专利名称：辛夷挥发油鼻喷剂的制作方法
技术领域：
本发明属于中药制剂领域，是用于治疗急性、慢性鼻炎的辛夷单方制剂的鼻喷剂。
背景技术：
鼻炎是一种常见的多发性的呼吸道疾病。其发病无明显地域性、季节性、年龄、性别差异，因此一年四季、全国各地、男女老幼均可罹患鼻炎。其发病率约占人口总数的5-6％。而变应性鼻炎最常见，约占各种鼻病的30％。其发病诱因主要为细菌、病毒侵袭、花粉样物质过敏、冷空气过敏、环境污染、理化等因素。临床表现为鼻塞、流涕、呼吸不畅、鼻眼酸痒、缺氧等症状。若不及时治疗，反复发作，因缺氧可使鼻甲、鼻中隔弯曲增生、肥厚变性，严重则必须手术治疗。
随着大气污染日益加重，致使该病的发病率呈逐年上升趋势，近年来尤其明显。其发作时严重影响了人们的正常生活和工作。
鼻炎特别是过敏性鼻炎是一种常见病多发病，随着社会的及工业的发展，其发病率越来越高，而目前尚无安全、速效的治疗药物。为此，我公司经过大量的文献调研和项目筛选工作，确定木兰科植物辛夷(望春花)为研究用原药材，将其开发成治疗急性、慢性、过敏性鼻炎的新药。
辛夷治疗鼻炎的理论依据 1、辛夷挥发油成分的抗炎作用 辛夷挥发油腹腔注射能明显对抗二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和蛋清所致的大鼠足拓肿胀；对慢反应物质、组织胺、乙酰胆碱引起的豚鼠离体回肠收缩有对抗作用。
2、辛夷挥发油成分的抗炎机理 以望春花总挥发油为原料，选择不同致炎物质和动物，诱发多种急性炎症模型(醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、二甲苯致小鼠皮肤血管通透性增高、二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致小鼠足肿胀、蛋清致大鼠足肿胀、角叉菜胶致大鼠胸膜炎)，小鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型，大鼠佐剂性关节炎模型，观察了望春花总挥发油的抗炎作用。结果显示，望春花总挥发油对炎症过程中的充血、渗出、肿胀、白细胞游出及炎细胞浸润、组织坏死、肉芽组织增生等病理变化，均有抑制作用，说明望春花总挥发油具有良好的抗炎作用。其抗炎作用具有以下特点(1)通过降低磷脂酶A2的活性抑制花生四烯酸的生成和代谢，抑制酸性脂类炎症介质(如PGE2)的生成或释放。(2)不仅能抑制血管活性胺-组织胺的合成释放，还能对抗组织胺致水肿作用。(3)阻止炎症反应过程中IL-1和TNF的异常升高，减轻炎症反应对机体造成的损伤。(4)对糖皮质激素的分泌无明显影响，其抗炎作用也不依赖于肾上腺的存在。
国内外研究现状 1、辛夷临床用法的特点 (1)传统辛夷临床应用多煎汤内服，广州中一药业有限公司等公司生产的辛夷鼻炎丸剂型是丸剂(浓缩水丸)，内服药物起效慢，达到患病部位时间长，并且加重对身体排泄的负担。
(2)现在临床上有用辛夷蒸馏液滴鼻，但蒸馏液吸着能力差，且受药面积不均匀，还有辛夷挥发油单体的用法是注射液，患者不能自行给药。
(3)河南省郑州市刘葛音的发明专利“一种治疗鼻炎的药物喷剂”以辛夷挥发油、三氯叔丁醇、薄荷脑、苯甲酸钠等中西药为原料，其中含有化学药品，对人体的副作用较大。
(4)现在中药喷剂大多是复方制剂，且药材是共同提取挥发油，辛夷挥发油不能完全提取出来，对药效学的研究不够精确。
2、辛夷的化学成分 辛夷主要成分有挥发油，生物碱，木脂素类化合物等，其中指标性成分是挥发油。采用GC-MS计算机联用技术，从望春花挥发油中分离鉴定出91个成分，占总油的97.37％；玉兰挥发油中分离鉴定了71个成分，占总油的97.66％；武当玉兰挥发油中分离鉴定了88个成分，占总油的95.68％。望春花挥发油不仅含量比武当玉兰高，而且一些活性成分如1，8桉叶素、芳樟醇、樟脑、α-松油醇、金合欢醇等的含量比武当玉兰高。
发明内容
本发明提供一种辛夷挥发油鼻喷剂，以解决目前内服药物起效慢，达到患病部位时间长，并且加重对身体排泄的负担的问题。
本发明采取技术方案是它是由按下列体积份数比的原料药和辅料制成的 辛夷挥发油40～60ml，聚山梨酯80 40～60ml， 甘油20～32ml。
优选为 辛夷挥发油50ml，聚山梨酯80 50ml，甘油26ml。
本发明的制备方法是 取配方中的聚山梨酯80和甘油，加入100～500ml无水乙醇，搅拌使之溶解，在以900～1100r/min的转速搅拌下，缓缓加入辛夷挥发油后，用900～1100r/min的转速搅拌10分钟，再加入蒸馏水至定容至1000ml，经0.22μm微孔滤膜，滤过，分装。
