专利名称：犬尿氨酸氨基转移酶在制备治疗高血压病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及犬尿氨酸氨基转移酶的用途， 尤其涉及犬尿氨酸氨基转移酶在制备治疗高血压病的药物中的用途。
背景技术：
犬尿会啉酸(kynurenic acid, KYNA)作为 一种非选择性的兴奋性氨 基酸受体拮抗剂，由犬尿氨酸(kynurenine， KYN)经犬尿氨酸氨基转移 酶(kynurenine aminotransferase, KAT)催化生成。或者说，KAT在体内 催化KYNA的生物合成，是KYN代谢通路中的一个重要酶，是催化 KYN生成KYNA的限速酶。有研究表明，中枢兴奋性谷氨酸能信号通 路在维持血压稳态和血压反射控制中起重要作用(Arnolda L， Minson J, Kapoor V， et al. Amino acid neurotransmitters in hypertension. Kidney Int Suppl 1992;37:S2-7),而KYNA通过干预神经突触后连接传递活动而拮 抗大脑皮层的兴奋性，这表明中枢KYNA代谢可能参与血压调节过程。由于KAT在体内分布广泛，表明外周组织也能产生KYNA。以往 对KYNA及其催化酶KAT与血压调节关系的研究主要集中在中枢神经 系统，至于外周组织KAT及KYNA与血压调节的关系尚无相关报道。 特别是肾脏作为重要的血压调节器官，其皮质或髓质中KAT变化鲜有 人知。外周组织经KAT生成的KYNA主要经肾脏排出体外，因此检测 尿中KYNA含量可以间接反映外周组织的KYNA代谢。发明内容本发明的目的是提供犬尿氨酸氨基转移酶的新用途，即在制药中 的新应用。
本发明提供了犬尿氨酸氨基转移酶(下文简称为KAT)在制备治疗 高血压病的药物中的用途。
为了更好地理解本发明的实质，下文将通过检测肾脏KAT II基因 表达、KAT活性、尿中KYNA含量在自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats, SHR)和正常对照鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)的变化 来说明肾皮质KAT活性变化导致KYNA的改变而对血压的影响。
图1A和IB分别为肾皮质和肾髓质中KAT的活性。 图2为24小时尿中KYNA的含量。
图3A和3B分别为肾皮质中KAT活性及KYNA含量与血压的关系。
图4A和4B分别为肾皮质和肾髓质中KAT II基因mRNA的表达。
具体实施方式
一、材料与方法 1.1材料
l丄l实验动物取16周龄雄性WKY和SHR大鼠各6只(上海市 高血压研究所提供)。实验前使用POWER LAB分析系统(AD instrument co. ltd)分别测量大鼠尾部血压，SHR组平均血压为174.6±25.3 mmHg, 显箸高于WKY组的平均血压118.5±7.9 mmHg， P<0.05。用代谢笼收集个体24小时尿液，SHR组平均尿量8.7±4.2 mL， WKY组平均尿量 14.4士7.9mL, P>0.05。
1.1.2主要仪器及试剂Agilent 1100系列高效液相色镨系统 (Agilent,美国)；ABI Prism 7900型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems , 美国)；Trizol (Invitrogen); SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa); L-犬尿酸、犬尿会啉酸(Sigma，美国)，醋酸钠、冰醋酸、 乙腈、高氯酸等分析纯均为实验室常备试剂。
1.2方法
1.2.1组织蛋白提取大鼠用3%的戊巴比妥麻醉立即处死。在冰 上取出肾脏组织，分离肾皮质和肾髓质。将组织放入预先加入1 mL磷 酸钾的组织裂解液中(140 mmol/L氯化钾/20 mmol/L磷酸钾pH=7.0)。 超声裂解组织，在低温离心机以12000 rpm的转速离心30分钟。取上 清液-80。C保存备用。蛋白浓度用Bradford测定法。
