专利名称：一种治疗眼睛疾病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物，该药物可以用于眼睛疾病的治疗，，属于药物用途技 术领域。
背景技术：
眼部角膜疾病造成的致盲被排在世界上严重眼科疾病最普遍因素的第二 位。在美国，角膜疾病被排在白内障、黄斑退行性病变和青光眼之后成为眼科 疾病的第四大病因。就眼球的生理学角度来看，角膜需要保持透明才能完成它 的屈光和光线的传递功能。由于感染(如疱疹感染)、炎症(如角膜烧伤)、新 的血管形成、退化、外科手术(如白内障手术)等造成的角膜损伤是非常普遍 的现象。机体存在对这些损伤的一般的恢复性反应(如炎性细胞的浸润和新的 血管翳的形成)，导致了角膜的变厚和疤痕的形成。
不幸的是，这些变化损害了角膜正常的光线的传递功能，从而导致视力 减弱和致盲，这是临床眼科角膜疾病中非常普遍的问题。目前临床上还没有针 对这种炎症反应、尤其是新的血管翳形成的有效的治疗手段(世界上曾有临床 上用TFN-ci治疗老年性视网膜黄斑退行性病变和脉络膜血管翳形成的报道，但 结果令人失望)"。因此，有必要开发一种针对各种眼科损伤所引起的自身修复 性反应过程中出现的炎性细胞浸润和血管翳形成所造成的角膜损伤的有效治疗 手段。
过敏性结膜炎(Conjunctivitis, AC)是一种沿着眼睑和外眼球的粘膜发生的特异性炎症。在美国每年有超过4千万人受到该疾病的影响。患过敏性结膜炎 的患者由于是对正常人无害的过敏原所发生的反应，而产生瘙痒和烧灼感，并 出现一些如结膜水肿、流泪、结膜充血和眼睑水肿的临床体征。过敏性结膜
炎的临床诊断主要是根据疾病史和一些眼科的表现。尽管结膜刮片不常用，但 在诊断中非常有帮助，因为对于没有过敏的个体中，结膜刮片中的嗜酸性粒细 胞并不常见，所以甚至是一个嗜酸性粒细胞的发现都是一个诊断过敏性结膜炎 非常重要的有利证据，但是目前对于过敏性结膜炎有效的治疗药物，却是凤毛麟 角,因此有必要丌发一种有效的药物来帮助患者减轻痛苦,还人们一双健康,明亮 的眼睛.
白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-l receptor antagonist, IL-lRa)是从 IgG刺激后的人单核细胞培养上清液中发现的一种蛋白质，能特异性地与IL-l 受体结合，并不激活靶细胞，阻断IL-1的生物学活性1。
白介素-1 (interleukin-l,IL-l)是一种重要的细胞因子,也是免疫和炎症过程 中个重要的介质。IL-1通过将中性粒细胞动员到被损伤的组织中、激活巨嗜 细胞、刺激T细胞和B细胞的生长和分化而介导炎症。已经证实的IL-1的作用 包括通过T细胞、巨嗜细胞和一些间充质细胞增加细胞因子和化学因子的产生； 通过成纤维细胞和软骨细胞增加NO、前列腺素和胶原酶的生成；通过血管内皮 细胞增加黏附蛋白的生成以及增加组织胺和血栓素的释放s。现在已经证实，IL-l 的生物学活性与损伤角膜炎症的发生和新生血管的生成密切相关。Reza等人的 研究也表明IL-1在眼球和角膜组织的新生血管产生的过程中起着关键性的作 用。并认为眼球组织新生血管的形成是世界上造成致盲的主要病因之一。Thomas 等人认为角膜是各种类型的损伤中最容易被血管床所浸润的组织之一。在这种 炎性损伤中，炎性细胞的浸润和伴随的新生血管反应是最主要的病理过程。此，目前已经将抑制血管翳的形成作为治疗角膜损伤等疾病的主要治疗靶位。
