专利名称：采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用组织工程生物技术构建器官型全层皮肤的方法，可以用于替 代活体动物(人体)皮肤用于毒理学试验领域。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品等)或物理机械因素(紫 外线)毒性作用的器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性测试是药品、食品添加剂 及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的常用检测项目。传统的皮肤安全性 评价实验不仅要求一定数量的动物，而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造 成极大的痛苦。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了 以〃减少〃、 〃替代〃和〃优化"为代表的3R原则，并在此基础上大力开展动物实验替代 方法的研究。特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已被科学家采用 并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所接受。2002年11月7日欧洲议会与欧盟理 事会在布鲁塞尔达成协议，决定"从2009年起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆 品毒性和过敏实验"，也"不允许成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品"。 欧盟新化学品法规REACH (化学品的注册、评估、许可和限制)也提出鼓励动物试验 替代方法的开发和应用。采用体外构建的组织工程皮肤进行毒性评价是动物试验替代 技术的关键领域之一。
组织工程化皮肤分为组织型表皮替代物、真皮替代物和器官型全层皮肤替代物几 类。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纤维细胞作滋养层，体外培养人自体表 皮纟田胞获得成功(Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinozytes: the formation of keratinizing colonies from singlecells. Cell. 1975， 6:331-344)。美国Advanced Tissue Science公司生产的商品名 为Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、 PGL网为基础，植入新生儿成纤维细胞 后培养成人工真皮替代物，结合自体表皮膜片用于临床移植(Hansbrough JF, Dore C， Hansbrough WB. Clinical trails of a living dermal tissue replacement placed beneath mesh, split—thickness skin grafts on excised burn wounds. J Burn Care Rehabil， 1992， 13:519-529)。美国Organogenesis公司生产的Testskin人工皮月夫 模型，其表皮层由人角质细胞分化形成，真皮层由人成纤维细胞种植于I型牛胶原支 架构成 (Rodriguez H, 0'Connell C， Barker PE, et al. Measurement of DNA biomarkers for the safety of tissue-engineered medical products, using artificial skin as a model. Tissue Eng，2004, 10 (9-10):1332-1345)。 2001年2 月6 Fl伍津津等人申请了有关专利(中国专利申请号01107099. 4)，该发明包括胶原 凝胶的制备和细胞的三维培养等。2002年9月2日金岩等人申请了有关专利(中国专 利申请号02139398. 2)，该发明包括胶原凝胶的制备和全层皮肤的培养等内容。但这 几种皮肤替代物主要用于烧伤和溃疡、创伤等皮肤缺损病人的临床治疗，还不能替代 活体动物皮肤成熟用于皮肤毒性检验。作为组织工程皮肤也存在以下缺点人工表皮 由于不含真皮层，还不是真正意义上的人工皮肤；含双层结构的人工皮肤组织构造上 还有待改进；培养周期长，皮肤功能在体外维持时间短，不适用于慢性毒性试验。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，就是提供一种采用嵌入式培养法制备毒性检验用器 官型人工皮肤的方法，该方法培养周期短，皮肤功能和活性在体外维持时间长。能满 足毒性检验领域的需要。
实现本发明依次包括以下几个步骤
1、制作由胶原与细胞外基质混合物组成的复合胶原真皮支架1) 将壳聚糖与透明质酸、6-硫酸软骨素两者之一或全部混合制备成细胞 外基质混合物；采用壳聚糖与透明质酸混合时质量比例为6.5 — 7.5: 2.5_ 3.5;采用壳聚糖与6-硫酸软骨素时质量比例为7.0 — 7.5: 2.5 — 3.0;采用壳 聚糖、透明质酸、6-硫酸软骨素全部混合时质量比例为4.5 — 5.5: 2.5 — 3.5: 1.5 — 2.5;
