专利名称：一种海洋真菌培养物的提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋真菌培养物的提取物及 其制备方法和应用。
背景技术：
寻找生理活性强的物质发展成为抗癌、抗菌、治疗老年痴呆症等药物是人 类攻克疾病的主要工作之一。海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的 研究课题。红树林作为生长在热带和亚热带海湾河口潮间带的生态系统， 一直 处于高盐、频繁的潮汐、强风、高温、强紫外辐射和缺氧污泥的海陆潮间带环 境，其生境非常特殊，这也造就了红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传 背景，研究发现它们许多成分也具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等药用价值。
细胞培养法是筛选抗肿瘤药物比较常用的一种筛选方法，常用的有MTT 法等。而真核生物DNA拓朴异构酶I和II已被确定是多种抗肿瘤药物的有效 靶位。例如，抗癌药物喜树碱(camptothecin)及其衍生物拓扑特肯(topotecan)、 依林诺特肯(irinotecan)的作用靶位是真核生物DNA拓扑异构酶I，吖啶类化合 物(m-AMSA)、鬼臼毒素类化合物(VP-16、 VM-26)、阿霉素(adriamycin)等 则作用于真核生物DNA拓扑异构酶IIa 。但同其它药物一样，长期使用后肿 瘤细胞会出现对它们的耐药性。
因此开发新的，特别是结构新颖的，以真核生物DNA拓扑异构酶为靶位 的抗肿瘤药物具有重要的意义。我们课题组使用在毕赤酵母中表达的hTopo I， 建立了以该酶为靶位的抗肿瘤化合物的体外快速筛选模型，已经对一些天然产
物进行了筛选，取得了较好的结果。
二十世纪初抗生素的发现堪称为医药技术发展史上重大里程碑之一。其意
义远远超过其它药物(如阿司匹林等)的发明。1929年，英国细菌学家弗莱明在
其实验室中发现点青霉(一种霉菌)分泌的一种未知物质(g卩"青霉素")具有强
力抑菌作用。至四十年代末，美国科学家攻克了青霉素大规模生产的技术难题 (发酵罐深层通气培养法)从而奠定了抗生素工业的基础。在此后几十年里，抗 生素已发展成为几大系列上百个品种的重要临床药物。近几年来细菌耐药现象 己成为各国医疗界所面临的一严重问题，现在发病者众多的流感杆菌引发的肺 炎与支气管炎等常见病已无良药可治。如何对付越来越普遍的耐药细菌已成为 国际医学界所面临的一棘手难题。
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD,又称早老性痴呆，主要病理特征 是大脑萎缩，脑组织内产生a e蛋白沉淀物和神经原纤维缠结，导致乙酰胆 碱分泌不足)。而乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE, EC3 .1 .1 .7.)主要
的生物学功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱(ACh)， 从而中止神经冲动的传递。至今，治疗AD最有效的方法仍然是应用AChE抑 制剂。在大规模、多中心、双盲和安慰剂对照试验中，这类化合物对AD病人 认知能力的心理测验及生活质量均有统计学上的显著改善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋真菌培养物的提取物，该提取物同时具有 抑菌、酶抑制、抗肿瘤活性等。
本发明的另一个目的在于提供上述海洋真菌培养物的提取物的制备方法。 本发明的另一个目的在于提供上述海洋真菌培养物的提取物在制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤药物中的应用。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的
本发明所用的海洋真菌是南海红树林内生真菌FM^riwm sp. ZH116，该真 菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学)，保藏编号 为CCTCC M 208095，保藏日为2008年6月20日。该真菌以下简称海洋真菌 CCTCCM 208095。
本发明的海洋真菌培养物的提取物，是海洋真菌CCTCC M208095培养物 的乙酸乙酯提取物中的油状物。
本发明的海洋真菌培养物的提取物是从海洋真菌CCTCC M20809的培养
物(发酵液)的乙酸乙酯萃取液中浓縮得到，其具体的制备方法包括以下步骤
a. 海洋真菌CCTCC M 208095的种子培养
挑取海洋真菌CCTCC M 208095菌株接入斜面培养基，30 35i:培养5~7
天；
