专利名称：东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒素Martentoxin的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及东亚钳蝎(5"Aw Karsch)毒素
Martentoxin的应用。
背景技术：
电压依赖的大电导钙激活的钾离子通道(也就是常常提到的BK通道)代表着一类 可以偶联细胞内化学信号到电信号的独特的离子通道(McManus, 1991) 。 BK通道已经 证实可以调节神经元的放电(MacDermott, A. B.， and F. F. Weight. A^we (Xom^ 300: 185—188, 1982; Robitaille， R., and M. P. Charlton. / iVewmyc/. 12: 297—305, 1992; Robitaille: R.et al. TVewro". 11: 645~655， 1993; Golding, N. L.et al. J A^wo化/. 19: 8789—8798, 1999; Poolos， N. P., and D. Johnston. J W缀節'.19: 5205—5212, 1999)，内分泌细胞的分泌
(Marty, A. r腦cfe iVe腳s"'. 12: 420424， 1989; Lingle, C. J. et al. /o" Cto""^ 4: 261-301, 1996)，平滑肌的收縮(Nelson, M. T., and J. M. Quayle.力附. /尸/zjwW. 268: C799-C822, 1995; Brenner， R. et al. J所o/. C/ze附.275: 6453—6461, 2000),先天免疫
(Jatinder Ahluwalia et al. iVafwe. 427: 853-858, 2004)。
构成孔区的a亚基(Sloa)的四聚体可以形成有功能的电压、钙离子依赖的BK通 道(Shen,K.Z.etal.尸y7"eger^/r/7. 426: 440-445， 1994)。它们和电压门控钾离子通道的 a亚基有很高的同源性，不同的是它们有额外的疏水片断(总共是S0到S10片断)导 致一个胞外N-末端和一个长的、至少有一个调节钙离子结合的区域的细胞质C-末端
(Schreiber, M., and L. Salkoff, 5/—乂 73:1355-1363, 1997)。虽然Slo相关基因的选 择性剪切造成通道具有不同的激活和磷酸化作用的性质(Shipston, M. J. 7>ewA Ce〃 5/o/. 11:353-358,2001; J.D. Lippiat， et al. /Me5io/. 192:141-148,2003)，但是辅助亚 基(3的组织特异性表达也是形成许多细胞类型主要差异的原因。卩亚基具有2个跨膜片 断，通过一个大约120个残基的胞外环连接起来。目前已经克隆了(31、 p2、 P3、 P4四 种P亚基。由a亚基和p4亚基构成的BK通道广泛地分布于神经组织中。辅助亚基|34 和a亚基异源共表达赋予一些不同于其他BK通道亚型的性质，包括非常缓慢的门控动 力学和对IbTX和ChTX的阻抗(Thomas M.et al. ■/ A^wro c/. 20:3563-3570, 2000; Pratap,M.， W. Martin, and T. Ligia.尸rac. Ato/. v4cad 97: 5562—5567, 2000)。特别地，由
于缺乏这个BK通道亚型(a+|34)的特异工具药导致这个通道在大脑和神经组织中的详 细作用仍然是未知的。
通常，神经毒素由于其药理学的高度特异性被视为研究通道的最佳工具。根据报导 (Pratap， M. et al. Proc. A^/.爿cad 5W.97: 5562-5567, 2000; Jesus, G.V. et al. F五5S
505:369-373, 2001; Ha, T.S. et al.所op/^86: 2871-2882， 2004),神经元p4亚基可 以调节BK通道电压依赖性，激活动力学和毒素敏感性。应用于BK通道研究的经典神 经毒素如IbTX、 Chtx和Slotx等虽然对a亚基单独构成的BK通道具高度选择性，但均缺 少对BK通道(a+卩4)的药理选择性。因此，应用药理学方法研究特异性分布于神经 系统、特别是脑区域的BK通道(a+(34)生理功能极其困难。
从东亚钳蝎(5似/ms wartm /Karsch)粗毒中纯化得到的Martentoxin是一个由37 个氨基酸构成的毒素(Yong-Hua Ji. et al.iVraroc/^w. 84: 325-335, 2003)。最初的研 究表明100nM的Martentoxin可以强烈地抑制在肾上腺髓质嗜铬细胞上的BK电流，而 且被Martentoxin抑制的BK电流完全恢复要比从ChTX中恢复快得多(Yong-Hua Ji. et al. J 7Vewrac/^肌84: 325-335, 2003)。随后，其它电生理学研究(Cao, Z. Y. et al. /i " 62: 252—259， 2003; Li, M. H.et al.勿a尸W匿o/. 24: 1016-1020, 2003)显示 Martentoxin要在微摩尔级水平才能抑制在大鼠海马神经元上的延迟整流钾电流(IK)。 这些结果证明Martentoxin对BK通道的选择优于其他电压门控钾通道(有103倍差别)。