2) 在无菌条件下将胶原浸泡于冰冷-4'C、 0. 1%的醋酸溶液中，胶原浓度 为8-10mg/ml范围，调节PH值到7. 2 — 7.3制备胶原溶液，操作应在4"进行；
3) 在胶原溶液中加入l)步骤所得的细胞外基质混合物，得到复合胶原 溶液，复合胶原溶液中细胞外基质混合物与胶原的质量比例为2-2. 5: 7. 5-8;
4) 取lml制备好的复合胶原溶液置于孔径为3.5 cm的圆形模具中或6 孔细胞培养板中，用0. lml的1%—1.5%的戊二醛溶液4'C共价交联24士0. 5 小时，用0. 1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2-3次，制成海绵状复合胶原 基质；
5) 将复合胶原基质用波长254nm、36W的紫外线照射除菌后放置在-25 °C一-3CTC低温冰箱冷冻过夜12-18小时，然后再在一50。C55°C、 1 Pa条 件下，冻干机真空冷冻干燥24土1小时，制备复合胶原真皮支架；
2、原代培养人皮肤成纤维细胞和角质细胞的制备
1) 将手术环切下的新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0. 1mol/LPBS缓冲液彻 底清洗，无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1.0mmX1.5mm的皮片， 用质量浓度0. 25。/。裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，方式有37"C消化2± 0. 5小时或是4。C过夜12-18小时，生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；
2) 表皮部分用质量浓度0. 25%胰酶+0. 01%EDTA消化成单细胞悬液，用角质细 胞无血清培养基重悬细胞，接种于IV型胶原包被的培养皿中，置5% C02 37。C培养箱内孵育10 — 15min，吸出培养液及未贴壁细胞，用角质细胞无血清 培养基继续培养人角质细胞，每48-60小时半量换液；
3)真皮部分以0. 125%胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，放入含10% 新生牛血清高糖DMEM (H-固EM)培养基培养，每24-36小时半量换液；
3、 人工真皮替代物制备
将第1步所得之复合胶原真皮支架置于12孔嵌入式培养皿上，加入含有10% 新生牛血清的H-DMEM培养基湿润，以最小容量100-200 u 1接种第2步3)培养 基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1 X 105Cell/cm2 — 2X 10Scell/cm、待4-8小时细胞粘附后，加1. 5_2ml足量含10%新生牛血清的H-DMEM 培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养7-IO天，完成人工真皮替代物构 建；所说的嵌入式培养皿为Corning Costar公司的Transwell或millpore公司 的millcell，孔径0. m，底部支持膜为透明的聚酯膜，使用前包被浓度为0. 4% 的人源IV型胶原蛋白；
4、 人工皮肤专用培养基制备
无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青 霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，转移到H-DMEM液中；在无菌环境下， 按培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，使羊膜上皮面向上全铺或半 铺布于6孔板的孔底，然后加入角质细胞无血清培养基，收集羊膜分泌液；
取角质细胞无血清培养基与人羊膜分泌液按体积比8—8. 5:1. 5 — 2混合，再添加 5X1(T1Q M霍乱毒素，2. 5yg/ml氢化可的松、25ug/ml胰岛素、25ug/ml转铁蛋白 和IXIO -1Q M甲状腺素T3、 0. 001ng/mL人重组EGF、 24.3 ug/mL腺嘌呤活性成分， 配制成人工皮肤专用培养基；
5、 器官型全层人工皮肤制备在第3步所述人工真皮替代物上接种第2步2)原代培养的人角质细胞，接种细 胞密度为1 x 105cell/cm2-2 x 105Cell/Cm2，用第4步制备的人工皮肤专用培养基代替 角质细胞无血清培养基和含10y。新生牛血清的H-DMEM培养基，采用气-液界面培养， 每48-60小时半量换液，8-10天后完成人工皮肤初级产品制备；
6、检测
