物成分，同时还具有成膜功能，可对出血创面组织起粘合和封闭作用；
5. 本发明制得产品具有简单方便、止血快速、完全人体降解吸收和价格低等显著特点。
6. 本发明制得产品可广泛应用于临床手术、院前急救、战备前线以及人民日常生活等 各种急救需用领域，对提高我国临床手术和创伤急救水平有重要意义，其社会和经济意义都 十分可观。
图l是壳聚糖结构图2是本发明所制得凝血酶-壳聚糖纳米微粒的形态图。
具体实施例方式
本发明将壳聚糖加入乙酸水溶液形成壳聚糖溶液；将凝血酶加入到缓冲液形成凝血酶溶 液；将凝血酶溶液与壳聚糖溶液混合均匀，加入交联剂搅拌后，将其倒入液体石蜡中搅拌， 再加入分散剂，乳化；再加入交联剂通过水浴进行交联反应后，过滤，用丙酮洗涤后，再用 乙醇洗涤脱水，最后真空干燥，获得凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒。
以下通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明并不限于此特定例子。 实施例l
取壳聚糖粉20g,置三颈烧瓶中，加入2X的乙酸水溶液1000ml，搅拌使其完全溶解，
形成浓度为2. 0%的壳聚糖乙酸水溶液；另称取凝血酶5g(相当于30000ii)，加磷酸盐缓冲液
(pH7.4)100ml，搅拌溶解，形成凝血酶的缓冲溶液；在室温下缓慢搅拌，将凝血酶的缓冲溶
液滴加到上述壳聚糖乙酸水溶液中，滴加时间为30min,升温至4(TC，滴加0.1%戊二醛溶液
30ml，以200转/分钟的速度连续搅拌30min，停止搅拌，将其倾倒入至1500液体石蜡中，
搅拌25min，加入150ml的吐温80，以500转/分钟的速度高速搅拌4小时进行乳化；取乳
化液再加入25X的戊二醛溶液180ml，搅拌30min使其分散均匀，置于4(TC水浴锅中进行交联自组装8h，将产物冷却至室温，取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次300ml，， 即得凝胶状半透明纳米微粒；后再依次以70%、 80%、 90X及无水酒精各200ml洗涤脱水， 即得固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中3(TC真空干燥，得凝血酶一壳聚 糖类白色自组装纳米微粒24. 3g。 实施例2
取壳聚糖粉40g，置三颈烧瓶中，加入2.5^的乙酸水溶液1500ml，搅拌使其完全溶解， 形成浓度为2. 6%的壳聚糖乙酸水溶液；另称取凝血酶12g(相当于72000u)，加磷酸盐缓冲液 (pH7.2)200ml，搅拌溶解，形成凝血酶的缓冲溶液；在室温下缓慢搅拌，将凝血酶的缓冲溶 液滴加到上述壳聚糖乙酸水溶液中，滴加时间为50min，升温至45。C,滴加0.5X聚乙二醇溶 液100ml，以150转/分钟的速度连续搅拌40min，停止搅拌，将其倾倒入至2500液体石蜡 中，搅拌35min，加入200ml的司盘80，以800转/分钟的速度高速搅拌3小时进行乳化； 取乳化液再加入15X的聚乙二醇溶液300ml，搅拌40min使其分散均匀，置于45'C水浴锅中 进行交联自组装10h,将产物冷却至室温，取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次 500ml，即得凝胶状半透明纳米微粒；后再依次以70%、 80%、 90%及无水酒精各400ml洗 涤脱水，即得固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中35'C真空干燥，得凝血 酶一 壳聚糖类白色自组装纳米微粒52. 1 g 。 实施例3