b. 海洋真菌CCTCCM 208095的发酵培养
挑取上述斜面中培养好的菌株接入发酵培养基，于25 35"C静置培养1~2
月；
c. 将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d. 将上述过滤后的发酵液，用乙酸乙酯萃取后合并上层萃取液，浓縮挥 干制得的油状物即为海洋真菌CCTCC M 208095培养物的提取物。
上述种子培养时所用的培养基按重量份数，包含如下组份葡萄糖 0.5~1.5，酵母提取物0.05^0.15，蛋白胨0.1~0.3，琼脂1~1.5，氯化钠3~5，水 100。将该培养基制成试管斜面，即为斜面培养基。
上述发酵培养基按重量份数，包含如下组份葡萄糖0.5~1.5，酵母提取
物0.05~0.15，蛋白胨0.1~0.3，粗海盐1.5，水IOO。
实验证明，本发明的提取物具有抗病源细菌、抑制乙酰胆碱酯酶、抑制拓 朴异构酶I 、抗口腔癌细胞KB及其耐药株KBv200的活性。具体效果可达到 对大肠杆菌、绿脓杆菌、八叠球菌、铜绿假单孢菌、蜡状芽孢菌、白色葡萄球 菌6种菌的最小抑制浓度均小于l|ig/mL，对乙酰胆碱酯酶的抑制浓度IC50 为2.5jig/mL， 0.5ng/mL的提取物对hTopo I具有强烈的松弛活性,对KB和 KBv200细胞株的IC50为远小于11jig/mL。
与现有技术相比，本发明的优点是，本发明的提取物同时具有抑菌、乙酰 胆碱酯酶酶抑制、拓朴异构酶I抑制和抗肿瘤活性，且作用效果显著，可以用 于制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤的药物。
具体实施例方式
"F面结合实施例对本发明作进一步说明。 实施例1制备海洋真菌ZH116培养物的提取物
a. 真菌ZH116的种子培养
培养基(按重量份数)葡萄糖l，酵母提取物O.l，蛋白胨0.2，琼脂l，
氯化钠3，水100;
将上述培养基制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，3(TC培养7天；
b. 真菌ZH116的发酵培养
发酵培养基称取葡萄糖lg，酵母提取物0.1g，蛋白胨0.2g和粗海盐3g，
加入1L水混匀；
将上述斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25。C静置培养1月
c. 将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；
d. 将上述过滤后的发酵液，用乙酸乙酯萃取多次，收集上层萃取液，浓缩 挥干制得的油状物即为海洋真菌ZH116培养物的提取物20mg。
'实施例2提取物的抗菌、抑酶和抗肿瘤活性试验
1. 抗菌试验
将实施例1得到的提取物用二甲基亚砜DMSO溶解至1000昭/mL后进行 系列浓度稀释，在96孔板中，每孔加入190^1细菌悬液(OD600为0.6)，然 后加入前述不同浓度的提取液10nl，重复三次，空白对照加入10jiLDMSO， 阳性对照为氨苄西林钠溶液。37°C，培养16小时后，测定OD600。同时也目
最小抑制浓度为细菌几乎没有生长的浓度。
测定得到真菌ZH116培养物的提取物对6种不同的病源细菌的最小抑制 浓度均小于l|ig/mL。
2. 乙酰胆碱酯酶抑制活性
将实施例1得到的提取物用DMSO溶解稀释至100吗/mL，取6支1.5ml 装有840(iL0.1 MpH^8.0的磷酸盐缓冲溶液的梨型管，依次加入O， 5， 10， 20， 40， 50,uL的提取物溶液(100|ig/mL)，用DMSO补齐至50jJL，加入50& 4mg/ml 5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液和IO^iL乙酰胆碱酯酶溶液，在37 'C保温15min后，立即加入50,uL 2mg/ml硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在 412nm处吸光度。
参比用950nL0.1MpH=8.0的磷酸盐缓冲溶液和50nLDMSO。 以酶的相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得提取物的IC50为
3. DNA拓扑异构酶I (hTopo I )松弛活性抑制实验 本实施例中，各溶液配方为
反应缓冲液175mM Tris.HCl (pH7.5)， 250 mM KCl， 25 mM MgCl2， 5 mM DTT， 10 mM亚精胺，0.5mMEDTA， 250 pg/mL BSA。
反应终止液SDS3%， 60mMEDTA，甘油50%，溴酚兰0.25%，所述各 百分比为占反应终止液总质量的百分比，如SDS 3%意思为100克反应液中含 SDS3克。