同一批以12孔培养板制备的人工皮肤中，取其中一块人工皮肤从嵌入式培养皿取 下，固定于以PBS配制的4。/。多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5" m—6um，苏木素-伊红(H.E)染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构去除皮肤结 构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量 少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层和角化层三层结构；真皮层含大量 成纤维细胞，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的人工皮肤产品，可用于皮肤 毒性检测试验。
所述的胶原为商品，主要成份为来源于牛肌腱或猪皮或鼠尾的I型胶原粉末。 所述的角质细胞无血清培养基(SFM-KC)为商业化购自国外公司，如美国 BioWhiUaker公司的KBM(Keratin。cyte Basal Medium)或GIBC0公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
所述的真皮支架也可委托商业公司制备，以实现真皮支架的标准化。
所得的人工皮肤产品用于皮肤刺激性检测化妆品、化学品等固体或液体受试物
直接放置于人工皮肤表面，液体用量为10yl，固体用量为(10士2)mg并涂布均匀， 作用(15±1)分钟后，以无菌PBS冲洗去除受试物再孵育(42±1)小时。取下嵌入 式培养皿的半透支持膜,部分组织固定于多聚甲醛，HE染色观察组织病理学形态结构； 部分组织采用MTT法分析细胞活性，或用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-2等毒性 效应指标。所说的MTT法为一种检验细胞活性的常规方法，所说的ELISA检测法为一种检测 细胞因子的常规方法。
有益效果本发明的方法培养人工皮肤周期短，皮肤功能和活性在体外维持时间 较长，能满足毒性检验领域的需要，制备的人工皮肤重复性好、标准化程度高。通过 本发明制备的器官型全层皮肤在解剖和组织结构上更接近于天然皮肤，其应用于毒性 检验的方式和检测指标更符合皮肤毒性作用的实际情况，可以代替整体动物，直接应 用于化学品、化妆品、药品、农药等健康相关产品的皮肤毒性试验。
图1为嵌入式培养毒性检验用器官型全层人工皮肤的模式图； 图2器官型全层人工皮肤组织结构图。
具体实施例方式
参见图1和图2。
图1为嵌入式培养毒性检验用器官型人工皮肤的模式图
图2所示为器官型全层人工皮肤组织结构图，HE染色，生物显微镜观察，放大倍 数200倍。
本发明的采用嵌入式培养法三维构建双层活性人工皮肤的方法，依次包括以下几 个歩骤
实施例1
1、制作真皮支架
1) 预先将壳聚糖、透明质酸和6-硫酸软骨素按质量比例5: 3: 2用普通方 式混合，制备细胞外基质混合物；
2) 无菌条件下，将来源于牛肌腱的胶原粉末浸泡于-4'C、 0. 1%醋酸溶液中， 使胶原浓度为10mg/ml，调节PH值到7. 2制备胶原溶液，操作应在4'C进行；3) 然后将预先混合好的细胞外基质混合物加入牛胶原溶液中，制得复合胶原 溶液，胶原与细胞外基质混合物质量比例为8: 2;
4) 取lml制备好的复合胶原溶液置于孔径为3.5 cm的6孔培养板中，用 0. lml的1.5%的戊二醛溶液4'C共价交联24小时，用0. 1mol/L磷酸盐缓冲 液(PBS)漂洗3次，制成海绵状复合胶原基质；
5) 将复合胶原基质用波长254 nm、 36W的紫外线照射除菌后放置在-28°C 低温冰箱冷冻过夜15小时，然后再在—52°C、 1 Pa条件下，冻干机真空冷 冻干燥24 h，制备复合胶原真皮支架；所得真皮支架呈多孔状结构，厚约3mm 士lmm，孔径70士20um;真皮支架也可委托商业公司制备，以实现真皮支架 的标准化；
2、原代培养人皮肤成纤维细胞和角质细胞的制备
1) 将手术环切下的新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0. 1mol/LPBS缓冲液彻 底清洗，无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1. 0mmX 1. 5mm的皮片， 用质量浓度0. 25y。裂解酶(Dispases))4'C过夜冷消化15小时，分离表皮和真 皮，生理盐水或D-Hanks液清洗3次；
2) 表皮部分用质量浓度0. 25%胰酶+0. 0P/。EDTA消化成单细胞悬液，用角质细 胞无血清培养基重悬细胞，接种于IV型胶原包被的培养皿中，置5% C02 37 。C培养箱内孵育10min，吸出培养液及未贴壁细胞，用角质细胞无血清培养 基继续培养；所述的角质细胞无血清培养基(SFM-KC)为商业化购自国外公 司，如美国BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBC0 公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte SFM)，每48小时半量换液;
3) 真皮部分以0.125%胰酶消化获取成纤维细胞，放入含10%新生牛血清 H-DMEM培养基培养，每24小时半量换液；3、 人工真皮替代物制备