取壳聚糖粉30g，置三颈烧瓶中，加入l^的乙酸水溶液1500ml，搅拌使其完全溶解， 形成浓度为2. 0%的壳聚糖乙酸水溶液；另.称取凝血酶6g(相当于36000u),加草酸盐缓冲液 (pH7.5)150ml，搅拌溶解，形成凝血酶的缓冲溶液；在室温下缓慢搅拌，将凝血酶的缓冲溶 液滴加到上述壳聚糖乙酸水溶液中，滴加时间为40min，升温至50'C，滴加0.5X海澡酸钠溶 液30ml，以250转/分钟的速度连续搅拌20min，停止搅拌，将其倾倒入至2500液体石蜡中， 搅拌25min，加入150g的泊洛沙姆，以800转/分钟的速度高速搅拌3小时进行乳化；取乳 化液再加入15%的海澡酸钠溶液250ml，搅拌50min使其分散均匀，置于5CTC水浴锅中进行 交联自组装12h，将产物冷却至室温，—取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次400ral， 即得凝胶状半透明纳米微粒；后再依次以70%、 80%、 90X及无水酒精各250ml洗涤脱水， 即得固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中4(TC真空干燥，得凝血酶一壳聚 糖类白色自组装纳米微粒36. 3g。 实施例4
取壳聚糖粉25g，置三颈烧瓶中，加入1.5X的乙酸水溶液1200ml，搅拌使其完全溶解，
形成浓度为2.1%的壳聚糖乙酸水溶液；另称取凝血酶6g(相当于31000u)，加磷酸盐缓冲液
9(pH7.4)120ml，搅拌溶解，形成凝血酶的缓冲溶液；在室温下缓慢搅拌，将凝血酶的缓冲溶 液滴加到上述壳聚糖乙酸水溶液中，滴加时间为35min，升温至40°C，滴加0. 1%戊二醛溶液 35ml，以180转/分钟的速度连续搅拌40min,停止搅拌，将其倾倒入至1600液体石蜡中， 搅拌30min，加入130ml的司盘80，'以500转/分钟的速度高速搅拌4小时进行乳化；取乳 化液再加入25%的戊二醛溶液180ml，搅拌30min使其分散均匀，置于4CTC水浴锅中进行交 联自组装10h，将产物冷却至室温，取出，进行过滤，得产物用丙酮洗涤3次，每次350m1，， 即得凝胶状半透明纳米微粒；后再依次以70%、 80%、 90X及无水酒精各220ml脱水，即得 固态纳米微球；将制得固态纳米微球置于真空干燥器中35'C真空干燥，得凝血酶一壳聚糖类 白色自组装纳米微粒30.7g。
对本发明所制得产品的分析试验及结果如下
(一)本发明所制得的自组装凝血酶-壳聚糖纳米微粒，在室温条件下，用透射电镜研 究凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的形态与粒径。结果见图2，制备得到的纳米粒呈球形或类 球形，且具有比较光洁的表面以及很好的规整度，大多形态比较均匀完整，制备得到的粒径 分布为20-300nm。
(二 )凝血酶活性测定与凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒中固定化凝血酶的稳定性考察
a. 纤维蛋白原溶液的制备精密称取纤维蛋白原标准品适量，加0.9XNaCl溶液溶解， 制成含0.2%凝固物的溶液.加0.05mol/LNa2HP(V溶液适量，调pH为7.0—7.4。再加0. 9 %NaCl溶液稀释成含0. 1%凝固物的纤维蛋白原溶液，备用；
b. 标准曲线的制备精密称取凝血酶标准品适量，加0. 9%NaCl溶液溶解并制成为每lml 含凝血酶为5. 0、 6. 4、 8. 0、 10. 0 u的标准溶液，摇匀。另取内径lcm，长10cm的试管4支.各 精密加入0. 1%纤维蛋白原溶液0. 9ml.置(37±0. 5) 。C水浴中恒温5min，分别精密加入标准 溶液各0. lml，立即记时，摇匀，，置(37±0. 5) 。C恒温水洛中，分别观察各个试管中纤维蛋白 原的初凝时间，平行测定5次，得标准曲线方程Y^6.52-0.21t(其中y为凝血酶活性单位浓 度，t为初凝时间)，r=0.9982.