白细胞介素-l受体拮抗剂(interleukin-l receptor antagonist, IL-lRa)能特异性 地与IL-1受体结合，并不激活靶细胞，阻断IL-1的生物学活性，从而阻断IL-1 在炎症和免疫反应发生时对中性粒细胞、脱颗粒的肥大细胞和Langerhans细胞 等炎性细胞向角膜等眼球组织的化学趋化作用和阻断IL-1对新生血管形成的刺 激作用，发挥有效的治疗作用。
目前，国内外已经有部分关于利用IL-lRa通过抑制炎症反应和血管翳治疗角 膜损伤和治疗实验性角膜移植手术后宿主排斥反应的报道6。 Angela7等人利用 大鼠角膜建立了一种新的血管生成的实验性模型，他们通过将经过bFGF或 VEGF浸润过的尼龙片植入雌性大鼠的角膜，造成了角膜血管翳的浸润性损伤， 用IL-lRa或PEG-sTNFRI连续治疗7天，结果发现经过IL-lRa的治疗降低了 山于bFGF或VEGF产生的角膜血管翳的形成，并且这种降低作ffl具有剂量依 赖性，但PEG-sTNFRI并不具有这种拮抗作用。
白晋、陈国民8等人报道了 IL-lRa抗家兔实验性角膜血管增生的研究，结 果表明利用热损伤角膜溃疡性病变，诱导角膜血管增生的模型是成功的，并 且是可靠的，重复性好，他们通过肉眼和病理观察都证实了上述结论。整个试 验数据表明rhIL-lRa有抑制角膜血管增生的作用。这也表明了 rhIL-IRa眼部 局部用药对抑制角膜血管增生是有效的，并且药效作用明显，优于肾上腺皮质 激素类药物。
近年来，已有不少的文献研究表明IL-1参与了某些眼病的病理过程，而这些 研究仅仅停留在实验的阶段，并没有用在临床上，无法从根本上证明IL-lRa对眼 睛疾病的独特效果,更不可能解决患者因为眼睛问题,而产生的痛苦,同时因为 IL-lra独特的药物性质,也让人们对他在眼睛疾病方面的治疗效果产生质疑.
发明内容
本发明针对本领域研究的缺陷和不足，结合大量的实验和各种文献的报道, 对IL-lm对角膜损伤，角膜炎症,过敏件结膜炎进行全面系统的研究，发明人创造 性的发现IL-lra具有如下的功效
1. 抑制角膜新生血管的形成；
2. 能减轻角膜烧伤后充血、水肿等炎症反应；
3. 抑制炎性细胞浸润，有利于角膜上皮细胞的再生；
4. 有利于损伤角膜透光率及透明度的恢复；
5. 可用于由于各种创伤等造成的角膜炎的治疗；
6. 对过敏等原因造成的眼结膜组织的炎性浸润有明确的抑制作用。 本发明人同时还发现IL-lra作为第一个被发现的细胞因子拮抗剂，不仅具
有治疗作用，而且副作用小、安全性高，这些特点使之有望成为治疗角膜损伤， 炎症和过敏性结膜炎的新型药物,可以广泛应用与眼睛疾病的治疗，特别是在过 敏性结膜炎和隐型眼镜方面开拓出新的市场,具有广泛的市场推广和应用价值.
