专利名称：一种靶向杀伤肿瘤细胞的复合物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及了纳米技术和生命科学领域，特别提供了一种靶向杀伤肿瘤细胞 的复合物、制备方法和应用。
背景技术：
由于细胞膜的选择透过性，很多生物分子特别是蛋白质一类的大分子就不 能主动穿过细胞膜，因此寻找新的生物大分子载体是药物输送、基因和蛋白治疗 领域的迫切需要。碳纳米管以其综合的优异性能，已经向人们展示了巨大的应用价值。近年 来，碳纳米管的生物分子功能化给碳纳米管进一步应用于活的生物体系提供了契 机。目前，以生物学应用为目的的探索研究正在迅速增多，逐渐成为一个新的研 究热点。2003年法国科学家Pantarotto (Pantarotto D, Briand J, Prato M, Bianco A. Chem Commun, 2004, 1(1): 16-17)利用共聚焦荧光显微镜发现荧光标记的单壁碳 纳米管(SWNT)本身能够进入细胞质和细胞核，在SWNT的浓度低于10 时， 碳纳米管本身对细胞不会产生明显的毒性作用。同时，他们还将SWNT共价结 合上小肽段，发现SWNT能将小肽段输送进细胞。随后，Dai等人(KamNWS, Dai H. J Am Chem Soe, 2005, 127(16): 6021-6026; Kam NWS, Jessop T C, Wender P A, Dai H. J Am Chem Soc, 2004, 126(22): 6850-6851)的研究表明SWNT可携带 分子量小于等于80 kDa的众多蛋白质进入动物的哺乳细胞，如BSA, Streptavidin及细胞色素C等。最近国内也有专利发明将反义寡聚核苷酸组装到 多壁碳纳米管上制成药物载体(专利申请号200710037582.0，公开号 CN101015696)。毒素蛋白应用于临床肿瘤治疗的研究由来己久。早在1970年Lin (LinJ Y, Tserng K Y, Chen C C, Tung T C. Nature, 1970, 227: 292-293)等发现从蓖麻籽中提取的毒蛋白(Ricin)具有很强的抗肿瘤作用，他们通过在小鼠腹腔注射高剂量 的Ricin，达到5天后治愈小鼠腹水瘤的效果。Ricin是核糖体失活蛋白的一种， 由通过一个二硫键相连的A链(RTA)与B链(RTB)组成，其中RTA是毒性链，能 使核糖体60S大亚基失活，抑制细胞内蛋白质合成，最终导致细胞死亡。而 RTB是运载体，能与细胞膜表面结合位点结合，介导A链经逆分泌途径进入细 胞质到达内质网，并在此发生二硫键断裂使两条链分离，使A链重新折叠为活 性状态。天然的Ricin由于RTA和RTB结合在一起，毒性相当大，只要1毫 克的蓖麻毒素就足以毒死一个成年人，胞质内只要进入几个蓖麻毒素分子就足以 杀死细胞，如此高的毒性限制了人们对蓖麻毒素的使用。随着基因工程技术的发 展，人们根据其毒性作用机理，进行了很多不同方法的尝试。国内专利(专利申 请号200410018033.5，公开号CN1569234)报道利用基因重组技术在肿瘤细 胞中特异性表达蓖麻毒素B链蛋白，同时纯化蓖麻毒素A链，然后将RTA静 脉注射，从而在肿瘤组织中形成有活性的毒素，杀伤肿瘤细胞。发明内容本发明的目的是提供一种可用于靶向杀伤乳腺癌肿瘤细胞的纳米复合物。 本发明的另一个目的是提供上述纳米复合物的制备方法。本发明提供了一种耙向杀伤肿瘤细胞的纳米复合物，该纳米复合物由长度5 nm lpm的碳纳米管、蓖麻毒素蛋白A链和抗HER-2靶向蛋白组成，碳纳米短 管分别和蓖麻毒素蛋白A链及抗HER-2靶向蛋白相连。本发明选择蓖麻毒素的功能链——A链作为杀伤肿瘤细胞的元件。蓖麻毒 素(蓖麻毒素蛋白的NCBI登陆号P02879)是核糖体失活蛋白的一种，由通过 一个二硫键相连的A链(RTA)与B链(RTB)组成，其中RTA是毒性链，RTB是 携带A链进入细胞，本身无毒性。本发明中纯净的RTA由基因工程技术得到(专 利申请号200410018033.5，公开号CN1569234)。