c. 凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶活性测定精密称取凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶适量 (约相当于凝血酶10u)，精密加入磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，按凝血酶活性测定项下方法
测定初凝时间，代入标准曲线方程计算，即得。测得本制备方法所得固定化凝血酶活性回收 率为89. 96% 。 RSD为0. 32% (n=5)。
d. X射线衍射实验
分别对凝血酶、壳聚糖、凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶进行x射线衍射实验。结果显示，固定化凝血酶X衍射图谱中，壳聚糖载体19.76。的特征衍射峰消失，45.45° 、 31.87°出 现了凝血酶特征衍射峰，表明凝血酶没有被破坏，与壳聚糖发生了交联，凝血酶被固定于载 体上。
e.凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶的稳定性考察
(l)光照试验取凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶置注射剂澄明度测定仪下，于3000-50001x 光照度放置10d按固定化凝血酶活性测定项下的方法，于0、 1、 3、 5、 10d分别取样测定， 结果见表l。
表1光照试验结果
时间(d)性状活性(u)活性回收率(％)
0类白色粉末7. 69100
1类白色粉末7.4897
3类白色粉末7. 5798
5类白色粉末7. 6299
10类白色粉末7. 1393
(2)低温试验
取凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶置密闭容器中在0。C放置10d，按固定化凝血项下方法，于o、1、 3、 5、 10 d分别取样测定，结果见表2。
表2低温试验结果
时间(d)性状活性(u)活性回收率(％)
0类白色粉末7.69100
1类白色粉末6. 7898
3类白色粉末6.8198
5类白色粉末6. 6295
10类白色粉末6. 4693
(3)高温试验
取凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶置密闭容器中，分别在40。C、 6(TC、 8CTC放置10 d，按
固定化凝血酶活性测定项下方法，于0、 1、 3、 5、 10 d分别取样测定，结果见表3。
表3高温试验结果
温度rc)时间(d)性状.活性(u)活性回收率(％)
0类白色粉末7. 69100
1类白色粉末7.4296
403类白色粉末7.6199
5类白色粉末7.5898
10类白色粉末7.5397
0类白色粉末7.65100
1类白色粉末7.31%
603类白色粉末4.8163
5淡黄色粉末-0. 65-8.5
10淡黄色粉末-1.43-19
110类白色粉末7.67100
1淡黄色粉末-0.37_4.8
803淡黄色粉末-2. 74-36
5淡黄色粉末-3. 12-41
10淡黄色粉末-3. 46-45
(4)室温留样观察
取凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶在室温自然条件下放置，按固定化凝血酶活性测定项下 方法于0、 0.5、 1、 2、 3月分别取样测定，结果见表4. (5)对酸碱的稳定性
精密称取凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶适量，分别加pH值为5.5、 5.9、 6.0、 6.8、 7.4、 8.0、 8.5、 9.0、 9.1的缓冲溶液溶解，在室温放置72h，按固定化凝血酶活性测定项下方法 测定其活性。结果表明，在72h内，在pH5.9 — 9.1范围内均有恬性。72h后，仅pH值6. 8-9.0 之间比较稳定，在pH值为7. 4时活性无下降，而在pH值为5. 9、 6. 0和9. 1时，活性基本 丧失。