本发明的目的是提供一种治疗眼睛疾病的药物，特别是治疗角膜损伤，炎症 和过敏性结膜炎的药物；
进一步阐述本发明的目的是将IL-lra用于治疗角膜损伤,炎症和过敏性结膜
炎；
本发明所说的IL-lra是通过基因工程重组的方式获得的，特别是基因重组 制得的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-lm);
具体实施例方式
实施例1:我们主要采用了曰本大耳白兔及Wistar大鼠作为受试动物，分别用碱烧 伤和激光烧伤造成角膜损伤模型，应用已通过美国FDA批准的Kineret (anakinra)与白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-lra)进行比较，评价了 IL-lra对 角膜烧伤的治疗作用。
1. 试验方法及材料
实验动物为日本大耳白兔及Wistar大鼠，雌雄均有，体重分别为1.5~2.0kg 和300 400g。碱烧伤兔随机分成六组烧伤对照组、IL-lra 25tig/ml组、50y g/ml组、100 ti g/ml组、Kineret 50 li g/ml组及正常对照组。激光烧伤兔随机分 成六组烧伤对照组、IL-lra 25 w g/ml组、50 u g/ml组、100 u g/ml组、Kineret50 yg/ml组及正常对照组。大鼠随机分成六组碱烧伤对照组、IL-lra 25 u g/ml 组、50ug/ml组、100"g/ml组、Kineret50 u g/ml组及正常对照组。日本大耳白 兔每组5只，Wistar大鼠每组5只。除正常对照组外，各实验组兔用肌肉注射速 眠新麻醉动物，取0.5mol/LNaOH 10ul滴在直径6mm滤纸片上，贴于角膜中 央，计时20s，取下，造成角膜碱烧伤模型。或用C02激光(光斑直径5mm， 照射时间为0.5s，功率密度约31.9W/cm2，能量密度约16.0J/cm2，)照射角膜， 造成角膜激光损伤。即刻起每日3次滴眼。各试验组Wistar大鼠取0.5mol/L NaOH 10"l滴在直径3mm滤纸片上，贴于角膜中央，计时15s，取下，造成角膜碱烧 伤模型。即刻起每日4次滴眼。兔于烧伤后每天进行裂隙灯观察，分别于烧伤 后7天、14天和21天取角膜，进行病理组织学观察、角膜透光率OD值测定、 离体角膜损伤斑定量分析及MTT法角膜上皮活力检测。Wistar大鼠于碱烧伤后 第2天取角膜进行白细胞介素-1 ELISA测定。
2. 结论与评价
(1)角膜裂隙灯观察结果表明，IL-lra能减轻角膜烧伤的各种炎症反应症状；抑制角膜新生血管的形成。
(2) 病理组织学观察结果表明，IL-lm可明显减轻角膜基质水肿，抑制炎性
细胞浸润，有利于角膜上皮细胞再生。
(3) OD值测定结果表明，IL-lra有利于角膜透光率的恢复
(4) 形态计量学参数统计表明，IL-lra有利于角膜透明度的恢复以及角膜烧 伤混浊斑的縮小。
(5) MTT结果表明，IL-lra对碱烧伤和激光烧伤角膜上皮细胞活性的恢复均 有明显的促进作用。
(6) IL-1ELISA测定结果表明，IL-lra对IL-1 a和e均有明显的抑制作用。
(7) 在本实验模型中，对受试药IL-lra与Kineret的疗效进行比较，结果表 明，受试药物IL-lra对角膜碱烧伤和激光烧伤的治疗作用与Kineret相近。 实施例2:
临床前一般药理学试验研究综述