1.2.2 KAT活性4企测取60 jxL储存的组织蛋白，与140 (jL包含1 mol/LL-犬尿酸、0.1 mol/Lct-酮戊二酸和0.1 mol/L磷酸吡喷酪混合均 匀，在37。C孵育15分钟。使用反应终止液100 mL 10°/。的三氯乙酸终 止反应。再用冷冻型离心机在4。C下以13000rpm的转速离心30分钟。 取上清液100 (xL进样，空白对照在冰上孵育15分钟。液相色i普检测 条件流动相10 mmol/L醋酸钠緩冲液(Ph-4.5)和乙腈，体积比为95:5; 激发波344nm，发射波398nm;走样时间15 min。仪器自动积分计算 曲线下面积，计算被测样品KYNA含量。酶活性计算方法最终产物 量除以反应时间以及反应体系中的总蛋白质的含量，即为酶的活性， 酶活性的单位是(xmol g"min"。1.2.3尿中KYNA含量测定取24小时尿样0.1 mL加入1.5 mL Eppendorf中，加入0.9 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液，振荡器上充分混合， 然后静止5 min,用冷冻型离心^/l在4。C以13000 rpm的转速离心25 min。取上清液10(iL进样。液相色语检测条件同1.2.2。
1.2.4 RNA提取和cDNA合成以Trizol抽提组织总RNA。用随 机引物合成cDNA第一链。引物设计p-actin的上游引物为 5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3', 下 游 引 物 为 5'-TCATCGTACTCCTGCTTGCT-3'; 目的基因上游引物为 5'-TGGAGAACGGAAGCA誦3' , 下 游 引 物 为 5'-TTCGTTGGGTGAGTAGTTG誦3'。
1.2.5实时定量PCR:采用ABI Prism 7900型高通量荧光定量PCR 仪，PCR反应条件95。C预变性10分钟，95。C变性15秒，6(TC延伸 l分钟，共40个循环；每例样品均设3个平行复孔取均值。依据荧光 (SYBR Green)反应曲线应用ACt法分析样本目的基因与内参基因 (卩-actin)表达的差异，其中Ct值为每个反应管内荧光信号到达设定阈 值时所经历的循环数，ACt为KATII基因Ct值与p-actin基因Ct值的 差值。根据理想状态PCR呈线性扩增的原理，采用2-Aa计算目的基 因表达相对于内参照基因变化的倍数。
1.2.6统计学方法实验数据用均数士标准误表示。用SPSS11.5统 计软件，以nt睑分析各组之间的差异，以PO.05为差异有显著性。
二、结果
1.肾皮质和肾髓质中KAT活性的变化KAT活性测定是反映其 基因功能的最终有效指标。如图1A和1B所示，HPLC^r测结果显示，SHR大鼠肾皮质中KAT的活性为0.563士0.037(amolg"min",低于相同 周龄的WKY大鼠1.037±0.131 ,1 g"min" (P=0.017);而肾髓质中 KAT的活性在SHR和WKY两组之间无显著差异(SHR组1.106±0.142 pmolg"min"， WKY组1.334±0.388 pmol g-1 min"; P=0.549)。
2. 尿中KYNA含量的变化外周组织产生的KYNA最终经肾脏 由尿排除，因此检测了尿中KYNA的含量。如图2所示，SHR大鼠尿 中KYNA的含量明显低于WKY大鼠(7.77士1.75 jamol/24h vs 19.93±3.54 |Limol/24h), P=0.013。
3. 肾皮质中KAT活性及尿中KYNA含量与血压的关系如图3A 和3B所示，肾皮质中KAT活性与血压呈负相关(r-0.418; P-0.023); 尿中KYNA含量与血压呈负相关(F0.723; P=0.001)。
4. 肾皮质和肾髓质中KAT II基因mRNA表达的变化为进一步 确定KAT活性的变化是否与基因的表达改变有关，采用实时荧光定量 (SYBR Green) RT-PCR检测KAT II基因mRNA表达结果显示(如图4A 和4B所示)，肾皮质和肾髓质中KATII基因水平在SHR与WKY大鼠 两组间比较均无显著差异。SHR大鼠肾皮质表达量为0.267±0.057,与 WKY大鼠0.316±0.055比较，P-0.556; SHR大鼠肾髓质表达量为 2.341±0.625,与WKY大鼠3.592±U98比较，P=0.338。
三、分析
KAT催化KYN生成KYNA是KYN代谢过程中的一个限速步骤， KAT的两种亚型KAT I和KAT II均在肾脏中存在。研究发现KAT II 基因在肾脏和肝脏转录水平最高(Yu P， Mosbrook DM, Tagle DA. Genomic organization and expression analysis of mouse kynurenine