表4室温留样观察结果
时间(月)__活性(u) 活性回收率(％)
5 类白色粉末 ^
0.5 类白色粉末 7.62 99
1 类白色粉末 7.51 98
2 类白色粉末 7.65 99
3 类白色粉末 7.17 93
实验结果显示，凝血酶-壳聚糖固定化凝血酶在光照、低温、高温、室温留样观察及酸 碱等不同条件下，均具有较好稳定性仅在60。C、 80'C高温条件下该固定化酶的初凝时间延长 了，虽然用文中固定化凝血酶活性测定方法不能测出其活性(按标准曲线方程计算为负值)， 但实际凝血教果依然较好。
(三)凝血酶-壳聚糖纳米微粒止血效果试验 本实验考察了本发明所制得的凝血酶-壳聚糖纳米微粒对家兔体内出血模型的止血时 间，以验证凝血酶-壳聚糖纳米微粒的止血作用。 1材料和方法 1. 1材料
凝血酶-壳聚糖纳米微粒按实施例4制备所得，批号070609;样品用具有细小喷孔的 软塑料瓶分装。健康家兔，雌雄均用，体重2.5 3.0kg，(由南方医科大学实验动物中心提 供)；戊巴比妥钠(南方医科大学动物实验中心)；云南白药(云南白药集团股份有限公司)； 普通纱布、可溶性止血纱布和胶原蛋白海绵，均由市场购得。
1. 2试验方法
121.2. 1止血实验
戊巴比妥钠按30mg/kg体重于兔耳静脉缓慢注入，麻醉动物。腹部剪毛，消毒铺巾后， 沿右侧肋缘下6cm切口，深度先至皮肤全层，再切开腹肌至腹膜层，提起腹膜，剪开进入腹 腔。从肋缘下找到肝脏，并暴露肝脏。在其平坦面，用15号手术刀片沿肝脏长轴先后划出 长lcm，深lmm的两条对称性伤口，创面出血活跃。10S后两侧伤口按随机化原则分别敷云 南白药或凝血酶-壳聚糖纳米微粒100mg，观察创面出血情况，每隔3 5s观察一次，伤口停 止出血的时间为止血时间；若2min内未再出血，即认为止血成功，记录止血时间，并观察 止血制剂与创面的粘合情况。
1. 2. 2统计学方法
采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析。数据以均数土标准差表示，组间比较行配 对t检验P值〈0. 05为有统计学意义。 1.3出血时间(bleeding tirae， BT)
凝血酶-壳聚糖纳米微粒组BT为0. 83±0. llmin，云南白药对照组BT为3. 33±0. 37min。 经统计学分析，两组比较差异有统计学意义(P〈0.01)。同时，凝血酶-壳聚糖纳米微粒与创 面黏附良好，能有效地密封出血创面在止血操作中，先用纱布吸干出血后，再用凝血酶-壳 聚糖纳米微粒覆盖渗血创面可以起到良好的止血作用。
2结果和讨论
凝血酶-壳聚糖纳米微粒具有明显的止血作用，主要作用表现在以下几个方面首先凝 血酶-壳聚糖纳米微粒对组织表面有较强的粘附性，特别是粘附在出血周围的组织，吸收血 液后体积縮小，对创面形成压迫作用，阻止进一步出血；吸收血液中的水份后使血液粘稠， 减少血液的流动性促进止血；凝血酶-壳聚糖纳米微粒吸水后形成水凝胶，水凝胶分子中的 羟基能和纤维蛋白原分子形成氢键，促进纤维蛋白的交链，加速止血，这也是凝血酶-壳聚 糖纳米微粒加速血液凝固减少出血量和縮短出血时间的主要作用机制。云南白药吸收血液后 使血液变粘稠，但对创面的粘合性不强。^南白药的止血作用不如凝血酶-壳聚糖纳米微粒 理想。结论凝血酶-壳聚糖纳米微粒是一种新型的可降解生物材料，具有肯定的止血作用。 在分子水平上凝血酶-壳聚糖纳米微粒能增强纤维蛋白原的凝固性，縮短凝血酶时间；在大 体水平上凝血酶-壳聚糖纳米微粒对组织表面具有较强的粘附性，压迫创面止血，吸收血液 中的水份使血液粘稠，促进凝血，达到縮短止血时间和减少出血量的作用。
权利要求