本实验采用SD大鼠和昆明种小鼠对重组人白细胞介素-1受体拮抗剂滴眼液 (rhIL-lm)进行一般药理学研究。大鼠实验分高、中、低三个剂量(分别540 (ig/次、270 ng/次和135 pg/次)及空白对照(缓冲液20|il /只眼睛)共4个组， 对心血管系统、呼吸系统进行观察。结果表明IL-lRa对大鼠收縮压、舒张压、 平均动脉压、心率、心律、ECG之QRS时间、T波、ST段、呼吸频率、节律和幅 度无明显影响。小鼠实验分高、中、低三个剂量(分别sc rhIL-lRa 81.0 pg/ 次、40.5 pg/次和20.3 pg/次)及空白对照(缓冲液3W /只眼睛)共4个组， 对神经系统观察(自发活动计数和爬杆试验)，结果表明，rhIL-1Ra单次及连续 7d sc对小鼠神经系统均无明显影响。 实施例3:临床前毒理学试验综述 1.急性毒性试验研究
1. 1. rhIL-lra滴眼液对大鼠的急性毒性试验
大鼠单次以rhIL-lra滴眼液滴眼540吗/2只眼睛，观察给药后7天内动物的 中毒及死亡情况。给药后大鼠活动正常，实验中大鼠毛紧贴身有光泽,饮食、粪便 及其它情况均无异常。7天后受试动物体重均有增加，未见任何毒性反应及死亡。 表明单次以重组人白细胞介素-1受体拮抗剂滴眼液滴眼对大鼠的MTD >540 (ig/2 只眼睛，相当于推荐临床剂量的21. 6倍。
1. 2. rhIL-lra滴眼液对新西兰兔的急性毒性试验 一次性给予新西兰兔rhIL-lra滴眼液1350 jxg /次/只眼睛(浓度13. 5 mg/ml)，
连续观察7天。给药后新西兰兔活动正常，实验中新西兰兔毛紧贴身有光泽，饮 食、粪便及其它情况均无异常。7天后受试动物体重均有增加，未见任何毒性反 应及家兔死亡现象。表明单次以IL-lRa滴眼液滴眼对新西兰兔的MTD >2700 pg/2只眼睛，相当于推荐临床剂量的108倍。
2. —次性给药的眼部刺激性试验
木实验用IL-1Ra分别对高剂量组(1000^ig/次/只眼睛)、低剂量组(500 pg/ 次/只眼睛)两个剂量组新西兰兔(单侧眼睛)和自身对照侧(缓冲液0.1 m1/ 次/只眼睛)单次滴眼对眼的刺激性观察。观察7d内新西兰兔眼对受试物的刺 激反应，是否出现眼结膜充血、水肿、畏光和流泪等反应，以判定该受试物对 眼的剌激性，为临床使用剂量的确定和毒副反应监测提供依据。实验期间，还 分别观察了体重、食量及粪便等8项一般临床体征，检测了ll项血液指标、10 项血液生化指标、眼刺激评分和眼病理组织学检查。 结果如下2. 1. —般状况各剂量组新西兰兔皮毛光泽度及一般行为未见明显改变。结 果表明高剂量组和低剂量组相比，体重无明显差异(P〉0.05)。
2.2. 眼刺激评分给药后3、 6、 24、 48、 72h至7d内观察眼的局部反应， 未发现明显改变。给药后7d按评分表要求，该受试物高剂量组和低剂量组对眼 刺激性的最高分值为0.5。因最高分值<1，且无剂量依赖性，故认为该药对兔 眼无剌激性。
2.3. 血液学检测血液学各项指标未见与给药有关的改变。
2.4. 临床生化检测各组动物血液生化指标测定结果在各给药组之间相比 无明显差异(P〉0.05)，未见与给药有关的改变。
2.5. 组织病理学检查
眼睑部分区域可见睑板腺小叶，部分动物睑结膜上皮有数量不等的炎性细胞 浸润，以单核细胞(M、 L等)为主。此类病变在用药侧和自身对照侧睑结膜组 织均有发现，缺少药物剂量依赖性。
角膜结构清晰可见，未见有任何损伤性改变。用药侧与自身对照侧完全相同。 视网膜祌经节细胞及其突起、杆状和锥形细胞层、丛状层及内外限制膜清晰
可见，排列整齐，结构正常。用药侧与自身对照侧相似。
病理观察除部分动物用药侧眼睑结膜上皮细胞间质内有少许炎性细胞浸润 外，未见其他有意义的病理改变。此类病变在用药侧和自身对照侧睑结膜组织 均有发现，缺少药物剂量依赖性，用药期间动物眼局部也未发现有任何红肿或 其他异样反应。