人类表皮生长因子受体2(Her-2)人类表皮生长因子受体2(Her-2)是一种 已知的癌基因，它的过表达使25%的乳腺癌患者的肿瘤发生转移。抗HER-2耙 向蛋白(曲妥珠单抗，anti-HER-2)是一类能与肿瘤细胞表面分子特异作用的物质，能识别肿瘤相关抗原和细胞表面的特异性抗原的单克隆抗体或肿瘤细胞表面 大量存在的细胞因子的配体。抗HER-2靶向蛋白可以通过常规的单抗制备方法 获得，也可以从sigma公司购买。本发明用基因工程技术得到纯净的RTA (专利申请号200410018033.5，公 开号CN1569234)，然后利用截断的、生物毒性小的碳纳米管和RTA制成 MWNT-RTA，借助碳纳米管替代B链将RTA链携带进细胞，避免了表达B链的 繁琐，节约了成本。在发现碳纳米管能携带RTA进入细胞，并能高度保持毒素 蛋白的生物活性，光谱地引起诸多细胞系的杀伤后，本发明还采用能选择性作用 于肿瘤细胞的靶向抗体曲妥珠单抗(anti-HER-2)作为靶向试剂，将它和 MWNT-RTA共同制成MWNT-RTA- anti-HER-2纳米复合物，由于HER-2抗体选 择性作用于人乳腺癌表面高度的HER-2受体，具有高度亲和力，具有高度靶向 性，因此其只对癌细胞起作用，而对正常细胞的作用较小。研究表明，曲妥珠单 抗治疗乳腺癌的作用机理主要是通过与HER-2受体特异性结合，影响生长信号 的传递。另一方面，本发明提供了上述复合物的制备方法，该方法具体依次包括以 下步骤(1) 将碳纳米管纯化并截断为长度5nm lpm的短管；(2) 在步骤(1)所得的碳纳米管的分散液里加入蓖麻毒素蛋白A链和抗 HER-2靶向蛋白，三者搅拌结合成复合物即可；混合液中碳纳米管的浓度范围为 0. 006 0. lmg/mL，蓖麻毒素蛋白A链的浓度为0.05 1.0陶ol /L，抗HER-2 靶向蛋白的浓度范围为0.25 2.0 Mmol /L。本发明的制备方法的步骤(1)中，碳纳米管可以通过混酸超声方法进行截断。本发明的制备方法的步骤(1)中，碳纳米管可以置于浓硝酸和浓硫酸的混 合液中进行超声截断其中浓硝酸和浓硫酸的体积比为(0.5-1.5): (2-4)。本发明的制备方法的步骤(1)中，碳纳米管可以置于硝酸和硫酸的混合液 中进行超声截断，超声频率为40—80KHz (千赫兹)，超声时间为7—9小时。本发明的制备方法的步骤(2)中，碳纳米管的分散液是步骤(1)所得的碳纳米管分散在磷酸盐缓冲液(例如，培养细胞常用的PBS)中所得液体。本发明的制备方法的步骤(2)中，碳纳米管、蓖麻毒素蛋白A链和抗HER-2 靶向蛋白可以通过冰浴搅拌混合的方式结合。本发明中，碳纳米管为单壁碳纳米管或者多壁碳纳米管。 所述碳纳米管可以是商品化的单壁碳纳米管(SWNT)或者多壁碳纳米管 (MWNT)，如深圳市纳米港有限公司生产的比表面积大于600平方米/克的单壁 碳纳米管或比表面积为40 — 300平方米/克的多壁碳纳米管。由于SWNT研究的 相对较多，本发明中，碳纳米管采用MWNT作为研究对象。本发明中，可采用 常规方法纯化碳纳米管，例如用浓HN03回流纯化，以除去杂质。本发明选用碳纳米管作为复合物出入细胞的载体，截断的碳纳米管具有众多 优点良好的水相分散能力；巨大的比表面积对蛋白有较大的负载量；可根据需 要对碳纳米管表面功能化；具有良好的生物相容性，对生物体系毒性小。本发明还提供了所述复合物的应用，即将该复合物用于杀伤肿瘤细胞。 例如，将上述带有功能蛋白的碳纳米管复合物加入到对数生长期的 MDA-MB-453细胞中(人乳腺癌细胞，购自上海中科院细胞库，细胞编号TCHu 35),继续培养22小时，用流式细胞仪检测此复合物对乳腺癌细胞及正常细胞的 杀伤比，发现其对癌细胞和正常细胞的杀伤比例为2:1。本发明采用碳纳米管作为杀伤细胞的RTA链的运载体，使RTA保持了高度 的生物活性，利用这种简单、有效地方法将毒素蛋白的"弹头"携带进细胞还是 首次。本发明避免了毒素蛋白自身载体(RTB)表达过程中的繁琐及高成本，提 供了毒素蛋白应用的新思路。另外，通过碳纳米管上结合HER-2抗体，实现了 选择性地高比例杀伤人乳腺癌细胞而对正常细胞杀伤较小的设想，为耙向肿瘤杀 伤提供了新方法。此处所发明的基于羧基化的多壁碳纳米管的运载体系可望给药 物输送及癌症靶向治疗提供新的依据。