1. 一种凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于包括以下顺序步骤(1)将壳聚糖加入到乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，形成壳聚糖乙酸水溶液；(2)将凝血酶加入至pH6.0-8.0缓冲液中，搅拌溶解，形成凝血酶溶液；(3)将凝血酶缓冲溶液加入到壳聚糖乙酸水溶液中，再加入交联剂至浓度为0.01％-0.10％，升温至30℃-50℃，以100转/分钟-800转/分钟的速度搅拌20分钟-60分钟，将其倾倒入至液体石蜡中，搅拌，再加入分散剂至浓度为1％-10％，以300转/分钟-1500转/分钟的速度高速搅拌2小时-8小时进行乳化；(4)取上述乳化液再加入交联剂至浓度为0.5％-5.0％，搅拌20分钟-60分钟，使其分散均匀，置于30℃-50℃水浴中进行交联，8小时-12小时，将产物冷却至室温，取出，进行过滤；(5)产物用丙酮洗涤2-5次，使得丙酮表面无漂浮油斑，即得凝胶状半透明纳米微粒；再以乙醇洗涤脱水，即得固态纳米微球；(6)将制备产品置于真空干燥器中10℃-40℃温度下真空干燥，得凝血酶—壳聚糖类白色或白色自组装纳米微粒。
2. 根据权利要求l所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(l)中乙酸水溶液的浓度为0. 5%-2. 5%。
3. 根据权利要求1所述的凝血酶壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(l)中壳聚糖乙酸水溶液的壳聚糖浓度为0. 5%-8%。
4. 根据权利要求1所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，凝血酶缓冲溶液与壳聚糖乙酸水溶液混合，其中壳聚糖与凝血酶的投料比为4: 0.5-2.0。
5. 根据权利要求l所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中凝血酶是人凝血酶、猪凝血酶、牛凝血酶或羊凝血酶。
6. 根据权利要求l所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中将凝血酶缓冲溶液加入到壳聚糖乙酸水溶液中时，对溶液缓慢搅拌。
7. 根据权利要求l所述的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(3)、 (4)中的交联剂是聚乙二醇、海澡酸钠或戊二醛。
8. 根据权利要求1所述的凝血酶壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述 步骤(4)中的分散剂是司盘80、吐温80或泊洛沙姆。
9. 根据权利要求l所述的凝血酶壳聚糖自组装纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(5)中的以乙醇洗涤脱水，是以70%、 80%、 90%及无水酒精依次脱水，得到固态 纳米微球。
10.根据权利要求1制得的凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒，应用时可通过具有喷射功能 的装置将其喷涂到创伤面上，用于普通外科、骨科、心胸外科、神经外科、脑外科、妇产科 的组织止血、组织封口和组织粘合。
全文摘要
本发明涉及凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒制备方法及用途。本发明将壳聚糖加入乙酸水溶液形成壳聚糖溶液；将凝血酶加入到缓冲液形成凝血酶溶液；将凝血酶溶液与壳聚糖溶液混合均匀，加入交联剂搅拌后，将其倒入液体石蜡中搅拌，再加入分散剂，乳化；再加入交联剂通过水浴进行交联反应后，过滤，用丙酮洗涤后，再用乙醇洗涤脱水，最后真空干燥，获得凝血酶-壳聚糖自组装纳米微粒。本发明将凝血酶与壳聚糖按比例投料首次制备得到自组装成纳米微粒的凝血酶-壳聚糖，保持其凝血酶的稳定性和更好地发挥其壳聚糖与凝血酶的综合止血效果。本发明可广泛应用于外科领域如普外科、骨科、心胸外科、神经外科、妇产科等的组织止血、组织封口和组织粘合。
文档编号A61L15/38GK101485899SQ200810025839
公开日2009年7月22日 申请日期2008年1月16日 优先权日2008年1月16日
发明者李吉来, 江彩霞, 潘小宁, 肖尚志, 陈彥文, 星 黄 申请人:广州倍绣生物技术有限公司