目前，认为在海马神经元和肾上腺髓质嗜铬细胞上的BK通道是非常复杂的。在这 些细胞上，a亚基的选择性剪切和不同的卩亚基构成了BK通道。然而缺乏BK通道(a+p4) 特异的工具药导致在大脑中这类BK通道的功能不是了解得很清楚。因此，开拓对不同 通道亚型具有特异选择性作用的配体/调制剂，不仅有利于各亚型生理功能的阐明与药理 价值的评估，同时也为BK通道关联的临床疾病治疗药物提供理论的可行性和新分子先 导物。
发明内容
本申请的发明人通过研究发现，东亚钳蝎(5wAm Karsch)毒素Martentoxin
对于a和卩4亚基共表达所产成的BK通道亚型(a+(34)具有特异选择性的抑制作用， 因此可用于特异性调节BK通道亚型(a+p4)。
因此，本发明的目的就在于提供一种东亚钳蝎(SW/n^ waWera/ Karsch)毒素 Martentoxin用作BK通道亚型(a+p4)的特异性抑制剂的应用。本发明的另一个目的在于提供一种东亚钳蝎(Sw/z^ Karsch)毒素
Martentoxin用于增强现有肽类BK通道配体，包括IbTX和ChTX，对于BK通道亚型 (a+P4)的抑制作用。
本发明的另一个目的在于提供一种东亚钳蝎(Swr/z^ Karsch)毒素
Martentoxin用作BK通道亚型(a+(34)的工具药。
根据本发明的一个实施例，东亚钳蝎(j5^/n^maWms/Karsch)毒素Martentoxin对 于BK通道亚型(a+P4)具有很好的抑制效应，且Martentoxin抑制BK通道亚型(a+p4) 活性的量效曲线显示Martentoxin阻断BK通道的半数抑制浓度(IC5o)约为78.01nM， 并提示BK通道亚型(a+p4)上有两个作用位点与Martentoxin结合。
根据本发明的另一个实施例，Martentoxin对于BK通道亚型(a)的抑制作用很小。
根据本发明的另一个实施例，Martentoxin可以增强IbTX对BK通道亚型(a+p4) 的抑制效应，提示BK通道亚型(a+(34)上两个作用位点中有一个可起调节性作用，另 一个直接参与毒素对通道的阻断。
根据本发明的另一个实施例，Martentoxin对于BK通道亚型(a+p4)活性的调制 作用具有钙离子浓度依赖性。
根据本发明的另一个实施例，Martentoxin可以仅通过抑制BK通道亚型(a+(34)的 活性增强大鼠脑部自发性放电。
根据本发明的另一个实施例，Martentoxin可以作用于齿状回颗粒细胞上的BK通道 亚型(a+p4)，从而增强大鼠海马齿状回颗粒细胞的诱发性放电。
在己经发现的毒素中，Martentoxin是唯一可以抑制BK通道亚型(a+p4)活性的 神经毒素，由于其对于BK通道亚型(a+p4)的选择性较强，而对BK通道亚型(a) 的选择性较弱，因此可以用作BK通道亚型(a+p4)的特异性调节剂，以弥补其它作用 于BK通道亚型的神经毒素如IbTX和Chtx的功效。
此外，由于Martentoxin与相关BK通道亚型相互作用的模式均有别于传统的钾通 道毒素与钾通道相互作用的两种模式，即毒素通过堵塞钾通道孔区阻断通道或毒素通过 与钾通道电压感受器的作用影响钾通道活性，这一结果提示BK通道上存在药物作用的 新耙点，且Martentoxin对BK通道亚型的差异性药理效应，表明其有望成为治疗BK通 道亚型相关疾病的候选药物。
图1为Martentoxin对BK通道(a+(34)电流的抑制图，其中A是在holding电位为-70mV，含有500nM自由内转的条件下，表达有BK通道(a+(34)的HEK293细胞于 十60mV刺激下分别施加400nM Martentoxin (Marten)和400nM iberiotoxin (IbTX)的 全细胞电流示意图；B是400nM Martentoxin作用于BK通道(a+(34)的电流-时间图； C是Martentoxin对BK通道(a+|34)活性抑制的量效曲线图。
图2为Martentoxin对BK通道亚型(a)的低选择性图，其中A是在holding电位 为-70mV，含有500nM自由内钙的条件下，表达有BK通道(a)的HEK293细胞于+80mV 刺激下分别施加400nM Martentoxin禾B 400nM iberiotoxin的全细胞电流示意图；B是 400nM Martentoxin作用于BK通道(a)的电流-时间图；C是400nM Martentoxin和400nM iberiotoxin分别对BK通道(a)活性抑制的统计图。