下面附图对本发明作进一步描述，但并非对本发明作限定。图1为碳纳米管一RTA—anti-HER-2复合物作用于乳腺癌细胞的流式细胞 仪检测图。横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数量。图2为碳纳米管一RTA—anti-HER-2复合物作用于CHO正常细胞的流式细 胞仪检测图。横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数量。与图1相比，说明碳纳米 管一RTA—anti-HER-2复合物能杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损害较小。图3为不同物质孵育后，Hela， HL7702， COS7， Mcf7细胞的死亡率流式细 胞仪结果图。对于同种细胞株，各柱从左至右依次代表:空细胞，孵育了单独的 MWNT，孵育了单独的RTA，孵育了 MWNT-RTA的细胞。图4不同孵育物对人乳腺癌细胞MDA-MB-453及正常细胞CHO杀伤的流 式检测图。其中各柱值代表以下物质孵育后的细胞死亡率l空白细胞；2单独 的MWNT; 3单独的RTA; 4单独的anti—HER-2蛋白；5 RTA—anti—HER-2 复合物；6 MWNT—anti—HER-2复合物；7 MWNT—RTA复合物；8 MWNT— RTA—anti—HER-2复合物。
具体实施方式
下面结合具体实施例子对本发明作进一步阐述，这些实施实例仅用于说明本 发明，并非限定本发明的范围。实施例一 MWNT-RTA复合物的制备(1) MWNT的纯化取1 g MWNT置于圆底烧瓶中，加入16 ml浓HN03，油浴140 °C回流4 小时，离心分离，弃去上层液，重复洗涤离心至上层清液pH 6为止，用孔径 为0.45 pm的微孔滤膜过滤，得到黑色固体。(2) 截断MWNT的制备纯化过的MWNT进一步在体积比为3: 1的浓硫酸和浓硝酸中40 。C下超声 8小时截断碳管，使管的两端及部分管壁出现大量羧基。截断的碳管分散液用直 径为0.45pm的微孔滤膜抽滤，用大量的蒸馏水洗涤至滤液接近中性为止，然后 得到的滤液以9000 rpm离心10 min以除去溶液中的大颗粒碳管，这样可得到黑 色均一的MWNT水相分散液，最后将此分散液红外灯下烘干，用PBS重新超声 分散得到浓度约为0.1mg/mLMWNT分散液。(3) MWNT—RTA的制备 250 M簡T (0.05 mg/mL)禾B 50 pL RTA (2 (aM)加到200 |iL PBS (pH=7.4)里，冰浴搅拌2-3小时，这时毒素蛋白即可由于静电、疏水及其他弱 相互作用吸附在碳纳米管表面。实施例二 MWNT-RTA复合物对众多细胞系的广谱杀伤作用(1) 细胞的培养本发明中所用细胞都由复旦大学生命科学学院钟江教授实验室保存，其中人 肝细胞HL7702,人宫颈癌Hela细胞，和非洲绿猴肾细胞COS-7所用培养液 为体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640;人乳腺癌细胞MCF-7用含体积分 数为10%的胎牛血清和1%的青霉素一链霉素的DMEM培养液。所用细胞在 37 °C体积分数为5%C02的饱和湿度培养箱中培养，实验选用对数生长期细 胞。(2) 细胞死亡率的测定将150 制成的MWNT-RTA复合物加到上述细胞中，继续培养22小 时。将培养好的细胞移去培养液，胰酶室温消化，碘化丙啶(PI， 50pg/mL)避光 染色后，迅速用流式细胞仪检测。检测得到的数值是代表所测定细胞里的死细胞 的比例，PI的激发波长是488 nm，检测波长是620 nm。所有实验均选用空白 细胞，单独与MWNT孵育的细胞及单独与RTA孵育的细胞作为对照实验。