专利名称：载抗纤溶药缓控释给药系统、构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属凝胶材料和药物结合技术领域，涉及一种载抗纤溶药缓控释给药 系统、给药系统的制备和应用。
背景技术：
高血压性脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage, HICH)是一 种严重危害人类生命健康的疾病，其致残率和死亡率远高于其它卒中类型，随着 人口进一步的老龄化和HICH发病的年轻化，如何降低HICH的发病率，减少其致 残率和死亡率，已成为迫在眉睫需要解决的问题。随着神经影像技术的飞速发展，
微侵袭治疗日益渗透到神经外科的各个领域，尤其是神经导航技术和神经内窥镜 的应用，对于减少HICH手术本身造成的危害和降低致残率等方面有着更为广阔 的作用。在微侵袭手术治疗HICH术后常规清除残余血肿的治疗方法是血肿腔内 逆行注入纤溶酶原激活物，如尿激酶(Urokinase, UK)，重组链激酶(r-SK)等。
据报道，在HICH的外科治疗中纤溶酶原激活物的应用时间和应用剂量临床 上并未达到统一规范的标准，但均为术后应用，临床上报道为5000 12500IU Bid 或Tid的应用，多次应用有可能增加颅内感染的可能。如能在手术中一次给药， 达到清除血肿的目的，则可以减少颅内感染的机会，利于患者的早期恢复。临床 上，由于纤溶酶原激活物起效快，半衰期短；术中应用有再出血的可能，所以还 不能在术中应用纤溶酶原激活物。本发明的目的就在于制备一种纤溶酶原激活物 缓控释制剂的纳米缓控释给药系统，使之应用于HICH的微侵袭外科治疗之中。
将常规治疗药物纳米化，可大大增加药物颗粒的表面积，使之与组织的接触 面积增大，从而提高药效，并能减少用量及降低副作用。根据基础和临床研究普 朗尼克(Pluronci)是可以满足临床要求，用来包裹纤溶酶原激活物，形成纳米颗 粒，建立一种通过超声引发来控制纤溶酶原激活物释放的给药系统。此纳米材料 在包裹抗肿瘤药物(阿霉素等)的研究中广泛应用，在纤溶酶原激活物方面并无相关应用和报道。目前本发明已对Pluronic进行了细胞毒性实验检测，和动物 皮肤刺激实验检测，证明其安全性。同时对胶束的载药量和包封率进行测定和评 估；在体外实验检测和血凝块溶解实验中以及大鼠的动物实验中均取得了明显效 果。
Pluronic无毒、无刺激、无免疫原性,是一种安全的药物载体。具有如下特 征l.常温溶解后自组装形成可以包裹药物的溶胶，直径在几十纳米；2.这种材 料具有温度敏感的特点，常温下是溶胶，体温下转变成凝胶；3.超声可以引发胶 束释放所包含的药物。在低于临界胶束浓度(CMC)下，共聚物的分子以单聚体 的形式分散在溶液中，在高于临界胶束浓度时，单聚体聚合形成的胶束占主体。 在体温附近的转化点使含有药物的在低于体温时呈溶胶状态，而在体温状态下呈 凝胶状态，有利于保护药物及起到缓控释药物的作用，通过一定频率和功率的超 声应用于所制备的给药系统，使其包封在内的药物释放，达到临床所需的浓度。 应用超声的特点在于无侵害性，能够穿过机体组织，集中超声能量，达到细微 控制。
综上所述，本发明通过新型的表面活性材料Pluronic和纤溶酶原激活物相 作用制成的载纤溶酶原激活物Pluronic缓控释给药系统，在高血压脑出血的动 物实验研究中，低频超声对药物的释放可以达到满意的控制，为HICH的微侵袭 外科治疗提供更好的辅助纤溶治疗方法。
发明目的
本发明为提供一种纤溶酶原激活物缓控释剂的给药系统。
本发明的另一目的是提供构建上述纤溶酶原激活物缓控释剂的给药系统的 方法。
本发明的目的还提供上述纤溶酶原激活物缓控释剂的给药系统的用途，通 过超声引发控制纤溶酶原激活物的释放，促进体内外血肿的溶解。
发明内容