图3为Martentoxin增强IbTX对BK通道(a+p4)的抑制性效应图，其中A是在 holding电位为-70mV，含有500nM自由内钙的条件下，表达有BK通道(a+p4)的HEK293 细胞于+60mV刺激下分别施加20nM Martentoxin、 20nM iberiotoxin和20nMMartentxoin 与20nM iberiotoxin混合物的全细胞电流示意图；B是20nM Martentoxin与20nM iberiotoxin混合物作用于BK通道(a+卩4)的电流-时间图；C是20nM Martentoxin、 20nM iberiotoxin和20nM Martentoxin与20nM iberiotoxin混合物分别对BK通道(a+(34)活性 抑制的统计图；D是先施加50nM Martentoxin接着再施加200nM iberiotoxin作用于BK 通道(a+(34)的电流-时间图；E是先施加200nM iberiotoxin接着再施加100nM Martentoxin 作用于BK通道(a+p4)的电流-时间图；F是比较直接应用200nM Martentoxin引起的 抑制效应与随后施加200nM iberiotoxin引起的抑制效应的统计图；G是比较直接应用 200nM iberiotoxin引起的抑制效应与随后施加lOOnM Martentoxin引起的抑制效应的统 计图。
图4为Martentoxin调制BK通道(a+p4)活性的钙依赖性图，其中A是当自由内 钙的浓度分别为20^M、 500nM、 lOOnM时，在holding电位为-70mV条件下，表达有 BK通道(a+p4)的HEK293细胞于+60mV刺激下施加lOOnM Martentoxin的全细胞电 流示意图；B是当自由内钙的浓度分别为20nM、 500nM、 lOOnM时，lOOnM Martentoxin 对BK通道(a+p4)活性抑制的统计图；C是当自由内钙的浓度分别为20pM、 500nM、 lOOnM时，lOOnM Martentoxin对BK通道(a+p4)激活时间比率的统计图；D是 Martentoxin对胞内钙离子浓度影响的荧光成像(CCD)图。
图5为Martentoxin增强大鼠脑部自发性放电图，其中A是记录基础EEG (对照) 0.5小时后，注射lpl生理盐水到海马内(AP-4.3mm, L2.5mmandV2.5mm)，记录
6注射后0.5小时内的脑电发放；B是记录基础EEG (对照)0.5小时后，注射10nMX lpl iberiotoxin到海马内(AP-4.3 mm, L 2.5纖and V 2.5 mm)，记录注射后0.5小时内的 脑电发放；C是记录基础EEG (对照)0.5小时后，注射5(aMX lpl Martentoxin到海马 内(AP-4.3 mm, L 2.5 mm and V 2.5 mm)，记录注射后0.5小时内的脑电发放；D是记 录基础EEG (对照)0.5小时后，注射l(HiMXlnlMartentoxin到海马内(AP-4.3 mm, L 2.5 mm and V 2.5 mm)，记录注射后0.5小时内的脑电发放；E是记录基础EEG (对照) 0.5小时后，注射10nMX0.5(il iberiotoxin与10nMX0.5nlMartentoxin混合物到海马内
(AP-4.3 mm, L 2.5 mm and V 2.5 mm),记录注射后0.5小时内的脑电发放。
图6为Martentoxin增强大鼠海马齿状回颗粒细胞诱发性放电图，其中A是在50pA
(400ms)电流的刺激下，未施加药物的对照和施加200nMMartentoxin引起的动作电位 的示意图；B是200nM Martentoxin对动作电位的峰电位间隔时间和AHP去活时间比率 的统计图。
具体实施例方式
以下结合附图，以具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应理解，以下实施例 仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1、 Martentoxin对BK通道亚型(a+p4)电流的抑制
在37'C、 5%(302的恒温恒湿培养条件下，将人类胚胎肾细胞(HEK293)培养于包 含10% FBS(HyClone, Utah, U.S)的DMEM培养基(Dulbecco，s modified Eagle,s medium, GIBCO BRL, Grand Island, NY)中。
在35毫米的培养皿中，5pl Lipofectamine试剂(Invitrogen)携带约l吗的质粒即 hSloa (U23767) + p4 (KC画B4; AF207992)转染到人类胚胎肾细胞(HEK293)中。
在转染后24—72小时内，在室温(21—25。C)下利用EPC-9放大器(德国，HEKA eletronik)进行全细胞电压膜片钳实验。通过PP-830拉制仪(日本，Narishige)将玻璃 毛细管拉制成尖端阻抗约4—7 MQ的电极管。利用Pulse/PusleFit 8.3软件(德国，HEKA eletronik)采样和施加刺激，补偿电容，所采用的细胞其封接后串联电阻均低于20MQ ， 漏电流用P/6模式在记录中去除，电信号通过10kHz宽带滤波，Ag-AgCl盐桥作为参考 电极。细胞外液(mM) : NaCl 135, KC1 5, MgCl2 1.2， CdCl2 2.5， HEPES 5， glucose 10 (以 NaOH调节pH至7.4)。电极内液(mM): NaCl 10， KC1 117， CaCl2 0.8， MgS04 2, HEPES 10,MgATP2,EGTA 1 (以KOH调节pH至7.2)。将转染24-72小时的HEK293细胞经过0.05%胰蛋白酶进行消化后，制成细胞悬液 后滴加在载玻片上，贴壁一小时后进行全细胞电压膜片钳实验。通过调节低、中、高倍 镜和运用微操仪使得记录电极接触到显微镜中的实验细胞，给予一定的负压引起实验细 胞和记录电极的紧密接触形成高阻封接。高阻封接稳定后进行快电容的补偿同时再给予 实验细胞一定的负压造成细胞的破膜，进行慢电容的补偿。补偿完后在相应的刺激条件 下记录细胞膜上的通道电流，结果如图1A所示。