7aminotransferase II， a possible factor in the pathophysiology of Huntington's disease. Mamm Genome. 1999,10:845-52)。 KAT II是生成 KYNA的主要的酶，且在肾脏活性最高，KAT I在肝脏中活性最高， 在肾脏中发挥的作用只相当于KAT II的1/15 (Okuno E, Nishikawa T, Nakamura M. Kynurenine aminotransferases in the rat. Localization and characterization. Adv Exp Med Biol. 1996;398:455-64)。用定量PCR方法 检测KATII基因在肾皮质和肾髓质中的转录水平，发现虽然肾髓质中 该基因转录水平高于肾皮质；但在SHR与WKY大鼠之间无显著差别。 KAT基因水平变化并不能完全代表其蛋白水平或酶活性的变化。本实 验进一步测定了肾皮质和肾髓质中KAT活性，发现SHR大鼠肾皮质 酶活性低于WKY大鼠，且肾皮质中KAT酶活性与血压呈负相关，这 表明SHR大鼠肾皮质酶活性降低导致肾KYNA生成减少可能与血压的 变化存在某种联系。KYNA是N-甲基-D-天冬氨酰基 (N-methyl-D-aspartate NMDA)受体的拮抗剂，在中枢神经系统可能是通 过作用于延髓头端腹外侧区(Rostral ventrolateral medulla, RVLM)血压 中枢调控区NMDA受体发挥血压调节作用(Kapoor V， Kapoor R, Chalmers J. Kynurenic acid, an endogenous glutamate antagonist, in SHR and WKY rats: possible role in central blood pressure regulation. Clin Exp Pharmacol Physiol 1994;21:891-896; Chiarugi A, Carpenedo R， Molina MT， et al. Comparison of the neurochemical and behavioral effects resulting from the inhibition of kynurenine hydroxylase and/or kynureninase. J Neurochem 1995;65:1176-1183; Mizutani K， Sugimoto K, Okuda T， et al. Kynureninase is a novel candidate gene for hypertension in spontaneously hypertensive rats. Hypertens Res 2002;25:135-140), NMDA 受体除了在中枢神经系统表达外也在外周组织表达，其在外周组织既
8可以和该受体拮抗剂结合，也可以和甘氨酸、D-丙氨酸和D-丝氨酸等 所有脑内该受体的激动剂结合。缺血/再灌注损伤能够上调NMDA受体 亚型在肾脏的表达，损伤肾小球和肾小管的功能，NMDA受体拮抗剂 可以减轻缺血/再灌注对肾脏功能的损伤(Yang CC, Chien CT， Wu MH， et al. NMDA Receptor Blocker Ameliorates Ischemia/Reperflision-Induced Renal Dysfunction in Rat Kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 ; 13)，这表明NMDA受体拮抗剂在肾脏损伤中可能参与了对肾脏的保 护作用。中枢神经系统中产生的KYNA几乎不能if过血脑屏障，外周 组织产生的KYNA主要经过肾小管分泌排出体外。因此在无法检测组 织KYNA情况下，测定尿中KYNA可以间接反映组织的KYNA的生 成。发现SHR大鼠尿中KYNA含量明显低于WKY大鼠的，且尿中 KYNA含量与血压成负相关，这表明肾皮质KAT酶活性的降低导致肾 KYNA生成减少，最终使尿中KYNA排除减少，这表明体内KYNA 含量变化与血压调节之间存在联系。
综上所述,通过研究发现SHR大鼠肾脏中KAT活性及尿中KYNA 含量均低于同龄WKY大鼠的，且肾皮质中KAT活性及尿中KYNA含 量均与血压呈显著负相关，这表明除中枢KAT和/或KYNA代谢外， SHR大鼠外周组织KAT活性降低导致KYNA生成减少对血压产生影 响。
权利要求
1、犬尿氨酸氨基转移酶在制备治疗高血压病的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，具体涉及犬尿氨酸氨基转移酶的用途，尤其涉及犬尿氨酸氨基转移酶在制备治疗高血压病的药物中的用途。
文档编号A61K38/43GK101670099SQ200810042800
公开日2010年3月17日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者怡 张, 朱鼎良, 高平进 申请人:上海市高血压研究所