2. 6.结论因眼刺激评分最高分值<1，且无剂量依赖性，对新西兰兔各项生 理生化指标也无明显影响，故认为该药对兔眼无剌激性。重组人白细胞介素-1 受体拮抗剂(IL-lRa)滴眼液剂量为1000 ^g/次/只眼睛(浓度10mg/ml，相当于拟临床剂量的40倍)单次给药对新西兰兔无眼刺激性。 3.多次给药的眼部刺激性试验
本实验用IL-lRa分别对高剂量组(750i!g/次/只眼睛)、低剂量组(250 pg/ 次/只眼睛)两个剂量组新西兰兔(单侧眼睛)和自身对照侧(缓冲液0.1 m1/ 次/只眼睛)连续滴眼30天对眼的剌激性观察。实验期间，分别观察了体重、 食量及粪便等8项一般临床体征，检测了ll项血液指标、IO项血液生化指标、 眼剌激评分和眼病理组织学检查。同时观察IL-1Ra经滴眼连续给予新西兰兔 30 d内眼对受试物的刺激反应，是否出现眼结膜充血、水肿、畏光和流泪等反 应，以判定该受试物对眼的刺激性，为临床使用剂量的确定和毒副反应监测提 供依据。 3. 1.结果
3. 1. 1. —般状况各剂量组新西兰兔皮毛光泽度及一般行为未见明显改变。 体重和食量与对照组比较，未见明显差异。
3. 1. 2. 眼刺激评分给药后6、 24、 48、 72h至30d内观察眼的局部反应， 未发现明显改变。于d0、 d10、 d20和d30分别按眼刺激评分表要求，该受试物 高剂量组和低剂量组对眼刺激性的最高分值为0.5。因最高分值<1，且无剂量 依赖性，故认为该药对兔眼无刺激性。
3. 1. 3. 血液学检测各组动物血细胞的变化均属在正常范围内波动。各给 药组之间各项指标均无明显差异(p>0. 05)。血液学各项指标未见与给药有关的改变。
3. 1. 4. 临床生化检测各组动物血液生化指标的变化均属在正常范围内波 动，各给药组之间相比无明显差异&>0.05)，未见与给药有关的改变。 3. 1. 5. 组织病理学检査本实验各组动物眼睑、眼球、视神经组织学方面也未见有临床意义的病理学 的变化。
3. 2.结论
因眼刺激评分最高分值<1，且无剂量依赖性，对新西兰兔各项生理生化指 标也无明显影响，故认为该药对兔眼无刺激性。重组人白细胞介素-1受体拮抗
剂(IL-1Ra)滴眼液在剂量750网/次/只眼睛(浓度7.5mg/ml，相当于拟临床 剂量的30倍)多次给药对新西兰兔无眼刺激性。
权利要求
1、一种治疗眼睛疾病的药物，其特征在于药效成分为白细胞介素-1受体拮抗剂。
2、 根据权利要求1所述的眼睛疾病包括角膜损伤，炎症和过敏性结膜炎。
3、 根据权利要求1， 2所述的治疗眼睛疾病的药物，具体特征是利用IL-lra 用于治疗角膜损伤,炎症和过敏性结膜炎。
4、 根据权利要求1 ， 2, 3所述的IL-lra是通过基因工程重组的方式获得的， 特别是基因重组制得的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-lm)。
全文摘要
本发明提供白细胞介素-1受体拮抗剂在治疗眼科疾病中的新的用途，本发明所述的新的用途是指IL-1ra在治疗角膜损伤，炎症以及白内障，角膜炎等眼科疾病中具有疗效好，见效快，生物利用度高，性质稳定等特点。
文档编号A61P27/00GK101584856SQ200810044439
公开日2009年11月25日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者张宝华, 彭红卫, 李好雨, 伟 杨, 董兆勇, 斌 赵, 陈春会 申请人:西藏诺迪康药业股份有限公司