由图1A的全细胞电流图可见，在holding电位为-70mV条件下，细胞于+60mV剌 激下所得到的通道电流同Brenneretal.a C&附.275: 6453—6461, 2000)和Lippiatet al. a她*. 5/o/. 192: 141-148,2003)所报道的特征一致，包括具有较慢的激活和较 慢的失活动力学。在对照电流稳定后施加400 nM Martentoxin几乎可以完全抑制ot和p4 亚基(a+p4)共表达所产成的通道电流。而施加400 nM IbTX几乎不能影响通道的活动， 说明此通道为IbTX高度不敏感型。
在holding电位为-70mV条件下，细胞于+60mV刺激下，每30秒记录所得到的通 道电流，在对照电流稳定后施加400 nM Martentoxin,将施加药物所得到的电流值以未 施加任何药物的对照电流作标准化，根据标准化后的结果作电流-时间图，结果如图IB 所示。
由图IB的结果可见，400 nM Martentoxin抑制BK通道(a+p4)的电流较迅速，且 电流可以在用外液冲洗后恢复。400 nM Martentoxin在约90s内可以几乎完全抑制该电 流，而且外液冲洗大约90s后电流峰值恢复到对照水平，抑制效应消失。药物用外液冲 洗之后的稳态电流要比对照稍大(If =1.12±0.05， p<0.05; n =12)，这一结果提示 Martentoxin可能仍有部分残留在通道上。
在holding电位为-70mV条件下，细胞于+60mV刺激下，在对照电流稳定后施加不 同浓度的Martentoxin得到其对细胞膜上BK通道电流(a+p4)的药理学效应。将施加 药物所得到的电流值以未施加任何药物的对照电流作标准化，通过Origin7.0 (Northampton, USA)进行S形曲线拟合得到图1C所示的Martentoxin量效曲线图。由 图可见，Martentoxin对BK通道(a+|34)活性的抑制具有剂量依赖性的特点，随着浓度 的升高，抑制愈加明显。量效曲线显示Martentoxin阻断BK通道的半数抑制浓度(IC50) 为78.01 ±5.86 nM, Hill系数为2.23±0.36，由于Hill系数应等于酶分子中可能有结合 底物的位点数，因此提示BK通道上可能存有2个和Martentoxin相互作用的位点。
实施例2、 Martentoxin对BK通道亚型(a)的低选择性在37。C、 5%<:02的恒温恒湿培养条件下，人类胚胎肾细胞(HEK293)培养于包含 10%FBS的DMEM培养基中。
在35毫米的培养皿中，5^1 Lipofectamine试剂(Invitrogen)携带约l吗的质粒即 hSloa (U23767)转染到人类胚胎肾细胞(HEK293)中。在转染后24_72小时内，在 室温(21—25°C)下利用EPC-9放大器(德国，HEKAeletronik)进行全细胞电压膜片 钳实验。通过PP-830拉制仪(日本，Narishige)将玻璃毛细管拉制成尖端阻抗约4_7 MQ的电极管。利用Pulse/PusleFit 8.3软件(德国，HEKA eletronik)采样和施加刺激， 补偿电容，所采用的细胞其封接后串联电阻均低于20MQ，漏电流用P/6模式在记录中 去除，电信号通过lOkHz宽带滤波，Ag-AgCl盐桥作为参考电极。细胞外液(mM): NaCl 135， KC1 5， MgCl21.2, CdCl22.5， HEPES 5, glucose 10 (以NaOH调节pH至7.4)。 电极内液(mM) : NaCl 10, KC1 117, CaCl2 0.8， MgS04 2， HEPES 10, MgATP 2, EGTA 1 (以KOH调节pH至7.2)。
将转染24-72小时的HEK293细胞经过0.05%胰蛋白酶进行消化后，制成细胞悬液 后滴加在载玻片上，贴壁一小时后进行全细胞电压膜片钳实验。通过调节低、中、高倍 镜和运用微操仪使得记录电极接触到显微镜中的实验细胞，给予一定的负压引起实验细 胞和记录电极的紧密接触形成高阻封接。高阻封接稳定后进行快电容的补偿同时再给予 实验细胞一定的负压造成细胞的破膜，进行慢电容的补偿。补偿完后在相应的刺激条件 下记录细胞膜上的通道电流，结果如图2A所示。
由图2A的全细胞电流图结果可见，在holding电位为-70mV条件下，细胞于+80mV 刺激下所得到的通道电流，在对照电流稳定后施加400 nM Martentoxin对此通道电流影 响较小。而在对照电流稳定后施加400 nM IbTX几乎全部阻断该通道电流，可见BK通 道亚型(a)对Martentoxin的敏感性较弱。