将实施例l得到的提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解稀释至1000pg/mL， 在共20)jL hTopo I样品反应体系中，加有4nL反应缓冲液，0.5pg负超螺旋 pBR322、 1U的hTopoI及0.5nL测试样品。
同时做空白对照，阴性对照、阳性对照以及DMSO溶剂对照。 在共20pL空白对照体系中，仅加入4(iL上述反应缓冲液，0.5pg负超螺旋 pBR322。
在共20pL阴性对照体系中，仅加入4pL反应缓冲液，0.5昭负超螺旋 pBR322， 1U的hTopo I 。
在共20iiL阳性对照体系中，加入4)iL反应缓冲液，0.5iig负超螺旋pBR322， 1U的hTopo1以及0.5jiL2mM的喜树碱溶液。
在共20pL的DMSO对照体系中，加入4(iL反应缓冲液，0.5吗负超螺旋 pBR322， 1U的hTopo I以及0.5pLDMSO。
所有的反应体系都是用ddH2O补足20nL。
加样完成后，在37"C下恒温水浴反应30min，加入4pLhTopo I反应终止液。
使用1%琼脂糖(含0.01XEB)(均为质量百分比，即配100ml的胶液， 含琼脂糖1克，EB为0.01克)，在0.5XTBE电泳缓冲液中用约5V/cm电压 于室温电泳50min。电泳完毕，用genegenius全自动凝胶成像分析系统分析测
试结果。
结果表明，终浓度为25昭/mL (1000(ig/mL是原始溶液浓度，取在 20pl反应体系中，所以终浓度就成为25ng/mL)的提取物对hTopo I具有强烈 的松弛活性。
4.体外细胞毒测定(MTT法)
收集对数生长期的人口腔癌细胞株KB及其耐药株KBv200，接种于96孔 板，每孔190 n 1 (约1 X 104个细臌孔)，24小时后加入不同浓度药物10 u 1， 每一浓度3个重复孔。培养68小时后加入MTT 10lil (浓度为5mg/ml)。继 续培养4小时后弃上清> 每孔加入DMSO 100ul后用酶联免疫检测仪测定 492nm处吸光度OD值，用Bliss's software通过细胞毒曲线来计算细胞生长 50呢的抑制率(IC50)。测定计算结果表明提取物对KB和KBv200细胞株的IC50 为远小于11jig/mL。
权利要求
1、南海红树林内生真菌ZH116，该海洋真菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 208095，保藏日为2008年6月20日。
2、 一种海洋真菌培养物的提取物，其特征在于该提取物是从海洋真菌 CCTCC M 208095的培养发酵液的乙酸乙酯萃取液中浓縮得到的油状物。
3、 权利要求2所述海洋真菌培养物的提取物的制备方法，其特征在于该 方法包括如下步骤a. 海洋真菌CCTCC M 208095的种子培养挑取海洋真菌CCTCC M 208095菌株接入斜面培养基，30 35"C培养5~7天；b. 海洋真菌CCTCC M 208095的发酵培养挑取上述斜面中培养好的菌株接入发酵培养基，25 35'C静置培养1~2月；c. 将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d. 将上述过滤后的发酵液，用乙酸乙酯萃取后收集上层萃取液，浓縮挥 干制得的油状物即为海洋真菌CCTCC M 208095培养物的提取物。
4、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述斜面培养基按重量 份数，包含如下组份葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05~0.15，蛋白胨0.1~0.3， 琼脂1~1.5，氯化钠3~5，水IOO。
5、 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述发酵培养基按重量 份数，包含如下组份葡萄糖0.5~1.5，酵母提取物0.05~0.15，蛋白胨0.1~0.3， 粗海盐1.5,水IOO。
6、 权利要求2所述提取物在制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开一种海洋真菌培养物的提取物及其制备方法和应用，该提取物是将海洋真菌CCTCC M 208095经过种子培养，发酵培养后，收集培养发酵液，将发酵液经乙酸乙酯萃取后，浓缩挥干后制的油状物。本发明的提取物具有抗病源细菌、抑制乙酰胆碱酯酶、抑制拓朴异构酶I、抗口腔癌细胞KB及其耐药株KBv200的活性，可以用手制备抗菌、治疗老年痴呆、抗肿瘤的药物。
文档编号A61K36/06GK101386818SQ20081002982
公开日2009年3月18日 申请日期2008年7月29日 优先权日2008年7月29日
发明者佘志刚, 庆 李, 林永成, 蔡小玲, 高俊平 申请人:中山大学