将第1步所得之复合胶原真皮支架置于12孔嵌入式培养皿上，加入含有10%新生 牛血清的H-DMEM培养基湿润，以最小容量150 u 1接种第2步3)培养基悬浮的原代 培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1.5X105cell/cm2， 4小时后细胞粘附，加1.5ml 含10%新生牛血清的H-DMEM培养基浸没培养，每36小时半量换液，培养8天，完成 人工真皮替代物构建；所说的嵌入式培养皿为Corning Costar公司的Transwell，孔 径0.4iim，底部支持膜最好为透明的聚酯膜，使用前包被浓度为0.4。/。的人源IV型胶 原纤维；
4、 人工皮肤专用培养基制备
无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青 霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，转移到H-DMEM液中；在无菌环境下， 按培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，使羊膜上皮面向上全铺或半 铺布于6孔板的孔底，然后加入角质细胞无血清培养基，收集羊膜分泌液；
取角质细胞无血清培养基与人羊膜分泌液按体积比8:2混合，再添加5X1(T1Q M 霍乱毒素，2. 5ug/tnl氢化可的松、25wg/ml胰岛素、25 y g/ml转铁蛋白和1 X 10 "° M甲状腺素T3、 0. 001ng/mL人重组EGF、 24.3 ug./mL腺嘌呤活性成分，配制成人工 皮肤专用培养基；
所述的角质细胞无血清培养基为商业化购买美国BioWhiUaker公司的KBM (Keratinocyte Basal Medium)角质细胞无血清培养基
5、 器官型全层人工皮肤培养
在第3步所述生长于嵌入式培养皿上的人工真皮替代物上接种原代培养的人角质 细胞，接种细胞密度为lxl05cell/cm2;用第4步配制的人工皮肤专用培养基培养代 替含血清的H-DMEM培养基，气-液界面培养，每48小时半量换液，8-10天后完成人工皮肤初级产品构建； 6、检验
将构建好的组织工程人工皮肤从嵌入式培养皿取下，固定于以PBS配制的4%多聚 甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5tim—6pm，苏木素-伊红(H. E)染色；
显微镜下观察该批次的人工皮肤的组织结构，如表皮层应含基底层、棘层和角化 层三层结构；真皮层应含大量成纤维细胞，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显。 则该批人工皮肤可用于毒性检验。
实施例2
1、制作真皮支架
1) 预先将壳聚糖和透明质酸按质量比例7.2: 2: 8用普通方式混合，制备细 胞外基质混合物；
2) 无菌条件下，将来源于猪皮的胶原粉末浸泡于-4'C、 0. 1%醋酸溶液中，使 胶原浓度为8mg/ml，调节PH值到7. 25制备胶原溶液，操作应在4'C进行， 先将以免猪胶原降解；
3) 将预先混合好的细胞外基质混合物按与猪胶原质量比例为2.5: 7.5加入 猪胶原溶液中，制得复合胶原溶液；
4) lml制备好的复合胶原溶液置于6孔细胞培养板中，用0. lml的1.25%的 戊二酸溶液4。C共价交联24.5小时，用O. 1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) 漂洗3次，制成海绵状复合胶原基质；
5) 将复合胶原基质用波长254 nm、 36W的紫外线照射除菌后放置在-25'C低 温冰箱冷冻过夜18小时，然后再在一53。C、 1Pa条件下，冻干机真空冷 冻干燥23h，制备复合胶原真皮支架；所得真皮支架呈多孔状结构，厚约 3誦，孔径80士20ym;2、 人成纤维细胞和角质细胞的制备
1) 将手术环切下的新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0. 1mol/LPBS缓冲液彻 底清洗，无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1.0mmX1.5mm的皮片， 用质量浓度0. 25。/。裂解酶(Dispases)37'C消化2小时，分离表皮和真皮，生 理盐水或D-Hanks液清洗5次；
2) 表皮部分用质量浓度0. 25%胰酶+0. 01%EDTA消化成单细胞悬液，用角质细 胞无血清培养基重悬细胞，接种于IV型胶原包被的培养皿中，置5% C02 37 "C培养箱内孵育15min，吸出培养液及未贴壁细胞，用角质细胞专用培养基 继续培养，每54小时半量换液，；
3) 真皮部分以0.125%胰酶消化获取成纤维细胞，放入含10%新生牛血清 H-DMEM培养基培养，每30小时半量换液，；
3、 真皮替代物制备
将第1步所得之复合胶原真皮支架置于12孔嵌入式培养皿上，加入含有10%新生 牛血清的H-DMEM培养基湿润，以最小容量150ul接种第2步3)培养基悬浮的原代 培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1. 5X105cell/cm2，待6小时细胞粘附后，加2ml 含1(F。新生牛血清的H-DMEM培养基浸没培养，每42小时半量换液，培养8天，完成 真皮构建；所说的嵌入式培养皿为millpore公司的millcell，孔径0.4nm，底部支 持膜为透明的聚酯膜，使用前包被浓度为0.4。/。的人源IV型胶原纤维；.