在holding电位为-70mV条件下，细胞于+80mV刺激下，每30秒记录所得到的通 道电流，在对照电流稳定后施加400 nM Martentoxin，将施加药物所得到的电流值以未 施加任何药物的对照电流值作标准化，根据标准化后的结果作电流-时间图，结果如图 2B所示，可见在对照电流稳定后施加400 nM Martentoxin轻微缓慢地抑制BK通道(a) 的电流。
在holding电位为-70mV条件下，细胞于+80mV刺激下所得到的通道电流，在对照 电流稳定后施加400nM Martentoxin和400nM IbTX，记录施加药物稳定后的BK通道(a) 电流值。将所得的电流值以未施加任何药物的对照电流值标准化，根据标准化后的结果
9作统计图，结果如图2C所示，可见BK通道亚型(a)对Martentoxin的敏感性较弱。
实施例3、 Martentoxin增强IbTX对BK通道亚型(a+p4)的抑制性效应
不同毒素多肽作用于同一靶通道的受体位点可能存在明显的不同，因此，多个毒素 多肽一起使用时，可彼此相互异构性调节其生物活性。本实施例用于研究Martentoxin 和IbTX之间的异构性调节作用。
在37'C、 5%(:02的恒温恒湿培养条件下，将人类胚胎肾细胞(HEK293)培养于包 含10% FBS的DMEM培养基中。
在35毫米的培养皿中，5^1 Lipofectamine试剂(Invitrogen)携带约l吗的质粒即 hSloa (U23767) +卩4 (KCNMB4; AF207992)转染到人类胚胎肾细胞(HEK293)中。 在转染后24 — 72小时内，在室温(21—25'C)下利用EPC-9放大器(德国，HEKA eletronik)进行全细胞电压膜片钳实验。通过PP-830拉制仪(日本，Narishige)将玻璃 毛细管拉制成尖端阻抗约4一7 MQ的电极管。利用Pulse/PusleFit 8.3软件(德国，HEKA eletronik)采样和施加刺激，补偿电容，所采用的细胞其封接后串联电阻均低于20MQ ， 漏电流用P/6模式在记录中去除，电信号通过10 kHz宽带滤波，Ag-AgCl盐桥作为参 考电极。细胞外液(mM) : NaCl 135, KC1 5, MgCl2 1.2, CdCl2 2.5, HEPES 5, glucose 10 (以NaOH调节pH至7.4)。电极内液(mM) : NaCl 10， KC1 117, CaCl2 0.8， MgS04 2, HEPES 10,MgATP2，EGTA 1 (以KOH调节pH至7.2)。
将转染24-72小时的HEK293细胞经过0.05%胰蛋白酶进行消化后，制成细胞悬液 后滴加在载玻片上，贴壁一小时后进行全细胞电压膜片钳实验。通过调节低、中、高倍 镜和运用微操仪使得记录电极接触到显微镜中的实验细胞，给予一定的负压引起实验细 胞和记录电极的紧密接触形成高阻封接。高阻封接稳定后进行快电容的补偿同时再给予 实验细胞一定的负压造成细胞的破膜，进行慢电容的补偿。补偿完后在相应的刺激条件 下记录细胞膜上的通道电流，结果如图3A所示。
由图3A的全细胞电流图结果可见，在holding电位为-70mV条件下，细胞于+60mV 刺激下所得到的通道电流，在对照电流稳定后施加20 nM IbTX对BK通道(a+(34)几 乎没有任何影响，施加20nM Martentoxin可轻微抑制该通道活性(If = 0.94±0.01, n = 5)。而当20 nM IbTX和20 nM Martentoxin被混合后同时施加时，此IbTX不敏感的 BK通道(a+卩4)活性被快速抑制(If二0.46±0.03， n=5)。
在holding电位为-70mV的条件下，细胞于+60mV刺激下，每30秒记录所得到的
通道电流，在对照电流稳定后，施加20nM IbTX与20nM Martentoxin混合物，检测对未施加任何药物的对照电流值的影响。将施加药物所得到的电流值以未施加任何药物的 对照电流值作标准化，根据标准化后的结果作电流-时间图，结果如图2B所示，可见20nM IbTX与20nM Martentoxin混合使用对电流的抑制率约为单独加20nM Martentoxin对电 流抑制率的两倍，且电流可以在用外液冲洗后恢复。
将施加药物所得的电流值以未施加任何药物对照电流值标准化，根据标准化后的结 果作统计图，结果如图3C所示，表明Martentoxin与BK通道(a+p4)的结合易化了通 道与IbTX的亲和，从而增强了 IbTX对BK通道(a+p4)的抑制能力。
Martentoxin抑制BK通道(a+p4)活性的量效曲线提示BK通道(a+p4)上可能 有两个作用位点与Martentoxin结合，而且Martentoxin可增强BK通道(a+p4)和IbTX 的亲和，提示了这两个作用位点中有一个可起调节性作用，另一个直接参与毒素对通道 的阻断。
为了证明此可能性，Martentoxin和IbTX被分别先后应用。将施加药物所得到的 电流值以未施加任何药物的对照电流值作标准化，根据标准化后的结果作电流-时间图 和统计图，结果分别如图3D和3F、图3E和3G所示。