本发明的提供的一种载纤溶酶原激活物普朗尼克(Pluronic廣控释给药系统， 是由浓度范围在5~50, 000IU/ml的注射人用纤溶酶原激活物和浓度范围在10~40%的Pluronic水溶液构成。克服纤溶酶原激活物作用时间短， 一次作用的缺 陷，使纤溶酶原激活物和纳米技术结合，缓慢释放，并应用超声引发技术控制纤 溶酶原激活物释放。
所述的Pluronic (BASF公司)是F127、 F108、 F68或P105等的浓度范围在 10~40%，与水溶性药物相结合，可以形成常温下是液态的溶胶，随着温度的升高， 转化为固态的凝胶。先制备浓度为100 IU /mL的纤溶酶原激活物溶液，取111 毫克~666毫克普朗尼克溶于1升纤溶酶原激活物溶液，12~24h后普朗尼克完全 溶解，常温下形成浓度在10~40%的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统， 在漩涡混合器上处理1 10min。
所述的纤溶酶原激活物是尿激酶、重组链激酶或人组织型纤溶酶等。 本发明所要制备的载纤溶酶原激活物Pluronic缓控释给药系统，先制备浓度 为100 IU /mL的注射用纤溶酶原激活物(人用)溶液，和Pluronic水溶液在常 温下混合，彼此发生先溶胀再溶解的过程，以物理作用结合，Pluronic形成网格 的分子结构，结合纤溶酶原激活物，12~24h后Pluronic完全溶解，常温下形成 浓度在10~40%的载纤溶酶原激活物Pluronic缓控释给药系统，溶胶状，可流动， 澄清透明。在漩涡混合器上处理1 10min，制成常温下为溶胶的载药系统。 形成缓控释给药系统，超声应用后，可使制备的给药系统分子结构摆动，网格中 的纤溶酶原激活物释放，发挥其自身的促进纤维蛋白酶原溶解的作用。
该载纤溶酶原激活物Pluronic缓控释给药系统，超声的频率为10kHz 10MHz。 本发明的创新点在于把纳米技术应用于临床，将Pluronic和纤溶酶原激 活物相结合，制成可以为超声引发释放药物的载纤溶酶原激活物缓控释给药系 统；所制备合成的载纤溶酶原激活物缓控释给药系统对于HICH的微侵袭手术治 疗具有重要的辅助作用，使HICH的手术更安全，并减少手术后可能的并发症。 载纤溶酶原激活物Pluronic缓控释给药系统可用于制备高血压脑出血微侵袭术 后辅助药物。所述的载纤溶酶原激活物Pluronic缓控释给药系统的应用，是在超 声频率为10kHz 10MHz的引发下释放药物的载纤溶酶原激活物缓控释给药系统。
图1载尿激酶PluronicP-105的体外试验(不同时间段应用超声对载药系统的影 响)；
图2超声控制载尿激酶PluronicP-105给药系统体外释放的数据统计；
图3超声控制载尿激酶PluronicP-105给药系统体外助溶血肿的作用；
图4超声控制载尿激酶PluronicP-105给药系统的动物实验； 图5: Pluronic不同温度下性状发生变化；
图6:超声作用机理示意图超声开始，自组装结构被破坏，药物释放；超声停止，自组装 结构重新形成，重新俘获未作用的药物；
图7:各组标本的比较图7- 1:假手术组，仅有轻微的针道损伤。图7-2单 纯血肿组①术后第3天，有明显脑水肿，有明显占位效应；②术后第7天， 脑水肿有所消退。图7-3单纯UK组①术后第24h，血肿周围伴有轻微脑水 肿，有占位效应；②术后第3天，脑水肿消退，血肿部分吸收。图7-4NP-UK 组图①、③，术后第24h，脑水肿较明显，有明显占位效应；②、 术后7
天，轻微脑水肿，血肿大部分吸收。
图8:组织病理学观察大鼠各组脑组织学各组对比:注血后即刻可见成形血肿块，
血肿周围脑组织轻度受压，血肿周围水肿不明显(图A);注血后12h，可见出血 灶与正常脑组织间有一过渡带即血肿周围区，周围区内脑细胞较为密集(图B);
注血早期血肿周围脑组织疏松，细胞间隙扩大，细胞有不同程度水肿，星形细胞