如图 3所示，对所有考察的细胞株而言，MWNT-RTA复合物孵育过的细胞的死亡率 都明显大于各对照组的实验结果。此结果表明，MWNT是一种广谱的、新颖的、 有效的携带毒素蛋白RTA进入细胞的载体，同时还可以高强度地保持毒素蛋白 的生物活性。实施例三MWNT-RTA_anti-HER-2复合物对人乳腺癌细胞MDA-MB-453 的靶向杀伤作用250 nL MWNT (0.05 mg/mL) 、 50 RTA (2 pM)及50 anti-HER-2蛋白 (1 nM)加到150pLPBS(pH=7.4)里，冰浴搅拌2-3小时，这时毒素蛋白和靶向 蛋白即可因静电、疏水及其他弱相互作用吸附在碳纳米管表面。人乳腺癌细胞MDA-MB-453及中国仓鼠卵巢细胞CHO的培养液都是 DMEM培养液。各将150pL制成的MWNT—RTA—anti-HER-2复合物分别加 到乳腺癌细胞和正常细胞中，继续培养22小时。将培养好的细胞按照实施例2 (2)的方法迅速用流式细胞仪检测。图4中的柱7是MWNT-RTA引起的两株 细胞的死亡数据，其中癌细胞和正常细胞的死亡率的比值为1:1 ，而MWNT-RTA-anti-HER-2 (柱8)对这两株细胞的杀伤比为2:1，即MWNT-RTA结合上HER-2抗 体这一靶向分子，可以更高比例地杀伤癌细胞，有更好的选择性。
权利要求
1.一种靶向杀伤肿瘤细胞的纳米复合物，其特长在于，该纳米复合物由长度5nm～1μm的碳纳米管、蓖麻毒素蛋白A链和抗HER-2靶向蛋白组成，碳纳米短管上分别吸附着蓖麻毒素蛋白A链及抗HER-2靶向蛋白。
2. 如权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤(1) 将碳纳米管纯化并截断为长度5 nm l陶的短管；(2) 在步骤(1 )所得的碳纳米管的分散液里加入蓖麻毒素蛋白A链和抗HER-2 耙向蛋白，三者搅拌结合成复合物即可；混合液中碳纳米管的浓度范围为0.006 0. lmg/mL，蓖麻毒素蛋白A链的浓度为0. 05 1. 0 Wnol /L，抗HER-2靶向蛋白的 浓度范围为0. 25 2.0陶ol /L。
3. 如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)中，碳纳米管通过混酸超 声方法进行截断。
4. 如权利要求3所述方法，其特征在于，碳纳米管置于浓硝酸和浓硫酸的混 合液中进行超声截断，其中浓硝酸和浓硫酸的体积比为0.5-1.5: 2-4。
5. 如权利要求3所述方法，其特征在于，碳纳米管置于浓硝酸和浓硫酸的混 合液中进行超声截断，超声频率为40-80K赫兹，超声时间为7-9小时。
6. 如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)中，碳纳米管的分散液是 步骤(1)所得的碳纳米管分散在磷酸盐缓冲液中所得液体。
7. 如权利要求2所述方法，其特征在于，碳纳米管为单壁碳纳米管或者多壁 碳纳米管。
8. 如权利要求1所述复合物在制备杀伤肿瘤细胞的药剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及了纳米技术和生命科学领域，特别提供了一种靶向杀伤肿瘤细胞的复合物、制备方法和应用。本发明提供了一种靶向杀伤肿瘤细胞的纳米复合物，该纳米复合物由长度50nm～1μm以下的碳纳米管、蓖麻毒素蛋白A链和抗HFR-2靶向蛋白组成，碳纳米短管分别和蓖麻毒素蛋白A链、抗HER-2靶向蛋白相联。将此复合物分别作用于人乳腺癌细胞和正常细胞，发现此复合物对癌细胞具有更高的杀伤率。本发明的制备方法简单，制备的复合物具有良好的生物相容性，对肿瘤细胞具有较好的靶向性，为肿瘤的靶向杀伤临床研究提供了新思路。
文档编号A61K38/16GK101239180SQ200810034329
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月6日 优先权日2008年3月6日
发明者余绍宁, 孔继烈, 王美艳, 翁雪香, 晶 葛 申请人:复旦大学