在holding电位为-70mV的条件下，细胞于+60mV刺激下，每30秒记录所得到的 通道电流。由图3D和3F可见，在对照电流稳定后，施加50nM Martentoxin可以明显 地抑制该通道电流，当50 nM Martentoxin被紧接着替换成200 nM IbTX后，此通道电 流可继续被IbTX抑制(If =0.14±0.02,n=5)。在药物用外液洗脱后，电流可恢复， 排除了通道活性自身衰减的可能，此结果进一步提示Martentoxin在被替换成IbTX后 仍有部分残留在BK通道(a+(34)上，因此易化了 IbTX与通道的亲和。反之，由图 3E和3G可见，BK通道(a+(34)在先应用200 nM IbTX后，电流几乎不受任何影响， 当200 nM IbTX被紧接着替换成100 nM Martentoxin后，电流可被迅速抑制(If =0.36 ±0.04, n=5)，此抑制率与100 nM Martentoxin直接应用对BK通道(ot+卩4)的抑制率 (If =0.35±0.03,n=8)没有显著性差异，提示IbTX直接应用时与该通道几乎没有作 用。
实施例4、 Martentoxin调制BK通道亚型(a+p4)活性的f5依赖性
在37'C、 5。/。C02的恒温恒湿培养条件下，人类胚胎肾细胞(HEK293)培养于包含
10°/。FBS的DMEM培养基中。
在35毫米的培养皿中，5^1 Lipofectamine试剂(Invitrogen)携带约l吗的质粒即
hSloa (U23767) + 3 4 (KCNMB4; AF207992)转染到人类胚胎肾细胞(HEK293)中。
11在转染后24_72小时内，在室温(21—25'C)下利用EPC-9放大器(德国，HEKA eletronik)进行全细胞电压膜片钳实验。通过PP-830拉制仪(日本，Narishige)将玻璃 毛细管拉制成尖端阻抗约4一7 MQ的电极管。利用Pulse/PusleFit 8.3软件(德国，HEKA detronik)采样和施加刺激，补偿电容，所采用的细胞其封接后串联电阻均低于20MQ ， 漏电流用P/6模式在记录中去除，电信号通过10kHz宽带滤波，Ag-AgCl盐桥作为参考 电极。
将转染24-72小时的HEK293细胞经过0.05%胰蛋白酶进行消化后，制成细胞悬液 后滴加在载玻片上，贴壁一小时后进行全细胞电压膜片钳实验。通过调节低、中、高倍 镜和运用微操仪使得记录电极接触到显微镜中的实验细胞，给予一定的负压引起实验细 胞和记录电极的紧密接触形成高阻封接。高阻封接稳定后进行快电容的补偿同时再给予 实验细胞一定的负压造成细胞的破膜，进行慢电容的补偿。补偿完后在相应的刺激条件 下记录细胞膜上的通道电流，结果如图4A所示。
图1C的结果已经证实，Martentoxin可以剂量依赖方式抑制BK通道(a+(34)电流。 由图4A的全细胞电流图可见，当电极内液中自由Ca^浓度被提高到2(^M时，即细胞 外液(mM) : NaCl 135, KC1 5, MgCl2 1.2, CdCl2 2.5, HEPES 5, glucose 10 (以NaOH调 节pH至7.4);电极内液(mM) : NaCl 10, KC1117, CaCl2 1.3， MgS04 2， HEPES 10， MgATP 2, EGTA 1 (以KOH调节pH至7.2),在holding电位为-70mV条件下，细胞 于+60mV刺激下所得到的通道电流，在对照电流稳定后施加100nM Martentoxin对BK 通道(ct+(34)的药理效应呈现增强性趋势。
在20pM [Ca^],下，将施加药物所得到的电流值以未施加任何药物的对照电流值作 标准化，根据标准化后的结果作统计图，结果如图4B所示，可见100 nM Martentoxin使 BK通道(a+(34)电流增大到对照水平的1.17土0.05倍(n=6)。
然而当电极内液中自由Ca^浓度分别为500 nM、 100nMCa2+，即细胞外液(mM): NaCl 135, KC1 5, MgCl2 1.2, CdCl2 2.5, HEPES 5， glucose 10 (以NaOH调节pH至7.4); 电极内液(mM) : NaCl 10， KC1 117, CaCl2 0.8 (或0.4) ， MgS04 2， HEPES 10， MgATP 2, EGTA 1 (以KOH调节pH至7.2)下，在holding电位为-70mV条件下，细胞于+60mV 刺激下所得到的通道电流，在对照电流稳定后施加100nM Martentoxin则对BK通道 (a+p4)均呈现出抑制性效应(见图4A)。将施加药物所得到的电流值以未施加任何 药物的对照电流值作标准化，根据标准化后的结果作统计图，结果如图4B所示，If分 别为0.35土0.03 (n=6)禾Q 0.38±0.06 (n=5)，这两个If值间无显著性差异。而且，在高钙和低钙条件下，在holding电位为-70mV条件下，细胞于+60mV刺激 下所得到的通道电流，在对照电流稳定后施加100 nM Martentoxin均可显著加快BK通 道(a+p4)的激活，将施加药物激活通道所需的时间以未施加任何药物的对照时间作标 准化，根据标准化结果作激活时间比率统计图，结果如图4C所示，可见Martentoxin可 以縮短其激活所需要的时间。