肿胀变形(图C);注血后24h可见神经细胞变性，星形胶质细胞增生，小胶质 细胞吞噬坏死的神经元(图D、 E);注血后72h血肿周围组织疏松、水肿呈空泡 状，出血灶周边毛细血管增生，并可见炎细胞浸润(图F)。对照组大鼠HE染色
未见明显异常。 符号说明
图6: US:超声。Stop US:停止超声。Drug release:药物释放。Time:时间。
具体实施例方式
下面以实施例对本发明加以进一步的说明，但是不限制本发明的内容。 实施例1:载尿激酶PluronicP-105给药系统的制备方法25万单位/支的尿激酶溶解，制成浓度为100 IU/mL的水溶液。取333毫克 P-105，溶于1升Uk溶液，12 24h后P-105完全溶解，常温下形成25%的载尿 激酶P-105缓控释给药系统，溶胶状，可流动，澄清透明。在漩涡混合器上处理 5min，制成常温下为溶胶的载药系统，分别取lmL溶胶置入玻璃管。对照组和 实验组各lmL试管均放在恒温水浴中，试管中加入lmL的生理盐水(Ns)，各 组具体操作如下①实验组取常温所制备的载尿激酶P-105缓控释给药系统， (37±0.5) 。C的恒温水浴5分钟，水溶胶即固化成为凝胶(不流动)，此即为实 验反应液。记录时，反应实验液加入lmL蒸馏水，作用5分钟，然后倒出至试 管中。②实验超声组上述反应液超声2次，每次超声lmin，间隔lmin。记录 具体同前。多频超声治疗仪频率选择是22KHz，功率选择为100w，将装有反应 液的各组小管置于恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm，观察尿激 酶释放情况，时间为每次超声lmin,共超声两次，每次间隔lmin。作用3min 后，将溶液倒出，另置试管中，处理方法同实验不超声组，计时，推算UK浓度。 ③对照组普通UK组单纯尿激酶100IU/mL，取0.4mL作为反应液，进行和 实验组相同的实验。普通UK + Us组反应液制备同普通UK组，超声方法同实 验超声组。结果如图2。
实施例2:超声引发控制载尿激酶PluronicP-105给药系统溶解体外血肿的实验
高血压性脑出血患者6名，术前采血，每人取5ml股静脉血，立即分装lml 血入玻璃试管中，放入恒温水浴箱内2h，共30组，形成退縮的血肿。将血肿取 出后，用手动固定式移液器(精确度为精确测量残留液体积，间接计算 血肿体积。
超声方法为应用多频超声治疗仪频率定22KHz，功率选择为500w，将装有血 肿的各组小管置于37'C恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm,恒温 箱四周及底部铺有3cm厚的橡胶垫用于吸收残余超声波，以防止驻波形成，然后 进行超声辐照溶解血肿，时间为每次超声lmin，超声两次，每次间隔lmin。超 声后，在常温下根据上述方法计量血肿体积，试管继续保留在恒温水浴中，在下 一个时间段再记录血肿体积。结果如图3。
实施例3:载尿激酶PluronicP-105给药系统溶解体内血肿的动物实验取健康成年SD大鼠150只，重量在250~300g，制作高血压性脑出血大鼠 模型，分五组，即血肿+UK组；血肿+UK+US组；血肿+NP-UK组；血肿 +NP-UK+US组(即刻US);血肿+NP-UK+US组(ldUS)。每组再各分两组，即病 理组合检测组，共10组，每组3例，应用多频超声治疗仪，频率在23kHz，超 声时间5分钟，超声两次，间隔2分钟，在6h,24h,48h,3d，7d,记录各组血肿溶解 情况。结果如图4。实施例4:载尿激酶PluronicP-108给药系统的制备方法25万单位/支的尿激酶溶解，制成浓度为100IU/mL的水溶液。