本发明药物质量控制方法包括鉴别和含量测定方法如下 鉴别方法 (1)取本品2ml，置5ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取桉树脑对照品1ml，置100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-环己烷(1∶9)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，100℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点； (2)在桉树脑含量测定项下记录的色谱图中，供试品中桉树脑的主峰保留时间应与桉树脑对照品的主峰保留时间一致。
含量测定 总挥发油，照挥发油测定法(中国药典2005年版附录X D甲法)测定； 测定法取本品20ml，置烧瓶中，加水300ml与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸约5小时，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处为止。放置1小时以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，并计算供试品中挥发油的含量。
本品含挥发油应为标示量的90.0％～110.0％之间。
桉树脑 照气相色谱法(附录VI E)测定。
色谱条件与系统适用性试验GC-7900气相色谱仪；色谱柱为HP-519091J-413(30m*0.32mm)石英毛细管柱。FID检测器(280℃)；汽化室温度为260℃；进样口温度为220℃；升温程序柱温80℃，保持25分钟，再以20℃/min的速度升至220℃(保持3分钟)；分流比为10∶1。
对照品溶液的制备取桉树脑对照品约0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备 取本品2ml，置5ml量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法取对照品溶液和供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算，即得。
本品含桉树脑(C18H18O)不得少于1.0％(g/ml)。
本发明人针对辛夷的研究主要在化学成分、临床应用和复方制剂方面，对辛夷单味制剂的开发及抗过敏作用的研究仍停留在基础研究阶段。在借鉴古籍及国内外同类研究的基础上，探索出适合工业化生产的辛夷挥发油制备工艺及鼻喷剂剂型，并经过药理学实验证明，其具有确切的抗炎、抗过敏作用，由此开发出辛夷挥发油鼻喷剂新药。
本品为淡黄色的澄明液体，气味芳香，略有异臭。
本发明具有散风寒，通鼻窍，抗过敏。用于急性、慢性鼻炎，过敏性鼻炎，鼻窦炎，鼻塞，鼻渊，鼻流浊涕。一次喷4次，一日2次。
规格，10ml含0.5ml辛夷挥发油。
本发明主要药效学试验资料 一、实验材料 1.1药物 受试药物 名称辛夷挥发油，以下简称VOMP。
生产批号040312， 提供单位吉林省辉南天泰药业股份有限公司。
供试品配制用时以生理盐水配制所需浓度经口实验用药物为0.5％Tween-80、甘油、乙醇和水配制成的10％的药液。
保存条件室温保存 名称辛夷挥发油鼻喷剂 生产批号040401 提供单位吉林省辉南天泰药业股份有限公司 规格6ml/瓶，10％挥发油 保存条件室温保存 阳性对照药 名称曲安奈德鼻喷雾剂(毕诺) 生产批号20050203 规格6ml/瓶，每ml含曲安奈德1.1mg，每瓶120揿，每揿55μl。
生产厂家昆明源瑞制药有限公司生产 名称阿司匹林(ASP) 生产批号050327 规格0.3g/片 生长厂家陕西白鹿制药厂 名称醋酸泼尼松片(Pns) 生产批号20050620 规格5mg/片 生长厂家山东新华制药股份有限公司 名称醋酸地塞米松片(Dex) 生产批号20050413 规格0.75mg/片 生长厂家山东新华制药股份有限公司 阴性对照药 名称氯化钠注射液(NS) 生产批号050914 生产厂家山东华鲁制药有限公司 1.2试剂 冰醋酸莱阳市双双化工有限公司，批号20041115 伊文思蓝上海化学试剂采购供应站提供，批号20030306。
二甲苯莱阳市双双化工有限公司，批号20011023 磷酸组织胺上海丽珠东风生物技术有限公司出品，批号20050816 2，4-二异氰酸甲苯酯(TDI)上海试剂一厂，批号20040816。
注射用青霉素钠石药集团中诺药业有限公司，批号20051020。
角叉莱胶Sigma公司产品，批号45F-0427。
总蛋白定量测试盒南京建成生物工程研究所。
1.3仪器 LD5-2A离心机，北京医用离心机厂。
FA1004电子天平，上海天平仪器厂。
721分光光度计，上海第三分析仪器厂。
YLS-7A足趾容积测量仪，山东省医学科学院设备站。