4、 人工皮肤无血清专用培养基配制
商业化购买GIBCO公司DK-SFM (Defined Keratinocyte SFM)角质细胞无血清 培养基，与无菌条件下收集的羊膜分泌液，按体积比8.2: 1.8混合；然后添加5X10-w M霍乱毒素，2. 5 P g/ml氢化可的松、25 u g/ml胰岛素、25 u g/ml转铁蛋白和1 X 10 —1Q M甲状腺素T3、 0. 001ng/mLEGF、腺嘌呤(24.3 ug/mL)等活性成分，配制成人工皮肤无血清专用培养基；
6、器官型全层人工皮肤培养
在生长于嵌入式培养皿上的人工真皮上接种原代人角质细胞，接种细胞密度为1 x 105cell/Cm2;用人工皮肤专用培养基培养代替含血清的H-DMEM培养基，气-液界 面培养，每54小时半量换液，IO天后完成表皮构建；
5、检验
将构建好的组织工程人工皮肤从嵌入式培养皿取下，固定于以PBS配制的4%多聚 甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5.5um，苏木素-伊红(H.E)染色；
去除显微观察下显示皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含 量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱的人工皮肤。显微镜下观察表皮层 含基底层、棘层和角化层三层结构，真皮层含成纤维细胞、胶原纤维排列整齐，表皮 真皮分界明显的人工皮肤。
实施例3
1、制作真皮支架
1) 预先将壳聚糖和6-硫酸软骨素按质量比例7.5: 2.5用普通方式混合，制 备细胞外基质混合物；
2) 无菌条件下，将鼠尾胶原粉末浸泡于-4'C、 0. 1%醋酸溶液中，使牛胶原浓 度为9mg/ral，调节PH值到7. 2制备胶原溶液，操作应在4匸进行；
3) 将预先混合好的细胞外基质混合物与鼠尾胶原按质量比例为2.2: 7.8加 入鼠尾胶原溶液中，制得复合胶原溶液；
4) lnil制备好的复合胶原溶液置于孔径为3.5 cm的圆形模具中，用0. lml
的1.25。/。的戊二醛溶液4'C共价交联24小时，用0. 1mol/L磷酸盐缓冲液
(PBS)漂洗2次，制成海绵状复合胶原基质；5)将复合胶原基质用波长254nm、36W的紫外线照射除菌后放置在-28'C低 温冰箱冷冻过夜18小时，然后再在一5CTC、 1Pa条件下，冻干机真空冷 冻干燥24h，制备复合胶原真皮支架；
2、 人成纤维细胞和角质细胞的制备
1) 将手术环切下的新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0. 1mol/LPBS缓冲液彻 底清洗，无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1.0mmX1.5mm的皮片， 用质量浓度0. 25y。裂解酶(Dispases)4'C过夜冷消化16小时，分离表皮和真 皮，生理盐水或D-Hanks液清洗5次；
2) 表皮部分用质量浓度0. 25%胰酶+0. 01%EDTA消化成单细胞悬液，用角质细 胞无血清培养基重悬细胞，接种于IV型胶原包被的培养皿中，置5% C02 37 'C培养箱内孵育12min，吸出培养液及未贴壁细胞，用角质细胞专用培养基 继续培养，每60小时半量换液，；
3) 真皮部分以0.125%胰酶消化获取成纤维细胞，放入含10%新生牛血清 H-DMEM培养基培养，每36小时半量换液，；
3、 真皮替代物制备
将第1步所得之复合胶原真皮支架置于12孔嵌入式培养皿上，加入含有10%新生 牛血清的H-DMEM培养基湿润，以最小容量100 y 1接种第2步3)培养基悬浮的原代 培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为lX105cell/cm2，待8小时细胞粘附后，加2ml 含10。/。新生牛血清的H-DMEM培养基浸没培养，每48小时半量换液，培养7天，完成 真皮构建；嵌入式培养皿为millpore公司的millcell,孔径0.4um，底部支持膜为 透明的聚酯膜，使用前包被浓度为0.4。/。的人源IV型胶原纤维；
4、 人工皮肤无血清专用培养基配制
购买美国BioWhittaker公司的商业化角质细胞无血清培养基KBM (KeratinocyteBasal Medium),与无菌条件下收集的羊膜分泌液，按体积比8.2: 1.8混合，再此基 础上中添加5X 10 —1Q M霍乱毒素，2. 5 y g/ml氢化可的松、25 y g/ml胰岛素、25 u g/ml 转铁蛋白禾口 1X10 -10 M甲状腺素T3、 0. 001ng/mLEGF、腺嘌呤(24.3 ug/mL)等活性 成分，配制成人工皮肤无血清专用培养基； 6、器官型全层人工皮肤培养