取370毫克 P-108，溶于1升Uk溶液，12~24h后P-108完全溶解，常温下形成27%的载尿 激酶P-108缓控释给药系统，溶胶状，可流动，澄清透明。在漩涡混合器上处理 5min，制成常温下为溶胶的载药系统，分别取lmL溶胶置入玻璃管。对照组和 实验组各lmL试管均放在恒温水浴中，试管中加入lmL的生理盐水(Ns)，各 组具体操作如下①实验组取常温所制备的载尿激酶P-108缓控释给药系统， (37±0.5) 。C的恒温水浴5分钟，水溶胶即固化成为凝胶(不流动)，此即为实 验反应液。记录时，反应实验液加入lmL蒸馏水，作用5分钟，然后倒出至试 管中。 实验超声组上述反应液超声2次，每次超声lmin，间隔lmin。记录 具体同前。多频超声治疗仪频率选择是22KHz，功率选择为100w，将装有反应 液的各组小管置于恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm，观察尿激 酶释放情况，时间为每次超声lmin，共超声两次，每次间隔lmin。作用3min 后，将溶液倒出，另置试管中，处理方法同实验不超声组，计时，推算UK浓度。 (D对照组普通UK组单纯尿激酶100IU/mL，取0.4mL作为反应液，进行和 实验组相同的实验。普通UK + Us组反应液制备同普通UK组，超声方法同实 验超声组。实施例5:超声引发控制载尿激酶PluronicP-108给药系统溶解体外血肿的实验 高血压性脑出血患者6名，术前采血，每人取5ml股静脉血，立即分装lml 血入玻璃试管中，放入恒温水浴箱内2h，共30组，形成退縮的血肿。将血肿取 出后，用手动固定式移液器(精确度为精确测量残留液体积，间接计算 血肿体积。超声方法为应用多频超声治疗仪频率定22KHz，功率选择为500w，将装有血肿的各组小管置于37'C恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm，恒温 箱四周及底部铺有3cm厚的橡胶垫用于吸收残余超声波，以防止驻波形成，然后 进行超声辐照溶解血肿，时间为每次超声lmin，超声两次，每次间隔lmin。超 声后，在常温下根据上述方法计量血肿体积，试管继续保留在恒温水浴中，在下 一个时间段再记录血肿体积。. 实施例6:载尿激酶PluronicP-108给药系统溶解体内血肿的动物实验取健康成年SD大鼠150只，重量在250~300g，制作高血压性脑出血大鼠 模型，分五组，即血肿+UK组；血肿+UK+US组；血肿+NP-UK组；血肿 +NP-UK+US组(即刻US);血肿+NP-UK+US组(ldUS)。每组再各分两组，即病 理组合检测组，共10组，每组3例，应用多频超声治疗仪，频率在23kHz，超 声时间5分钟，超声两次，间隔2分钟，在6h,24h,48h，3d，7d,记录各组血肿溶解 情况。实施例7:载重组链激酶激酶PluronicP-105给药系统的制备方法50万单位/支的重组链激酶溶解，制成浓度为100IU/mL的水溶液。取333毫克P-105，溶于l升r-sk溶液，12 24h后P-105完全溶解，常温下形成25^的载重组链激酶P-105缓控释给药系统，溶胶状，可流动，澄清透明。在漩涡 混合器上处理5min，制成常温下为溶胶的载药系统，分别取lmL溶胶置入玻璃 管。对照组和实验组各lmL试管均放在恒温水浴中，试管中加入lmL的生理盐 水(Ns)，各组具体操作如下①实验组取常温所制备的载重组链激酶P-105 缓控释给药系统，(37±0.5) 。C的恒温水浴5分钟，水溶胶即固化成为凝胶(不 流动)，此即为实验反应液。记录时，反应实验液加入lmL蒸馏水，作用5分钟， 然后倒出至试管中。②实验超声组上述反应液超声2次，每次超声lmin，间 隔lmin。记录具体同前。