微量加样器，德国Eppendorf公司 倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)， BX50型光学显微镜(日本OLYMPUS) FJ-2008P型自动记数器(西安二六二厂)， 1.4实验动物 Wistar大鼠，SPF级，雌雄兼有，体重180～200g；购自山东大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(鲁)20030004。
昆明种小鼠，SPF级，雄性，体重20±2g，由山东大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(鲁)2003004。
豚鼠，雌雄各半，体重300～350g，购自山东省农科院畜牧所养殖场[许可证号SCXK(鲁)20030013]。
二、辛夷挥发油经口给药后对急性炎症动物模型的影响 1.实验方法 1.1辛夷挥发油对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 取健康雄性昆明小鼠50只，按体重分层随机分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、阿司匹林(200mg/kg)组，NS组。每天灌胃给药1次，连续给药3天。末次给药后半小时，各小鼠尾静脉注射2％伊文思蓝的生理盐水溶液(0.10ml/10g体重)，同时立即腹腔注射0.6％醋酸溶液0.20ml。20分钟后脱颈椎处死动物，用6ml生理盐水冲洗腹腔。将收集的冲洗液3000rpm离心15分钟，取上清液于590nm处测定吸光度(OD值表示)，进行组间比较。
1.2辛夷挥发油对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响 取健康昆明小鼠50只，雄性，按体重随机分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、Pns(10mg/kg)组，NS组。每天灌胃给药1次，连续给药3天。末次给药后1小时，各小鼠尾静脉注射1％伊文思蓝的生理盐水(0.10ml/10g体重)，并立即在腹部脱毛区均匀涂抹4ml二甲苯(约1.5×1.5cm2)致炎。20分钟后处死动物，剥离腹部蓝斑皮肤，选蓝色最深处用打孔器(直径＝1.2cm)取下皮肤。将其剪碎后，浸泡于装有4ml丙酮水溶液(丙酮∶水＝7∶3，含0.3％无水Na2SO4)的玻璃试管中，封盖试管口。浸泡两天，每天振摇3～4次。两天后3000rpm离心15分钟，取上清液于721分光光度计590nm处比色，未浸泡过皮肤的丙酮水溶液调零，测定其吸光度，进行组间比较。
1.3辛夷挥发油对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 取健康雄性昆明小鼠50只，按体重随机均分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、Dex(5mg/kg)组，NS组。每天灌胃给药一次，连续给药3天(Dex组腹腔注射地塞米松)。末次给药后1小时，每只小鼠右耳廓两面均匀涂抹二甲苯30μl致炎，左耳不涂作对照。致炎后45min脱颈椎处死动物。用直径8mm的打孔器取下左右耳片，分别称重。以左右耳片重量差表示耳肿胀度，进行组间比较。
1.4辛夷总挥发油对角叉莱胶所致小鼠足肿胀的影响 取健康雄性昆明小鼠50只，按体重随机均分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、Pns(10mg/kg)组，NS组。每天灌胃给药一次，连续给药5天。末次给药后半小时，每只小鼠左足跖皮下注射1％角叉莱胶0.03ml致炎。致炎4小时后处死动物，各鼠齐踝关节处将两后足剪下，分别称重，以两足重量差表示肿胀程度，进行组间比较。
1.5辛夷挥发油对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响 取健康雄性Wistar大鼠50只，按体重分层随机分为5组，即VOMP高、中、低(20、10、5ml/kg)剂量组、Pns(10mg/kg)组，NS组。实验前在各鼠右后足踝关节作标记。用容积法测定大鼠右后足容积两次，取平均值作给药前正常容积。第一天给药一次，第二天灌胃给药后半小时，每只大鼠右后足跖部皮下进针至踝关节处，注射10％蛋清生理盐水溶液0.1ml致炎。分别于致炎后30、60、120、180、240、300min测定右后足容积，计算各大鼠致炎前后右后足容积变化值，以肿胀度判定药物抗炎效应，进行组间比较。
1.6辛夷挥发油对大鼠胸膜炎模型的影响 取60只健康雄性Wistar大鼠，按体重分层随机均分成6组，即VOMP高、中、低(20、10、5ml/kg)剂量组、Pns(10mg/kg)组，NS组，正常对照组。每天灌胃给药一次(NS组和正常对照组灌胃生理盐水)，连续给药7天。末次给药后1小时，除正常对照组外其余各组动物胸膜腔注射1％角叉莱胶的无菌生理盐水溶液(0.20ml/100g体重)致炎，正常对照组胸腔注射等量无菌生理盐水。