此外，应用Ca2+荧光成像，即HEK293细胞与5pM Fura-2 AM (Molecular Probes, Dojindo Laboratories)在37'C下于HEPES缓冲液中负载60分钟，用于Ca^荧光成像的 HEPES缓冲液(mM) : NaCl 137, KC1 5.9, MgCl2 l，CaCl2 2.5， HEPES 10, glucose 15 (以 NaOH调节pH至7.4)。负载60分钟后运用HEPES缓冲液将细胞冲洗2遍，再用HEPES 缓冲液负载10分钟后进行CCD实验。细胞的自身荧光在没有负载Fura2 AM区域测定, 计算[Ca2+]i时应减去细胞自身的荧光。Fum-2的荧光测定采样间隔为2秒。结果如图 4D所示。
由图4D的结果可见，100 nM Martentoxin不能引起细胞内Ca^的振荡，而高KCl 溶液可显著导致内Ca"浓度提升。此结果表明，全细胞膜片钳实验中细胞内<^2+浓度和 电极内液中Ca^浓度相比，差别极小。
实施例5、 Martentoxin增强大鼠脑部自发性放电
用于脑电记录的250 - 300g Sprague-Dawley大鼠购自中科院上海实验动物中心，所 有实验操作均遵守中科院实验动物伦理规则。动物在注射戊巴比妥钠(40mg/kg)致麻 痹后，被放置于立体定位仪上。导管按照以前的方法(Baietal.,ficpm'm. iVewrwz. 197:167 —176,2006)置于海马区域(AP-4.3 mm, L 2.5 mm and V 2.5 mm)内；记录电极置于导 管对侧的皮层前部额区域(AP -3.5 mm， R 2.0 mm and V 1.5 mm);参考电极置于小脑 区域(AP-10.0mm)。导管和电极均用牙科水泥封闭，手术后的老鼠待伤口恢复3—4 天愈合后待用。利用生物电放大器(Model SMUP-E Bioeletric Signals Processing System, Shanghai Medical College of Fudan University, China)以0.1陽40Hz传输频率在lOOmV范 围内记录脑电发放。采样频率为1000Hz。将大鼠分成2组进行脑电记录没有注射药 物的对照组和注射不同药物(溶解于生理盐水中，总体积为1^1)的实验组。在实验组 中，记录基础EEG(对照)0.5小时后，微量注射药物到海马内(AP-4.3 mm， L 2.5 mm and V2.5mm)，记录给药后0.5小时内的脑电发放，结果如图5所示。
注射生理盐水或10 IbTX (lul)至海马区域，皮层额叶区自发性放电几乎没有 受到任何影响(见图5A和B)，提示IbTX敏感的BK通道表达丰度较低，或此类型BK通道对大鼠脑部自发性放电几乎没有作用。
注射l(VM Martentoxin (lpl)到海马区域，可显著增强皮层额叶区自发性放电，导 致癫痫样放电波的出现。但注射5|iM Martentoxin (1^1)至海马区域，对大鼠脑部自发 性放电几乎没影响(见图5C和D)。
为排除Martentoxin可能影响大鼠海马区域的其它钾通道活性，将10pM IbTX(0.5pl) 和10pM Martentoxin (0.5pl)混合后共注射到海马区域，观察其药理效应，结果见图5E。 结果显示，皮层额叶区域自发性放电亦受到明显影响，呈现了类似于癫痫样放电的波形。
5nM Martentoxin (1^1)禾niOpMIbTX (lpl)分别注射时，均不能诱发大鼠脑区域 癫痫样放电。当相当于5pM Martentoxin (lpl)和5pM IbTX (1^1)被混合注射时，大 鼠脑区域自发性放电则明显增强，提示两药物共同施加时可发生异构性相互增强效应。 鉴于脑脊液的稀释，到达海马神经元的毒素浓度应接近于单细胞膜片钳记录中 Martentoxin的应用浓度(nM级)。此结果与前述全细胞膜片钳中两药物对BK通道 (ot+P4)活性异构性增强的效应一致。因此，在大鼠脑部自发性放电记录中，Martentoxin 可仅通过抑制BK通道(Ct+P4)的活性增强大鼠脑部自发性放电。
实施例6、 Martentoxin增强大鼠海马齿状回颗粒细胞诱发性放电 将出生后20—30天的Sprague-Dawley大鼠麻醉后，急性取出海马切成380nm厚度 的脑薄片置于人工脑脊液(ACSF)中，运用红外微分干涉差显微镜鉴别齿状回颗粒细 胞。利用Axopatch 200B放大器(Axon)和Digidata1200数模转换器(Axon)进行全 细胞膜片钳记录。通过pClamp软件(version6， Axon)采样和处理。装有电极内液的 玻璃微电极尖端阻抗为2-5MQ。人工脑脊液(ACSF)与细胞外液相同(mM) : NaCl 130， KC1 5, CaCl2 2， MgS04 2, NaH2P04 1.25， NaHC03 26, glucose 10，通95% 02/5%C02 直到其饱和。电极内液(mM) : K隱gluconate 140，MgCl22，EGTA 1, ATP'K22,GTP'Na3 0.1 andHEPES 10 (调节pH至7.25)，同时按Maxchelatorc程序(http:〃www.stanford. edu/o/。7Ecpatton/maxc.h加I)计算控制其自由钙离子浓度为19pM左右。