在生长于嵌入式培养皿上的人工真皮上接种原代人角质细胞，接种细胞密度为1 x 105Cell/cm2;用人工皮肤专用培养基培养代替含血清的H-DMEM培养基，气-液界 面培养，每60小时半量换液，7天后完成表皮构建；
5、检验
将构建好的组织工程人工皮肤从嵌入式培养皿取下，固定于以PBS配制的4%多聚 甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5^m，苏木素-伊红(H.E)染色；显微 镜下观察人工皮肤的组织结构，表皮层含基底层、棘层和角化层三层结构；真皮层应 含大量成纤维细胞，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显。此批人工皮肤可用于 毒性检验。
权利要求
1、一种采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法，依次包括以下几个步骤(1)制作由胶原与细胞外基质混合物组成的复合胶原真皮支架1)将壳聚糖与透明质酸、6-硫酸软骨素两者之一或全部混合制备成细胞外基质混合物；采用壳聚糖与透明质酸混合时质量比例为6.5-7.5∶2.5-3.5；采用壳聚糖与6-硫酸软骨素时质量比例为7.0-7.5∶2.5-3.0；采用壳聚糖、透明质酸、6-硫酸软骨素全部混合时质量比例为4.5-5.5∶2.5-3.5∶1.5-2.5；2)在无菌条件下将胶原浸泡于冰冷-4℃、0.1％的醋酸溶液中，胶原浓度为8-10mg/ml范围，调节PH值到7.2-7.3制备胶原溶液，操作应在4℃进行；3)在胶原溶液中加入1)步骤所得的细胞外基质混合物，得到复合胶原溶液，复合胶原溶液中细胞外基质混合物与胶原的质量比例为2-2.5∶7.5-8；4)取1ml制备好的复合胶原溶液置于孔径为3.5cm的圆形模具中或6孔细胞培养板中，用0.1ml的1％-1.5％的戊二醛溶液4℃共价交联24±0.5小时，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2-3次，制成海绵状复合胶原基质；5)将复合胶原基质用波长254nm、36W的紫外线照射除菌后放置在-25℃--30℃低温冰箱冷冻过夜12-18小时，然后再在-50℃--55℃、1Pa条件下，冻干机真空冷冻干燥24±1小时，制备复合胶原真皮支架；(2)原代培养人皮肤成纤维细胞和角质细胞的制备1)将手术环切下的新鲜包皮用含青霉素、链霉素的0.1mol/LPBS缓冲液彻底清洗，无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成约1.0mm×1.5mm的皮片，用质量浓度0.25％裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12-18小时，生理盐水或D-Hanks液清洗；2)表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.01％EDTA消化成单细胞悬液，用角质细胞无血清培养基重悬细胞，接种于IV型胶原包被的培养皿中，置5％CO2 37℃培养箱内孵育10-15min，吸出培养液及未贴壁细胞，用角质细胞无血清培养基继续培养人角质细胞；3)真皮部分以0.125％胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，放入含10％新生牛血清DMEM培养基培养；(3)人工真皮替代物制备将第1步所得之复合胶原真皮支架置于12孔嵌入式培养皿上，加入含有10％新生牛血清的DMEM培养基湿润，以最小容量100-200μl接种第2步3)培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，培养7-10天，完成人工真皮替代物构建；(4)人工皮肤专用培养基制备无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，转移到DMEM液中；在无菌环境下，按培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，使羊膜上皮面向上全铺或半铺布于6孔板的孔底，然后加入角质细胞无血清培养基，收集羊膜分泌液；取角质细胞无血清培养基与人羊膜分泌液按体积比8-8.5∶1.5-2混合，再添加5×10-10M霍乱毒素，2.5μg/ml氢化可的松、25μg/ml胰岛素、25μg/ml转铁蛋白和1×10-10M甲状腺素T3、0.001ng/mL人重组EGF