致炎后8小时，将动物放血处死。测定胸腔渗出液的量，用考马斯亮兰法测定渗出液中的蛋白质含量，并对其进行白细胞分类计数，进行组间比较。
1.7辛夷挥发油对正常小鼠炎症反应的影响 取健康雄性昆明小鼠50只，按体重随机均分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、Pns(10mg/kg)组，NS组。每天灌药一次，连续给药5天。末次给药前，用小鼠足容积测定装置测其左后足容积(取两次的平均值)。给药后半小时，每只小鼠左后足跖皮下注射0.2％磷酸组织胺生理盐水溶液0.03ml致炎。在致炎后30、60、90和120min分别测定小鼠炎症足容积，计算肿胀度，进行组间比较。
1.8辛夷挥发油对去肾上腺小鼠炎症反应的影响 取雄性昆明小鼠50只，按体重随机均分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、Pns(10mg/kg)组，NS组。在无菌条件下，手术摘除小鼠两侧肾上腺。术后肌注青霉素3天抗感染，并以糖盐水代替自来水饲养。手术后一周开始给药，每天一次，连续5天。按1.7方法进行致炎，测定致炎前后小鼠足容积，计算足肿胀度，进行组间比较。
2.实验结果 2.1辛夷挥发油对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 试验结果表明，VOMP中、高剂量能显著降低伊文思蓝吸光度，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)，且呈一定的量效关系。阿司匹林对照组亦能显著降低伊文思蓝吸光度，结果见表1。
表1.VOMP对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(n＝10，X±SD)
注与NS对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.2辛夷挥发油对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响 试验结果表明，VOMP中、高剂量能剂量依赖性的显著降低吸光度值，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)。Pns对照组亦能显著降低伊文思蓝吸光度值，结果见表2。
表2.VOMP对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响(n＝10，X±SD)
注与NS对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.3辛夷挥发油对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 试验结果表明，辛夷挥发油中、高剂量均能使耳片肿胀度下降，与NS组比较有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，且呈量效依赖性。Dex对照组亦能显著降低耳片肿胀度，结果见表3。
表3.VOMP对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响(n＝10，X±SD)
注与NS对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.4辛夷总挥发油对角叉莱胶所致小鼠足肿胀的影响 试验结果表明，VOMP各剂量均能显著降低足跖肿胀度，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)，其中尤以VOMP高剂量降低足跖肿胀度效果显著。Pns对照组亦能显著降低足跖肿胀度，结果见表4。
表4.VOMP对角叉莱胶所致小鼠足跖肿胀的影响(n＝10，X±SD)
注与NS对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.5辛夷挥发油对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响 试验结果表明，VOMP高剂量在致炎后30～300min能显著降低足跖肿胀度，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.01)，VOMP中剂量在致炎后180～300min能显著降低足跖肿胀度(P＜0.01)。Pns对照组在致炎后亦能显著降低足跖肿胀度，结果见表5。
表5.VOMP对大鼠蛋清致足跖肿胀的影响(n＝10，X±SD)