多频超声治疗仪频率选择是22KHz，功率选择为100w， 将装有反应液的各组小管置于恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm， 观察重组链激酶释放情况，时间为每次超声lmin，共超声两次，每次间隔lmin。 作用3min后，将溶液倒出，另置试管中，处理方法同实验不超声组，计时，推算r-sk浓度。(D对照组普通r-sk组单纯重组链激酶100IU/mL，取0.4mL 作为反应液，进行和实验组相同的实验。普通r-sk + Us组反应液制备同普通r-sk组，超声方法同实验超声组。实施例8:超声引发控制载重组链激酶PluronicP-105给药系统溶解体外血肿的实验 高血压性脑出血患者6名，术前采血，每人取5ml股静脉血，立即分装lml 血入玻璃试管中，放入恒温水浴箱内2h，共30组，形成退縮的血肿。将血肿取 出后，用手动固定式移液器(精确度为精确测量残留液体积，间接计算 血肿体积。超声方法为应用多频超声治疗仪频率定22KHz，功率选择为500w，将装有血 肿的各组小管置于37'C恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm,恒温 箱四周及底部铺有3cm厚的橡胶垫用于吸收残余超声波，以防止驻波形成，然后 进行超声辐照溶解血肿，时间为每次超声lmin，超声两次，每次间隔lmin。超 声后，在常温下根据上述方法计量血肿体积，试管继续保留在恒温水浴中，在下 一个时间段再记录血肿体积。实施例9:载重组链激酶PluronicP-105给药系统溶解体内血肿的动物实验 取健康成年SD大鼠150只，重量在250~300g，制作高血压性脑出血大鼠模型，分五组，即血肿+r-sk组；血肿+r-sk +US组；血肿+NP-r-sk组；血肿+NP-r-sk+US组(即刻US);血肿+NP-r-sk+US组(ldUS)。每组再各分两组，即病理组合检测组，共10组，每组3例，应用多频超声治疗仪，频率在23kHz， 超声时间5分钟，超声两次，间隔2分钟，在6h,24h，48h,3d，7d,记录各组血肿溶 解情况。实施例10:载重组链激酶激酶PluronicP-108给药系统的制备方法50万单位/支的重组链激酶溶解，制成浓度为100IU/mL水溶液。取370毫克P-108，溶于1升r-sk溶液，12~24h后P-108完全溶解，常温下形成27%的载重组链激酶P-108缓控释给药系统，溶胶状，可流动，澄清透明。在漩涡混合 器上处理5min，制成常温下为溶胶的载药系统，分别取lmL溶胶置入玻璃管。 对照组和实验组各lmL试管均放在恒温水浴中，试管中加入lmL的生理盐水(Ns)，各组具体操作如下①实验组取常温所制备的载重组链激酶P-108缓 控释给药系统，(37士0.5)。C的恒温水浴5分钟，水溶胶即固化成为凝胶(不流动)，此即为实验反应液。记录时，反应实验液加入lmL蒸馏水，作用5分钟， 然后倒出至试管中。②实验超声组上述反应液超声2次，每次超声lmin，间 隔lmin。记录具体同前。多频超声治疗仪频率选择是22KHz，功率选择为100w， 将装有反应液的各组小管置于恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm， 观察重组链激酶释放情况，时间为每次超声lmin，共超声两次，每次间隔lmin。 作用3min后，将溶液倒出，另置试管中，处理方法同实验不超声组，计时，推算r-sk浓度。③对照组普通r-sk组单纯重组链激酶100IU/mL,取0.4mL 作为反应液，进行和实验组相同的实验。普通r-sk + Us组反应液制备同普通r-sk组，超声方法同实验超声组。实施例11:超声引发控制载重组链激酶PluronicP-108给药系统溶解体外血肿的实验 高血压性脑出血患者6名，术前采血，每人取5ml股静脉血，立即分装lml 血入玻璃试管中，放入恒温水浴箱内2h,共30组，形成退縮的血肿。