、24.3ug/mL腺嘌呤活性成分，配制成人工皮肤专用培养基；(5)器官型全层人工皮肤制备在第3步所述人工真皮替代物上接种第2步2)原代培养的人角质细胞，接种细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制备的人工皮肤专用培养基代替角质细胞无血清培养基和含10％新生牛血清的DMEM培养基，采用气-液界面培养，8-10天后完成人工皮肤初级产品制备；(6)检测同一批以12孔培养板制备的人工皮肤中，取其中一块人工皮肤从嵌入式培养皿取下，固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm-6μm，苏木素-伊红(H.E)染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层和角化层三层结构；真皮层含大量成纤维细胞，胶原纤维有序列排列，表皮真皮分界明显的人工皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。
2、根据权利要求1所述的采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方 法，其特征是(1) 制作真皮支架1) 壳聚糖与透明质酸、6-硫酸软骨素混合质量比例为5: 3: 2;2) 胶原浓度为10mg/ral范围，调节PH值到7. 2;3) 细胞外基质混合物与胶原的质量比例为2: 8;4) 戊二酸共价交联24小时，漂洗3次，戊二醛浓度为1%_1.5%;5) 紫外线照射除菌后放置在-28t:低温冰箱冷冻过夜15小时，然后再在一52 °C ，冻干机真空冷冻干燥24小时；(2) 原代培养人皮肤成纤维细胞和角质细胞的制备1) 37'C下2小时或4"过夜15小时分离表皮和真皮；2) 用美国BioWhittaker公司的KBM角质细胞无血清培养基；3) 真皮部分以0. 125%胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，放入含10%新生牛血清DMEM培养基培养；(3) 人工真皮替代物制备以容量150 y 1接种人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1. 5X105cell/cm2，培养8天；(4) 人工皮肤专用培养基制备取角质细胞无血清培养基与人羊膜分泌液按体积比8: 2混合；(5) 器官型全层人工皮肤制备接种细胞密度为lxl05Cell/Cni2,气-液界面培养，9天后完成人工皮肤初级产品 制备。
3、 根据权利要求1或2所述的采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤 的方法，其特征是所说的嵌入式培养皿为Corning Costar公司的Transwell或 millpore公司的millcell，孔径0.4nm，底部支持膜为透明的聚酯膜，使用前包被 浓度为0. 4y。的人源IV型胶原纤维。
4、 根据权利要求3所述的采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方 法，其特征是所述的角质细胞无血清培养基SFM-KC为商业化购自美国BioWhiUaker 公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBC0公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
全文摘要
本发明公开了一种采用嵌入式培养法制备毒性检验用器官型人工皮肤的方法，属于一种可以替代活体动物(人体)皮肤用于毒理学试验的领域。它包括真皮支架制备、人成纤维细胞和角质细胞制备、真皮替代物制备、人工皮肤无血清专用培养基配制、器官型全层皮肤培养和人工皮肤毒性检验，制备的人工皮肤重复性好、标准化程度高。通过本发明制备的器官型全层皮肤在解剖和组织结构上更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合皮肤毒性作用的实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品、农药等健康相关产品的皮肤毒性试验。
文档编号A61L27/36GK101318030SQ200810029210
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者红 焦, 瑶 秦, 程树军 申请人:程树军;广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心