注与NS对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.6对大鼠胸膜炎模型的影响 试验结果表明，模型对照组大鼠胸腔渗出量、渗出液中的蛋白质含量和白细胞总数，均显著高于正常对照组，且中性粒细胞比例明显升高，呈典型急性炎症表现，说明胸腔注射角叉莱胶引起大鼠胸膜炎，造模成功。
试验结果表明，VOMP高剂量在致炎后能显著降低渗出液中白细胞总数，减少胸腔渗出液的量，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.01)，其中VOMP中剂量在致炎后能明显减少渗出液中的蛋白质含量和白细胞总数(P＜0.01)。Pns对照组在致炎后亦减少渗出液中的蛋白质含量和白细胞总数，抑制渗出，结果见表6。
表6 VOMP对大鼠胸膜炎渗出液总量、蛋白含量及白细胞数量的影响(n＝10，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.7辛夷挥发油对正常小鼠炎症反应的影响 试验结果表明，VOMP高剂量在致炎后60～150min能显著降低正常小鼠足肿胀度，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.05)，VOMP中剂量在致炎后30min能显著降低正常小鼠足跖肿胀度(P＜0.05)。Pns对照组在致炎后亦能显著降低足肿胀度，结果见表7。
表7.VOMP对组胺所致正常小鼠足肿胀的影响(n＝10，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.8辛夷挥发油对去肾上腺小鼠炎症反应的影响 试验结果表明，VOMP高剂量在致炎后30～150min能显著降低去肾上腺小鼠足肿胀度，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，VOMP中剂量在致炎后90～150min亦能显著降低去肾上腺小鼠足肿胀度(P＜0.05或P＜0.01)。Pns对照组在致炎后能显著降低足肿胀度，结果见表8。
表8.VOMP对组胺所致去肾上腺小鼠足肿胀的影响(n＝10，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 3.结论 3.1辛夷挥发油对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高有明显抑制作用。
3.2辛夷挥发油对二甲苯所致小鼠皮肤毛细管通透性增加有明显抑制作用。
3.3辛夷挥发油能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀。
3.4辛夷挥发油对角叉莱胶引起的小鼠足跖肿胀有显著抑制作用。
3.5辛夷挥发油对蛋清引起的大鼠足肿胀呈现明显的抑制效应。
3.6辛夷挥发油能减少角叉莱胶所致大鼠胸膜炎的渗出液的量，减少渗出液中的蛋白质含量及白细胞总数。
3.7辛夷挥发油能明显减轻组胺致正常小鼠和去肾上腺小鼠足肿胀，提示辛夷挥发油的抗炎作用不依赖于肾上腺的存在。
三、对慢性炎症动物模型(棉球肉芽肿)的影响 1.实验方法 取健康雄性昆明小鼠50只，按体重随机均分为5组，即VOMP高、中、低(30、15、7.5ml/kg)剂量组、Dex(5mg/kg)组，NS组。给药当天(Dex组腹腔注射地塞米松)，无菌条件下手术，在小鼠腋窝部皮下植入一个10mg灭菌棉球。术后肌注青霉素2次抗感染。每天给药一次，连续给药7天后处死动物，剥离带肉芽组织的棉球，60℃烘箱内烘12小时后称重，按下式计算肉芽重量，进行组间比较。
肉芽重量＝带肉芽组织的棉球重量-棉球原始重量 2.实验结果 试验结果表明，辛夷挥发油中、高剂量均能使肉芽组织重量下降，与NS组比较有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其中尤以VOMP中剂量减少肉芽组织重量的作用最强。Dex对照组亦能显著降低肉芽组织重量，结果见表9。
表9.VOMP对小鼠棉球肉芽组织增生的影响(n＝10，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 3.结论 辛夷挥发油对小鼠棉球肉芽组织增生有显著抑制作用 四、辛夷挥发油对大鼠佐剂性关节炎的影响 1.实验方法 按文献方法自制完全Freund’s佐剂。取健康雄性Wistar大鼠120只，即VOMP高、中、低(20、10、5ml/kg)剂量组、Dex(5mg/kg)组，NS组。每天给药一次，连续3次，第三次给药前测定大鼠右后足正常容积(取两次平均值)，给药后每只大鼠右后足跖部皮内注射Freund’s佐剂0.1ml致敏。致敏后8小时再给药一次，并在18小时测定右后足容积，计算致敏后肿胀度(肿胀度＝致敏后足容积-致敏前足容积)[6]，进行组间比较。