将血肿取 出后，用手动固定式移液器(精确度为10W)精确测量残留液体积，间接计算 血肿体积。超声方法为应用多频超声治疗仪频率定22KHz，功率选择为500w，将装有血 肿的各组小管置于37'C恒温水箱中，超声探头亦浸入水中，两者相距3cm，恒温 箱四周及底部铺有3cm厚的橡胶垫用于吸收残余超声波，以防止驻波形成，然后 进行超声辐照溶解血肿，时间为每次超声lmin，超声两次，每次间隔lmin。超 声后，在常温下根据上述方法计量血肿体积，试管继续保留在恒温水浴中，在下 一个时间段再记录血肿体积。实施例12:载重组链激酶PluronicP-108给药系统溶解体内血肿的动物实验 取健康成年SD大鼠150只，重量在250~300g，制作高血压性脑出血大鼠模型，分五组，即血肿+r-sk组；血肿+r-sk +US组；血肿+NP-r-sk组；血肿十NP-r-sk +US组(即刻US);血肿+NP-r-sk +US组(ldUS)。每组再各分两组，即病理组合检测组，共10组，每组3例，应用多频超声治疗仪，'频率在23kHz， 超声时间5分钟，超声两次，间隔2分钟，在6h,24h,48h，3d，7d，记录各组血肿溶解情况。
权利要求
1、一种载纤溶酶原激活物的普朗尼克缓控释给药系统，是由浓度范围在5～50,000IU/ml的注射人用纤溶酶原激活物和浓度范围在10～40％的普朗尼克水溶液构成。
2、 按权利要求1所述的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统，其特 征是所述的普朗尼克是F127、 F108、 F68或P105。
3、 按权利要求1所制备的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统，其 特征是所述的纤溶酶原激活物是尿激酶、重组链激酶或人组织型纤溶酶。
4、 按权利要求1所述的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统的制备， 其特征是先制备浓度为100 IU /mL的纤溶酶原激活物溶液，取111毫克~666毫 克普朗尼克溶于1升纤溶酶原激活物溶液，12 24h后普朗尼克完全溶解，常温 下形成浓度在10~40%的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统，在漩涡混 合器上处理1 10min。
5、 一种按权利要求1所述的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统用 于制备高血压脑出血微侵袭术后辅助药物。
6、 一种按权利要求1所述的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统的 应用，其特征是在超声频率为10kHz 10MHz的引发释放药物的载纤溶酶原激活物 缓控释给药系统。
全文摘要
本发明是一种纤溶酶原激活物缓控释剂的给药系统，构建方法和用于制备高血压脑出血微侵袭术后辅助药物用途。载纤溶酶原激活物的普朗尼克缓控释给药系统是由浓度范围在5～50,000IU/ml的注射人用纤溶酶原激活物和浓度范围在10～40％的普朗尼克水溶液构成。先制备浓度为100IU/mL的纤溶酶原激活物溶液，取111毫克～666毫克普朗尼克溶于1升纤溶酶原激活物溶液，12～24h后Pluronic完全溶解，在漩涡混合器上处理1～10min，常温下形成浓度在10～40％的载纤溶酶原激活物普朗尼克缓控释给药系统。
文档编号A61P7/00GK101306197SQ20081003753
公开日2008年11月19日 申请日期2008年5月16日 优先权日2008年5月16日
发明者刘卫东, 段友容, 蕾 祝, 非 莫 申请人:上海市肿瘤研究所;上海市浦东新区浦南医院