50-pA (400ms)电流注射可引起一连串的动作电位。由图6A的动作电位图的结果 可见，应用200 nM Martentoxin则明显縮短动作电位的峰电位间隔时间和AHP去活时 间。将施加Martentoxin后所得到的动作电位的峰电位间隔时间和AHP去活时间以未施 加任何药物的对照峰电位间隔时间和AHP去活时间作标准化，根据标准化结果作统计 图，结果如图6B所示，可见Martentoxin可以明显縮短动作电位的峰电位间隔时间和 AHP去活时间(n=5)。在电流钳模式下，持续性地去极化刺激导致大量的钙离子进入胞内(Berridge, M丄et al. Atowe Mo/ Ce//. 1:11-21, 2000)，诱使细胞内己有的自由钙浓度继续升高，超过 20^M。
200 nM Martentoxin加速了 AHP去活和縮短了动作电位发放间隔时间。卩4亚基基 因敲除实验结果显示在诱发性放电中，BK通道电流的增大和激活动力学的加快也将 导致兴奋性的提高(Brenner etal.， Ato. "ewnwd. 8: 1752-1759, 2005)，同时伴随AHP 失活时间和峰电位间隔的縮短。鉴于Martentoxin可增大BK通道(a+p4)电流(If=1.17 ±0.05)和縮短激活时间(i对照2.81土0.07ms; i martentoxin:2.31 ±0.23ms)，其增 强齿状回颗粒细胞诱发放电的结果提示Martentoxin可能仅作用于齿状回颗粒细胞上的 BK通道(a+(34)。
综上所述，Martentoxin对于BK通道亚型(a+p4)的选择性较强，而对BK通道亚 型(a)的选择性较弱，因此可以用作BK通道亚型(a+(34)的特异性调节剂。由于 Martentoxin是已经发现的毒素中唯一可以抑制BK通道亚型(cHf4)活性的神经毒素， 因此可以弥补其它作用于BK通道的神经毒素如IbTX和Chtx的功效。
此外，由于Martentoxin与相关BK通道亚型相互作用的模式均有别于传统的钾通道 毒素与钾通道相互作用的两种模式，即毒素通过堵塞钾通道孔区阻断通道或毒素通过与 钾通道电压感受器的作用影响钾通道活性，这一结果提示BK通道上存在药物作用的新 靶点，且Martentoxin对BK通道亚型的差异性药理效应，表明其有望成为治疗BK通道亚 型相关疾病的候选药物。
权利要求
1、一种东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒素Martentoxin的应用，其特征在于，用作BK通道亚型(α+β4)的特异性抑制剂。
2、 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述抑制剂阻断BK通道亚型(a+(34) 的半数抑制浓度约为78.01nM。
3、 如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述抑制剂用于增强脑部自发性放电。
4、 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂用于增强海马齿状回颗粒 细胞的诱发性放电。
5、 一种东亚钳蝎(5w/ms wflWe"w'Karsch)毒素Martentoxin的应用，其特征在于， 用于增强现有肽类BK通道配体对BK通道亚型(a+卩4)的抑制作用。
6、 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述现有肽类BK通道配体包括IbTX 禾口 ChTX。
7、 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述现有肽类BK通道配体为IbTX。
8、 一种东亚钳蝎(万wAm waWera/Karsch)毒素Martentoxin的应用，其特征在于， 用作BK通道亚型(a+p4)的工具药。
9、 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工具药抑制BK通道亚型(oHf4)。
全文摘要
本发明公开了一种东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒素Martentoxin的应用，其可用作BK通道亚型(α+β4)的特异性抑制剂，可以增强现有肽类BK通道配体，如IbTX和ChTX，对BK通道亚型(α+β4)的抑制作用，以弥补其它作用于BK通道的神经毒素如IbTX和Chtx的功效。因而Martentoxin也可以作为神经系统BK通道研究的一个极富价值的新型工具药。
文档编号A61K38/17GK101564530SQ200810036629
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者吉永华, 健 施, 段燕红, 莺 陈 申请人:上海大学