2.实验结果 试验结果表明，VOMP高剂量在致敏后18小时能显著降低足肿胀度，与NS组相比，有显著性差异(P＜0.05)。Dex对照组在致敏后18小时亦能明显降低足肿胀度，结果见表10。
表10.VOMP对大鼠佐剂性关节炎足肿胀的影响(n＝10，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 3.结论大剂量辛夷挥发油对弗氏佐剂所致的原发性足跖肿胀有明显抑制作用。
五、VOMP鼻喷剂对动物实验性过敏性鼻炎的治疗作用 1.实验方法 1.1对大鼠过敏性鼻炎的治疗作用 取健康大鼠70只，适应性喂养3天，按照体重、性别分层随机分为两组。第一组为造模组(60只)，将10％的TDI橄榄油溶液10μl，用加样器滴入大鼠双前侧鼻孔(每侧5μl)，每日一次，连续7天致敏。7天后改为隔日给予TDI(维持期)，连续14天。第二组为正常对照组(10只)，单纯使用橄榄油滴鼻，方法同上。从致敏第3天起，隔日一次定时观察给TDI或橄榄油后30分钟内的鼻部症状，连续观察3次，根据表1评分，平均分超过5分为造模成功。
选出造模成功的动物，根据症状分值、体重、性别分层，随机分为四组，分别为模型对照组、毕诺对照组和VOMP鼻喷剂高、中、低剂量组，每组10只动物。维持期(即首次致敏7天后)每天鼻喷给予相应药物，NS对照组和模型对照组鼻喷生理盐水，除VOMP鼻喷剂高、低剂量每天给药4次和1次外，其余各组每天给药2次，每揿50μl，连续给药14天。从致敏第9天(即给药第2天)开始，于给药后30分钟内观察鼻部症状，隔日观察一次，并按照表11进行评分，观察结束后经甲苯胺蓝染色计数5个高倍视野鼻粘膜固有层内肥大细胞，进行组间比较。
表11.TDI诱发模型动物鼻超敏反应鼻部症状评分标准
1.2对豚鼠过敏性鼻炎的治疗作用 取健康豚鼠48只，适应性喂养3天，按照体重、性别分层随机分为两组。第一组为造模组(40只)，将10％的TDI橄榄油溶液10μl，用加样器滴入大鼠双前侧鼻孔(每侧5μl)，每日一次，连续7天致敏。7天后改为隔日给予TDI(维持期)，连续14天。第二组为正常对照组(10只)，单纯使用橄榄油滴鼻，方法同上。从致敏第6天起，每日观察给TDI或橄榄油后30分钟内的鼻部症状，连续观察2天，根据表11评分，平均分超过5分为造模成功。
选出造模成功的动物，根据症状分值、体重、性别分层，随机分为四组，分别为模型对照组、毕诺对照组和VOMP鼻喷剂高、中、低剂量组，每组8只动物。维持期(即首次致敏7天后)每天鼻喷给予相应药物，NS对照组和模型对照组鼻喷生理盐水，除VOMP鼻喷剂高、低剂量每天给药4次和1次外，其余各组每天给药2次，每揿50μl，连续给药1 4天。从致敏第9天(即给药第2天)开始，于给药后30分钟内观察鼻部症状，隔日观察一次，并按照表1进行评分，观察结束后经甲苯胺蓝染色计数5个高倍视野鼻粘膜固有层内嗜酸性粒细胞，进行组间比较。
2.试验结果 2.1 VOMP鼻喷剂对大鼠实验性过敏性鼻炎的治疗作用 2.1.1大鼠实验性过敏性鼻炎症状评分 模型对照组在第1次给TDI后，10min内均不同程度出现了鼻痒和喷嚏的症状，但无明显清涕，随着时间延长，上述症状逐渐加重并出现清涕。典型的鼻痒、喷嚏和清涕出现于给TDI 5天后。
药物治疗后，VOMP鼻喷剂各剂量组在给药后第1～4天与模型对照组无明显差异，给药6天后VOMP鼻喷剂高、中剂量组鼻炎症状开始明显减轻，其症状评分与模型对照组相比有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)(表13)。毕诺对照组在给药4天后亦能明显减轻鼻炎症状，结果见表12。
表12.VOMP鼻喷剂对大鼠实验性过敏性鼻炎症状评分(n＝10，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.1.2鼻粘膜肥大细胞计数 鼻粘膜经甲苯胺蓝染色显示，模型对照组大鼠鼻粘膜同有层内肥大细胞清晰可见，细胞数目比正常对照组相比明显增多，且有显著性差异(P＜0.01)；VOMP鼻喷剂高、中剂量组肥大细胞数目与模型对照组相比明显减少，其差异有显著性统计学意义(P＜0.01)；毕诺对照组肥大细胞数目亦明显少于模型对照组(P＜0.01)，结果见表13。
表13.VOMP鼻喷剂对大鼠实验性过敏性鼻炎浸润细胞数的影响(n＝10 X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.2 VOMP鼻喷剂对豚鼠过敏性鼻炎的治疗作用 2.21豚鼠过敏性鼻炎症状评分 试验结果表明，模型对照组在给TDI 5天后出现典型的鼻痒、喷嚏和清涕空白对照组无明显的鼻痒、喷嚏和清涕。药物治疗后，VOMP鼻喷剂各剂量组在给药后第1～3天与模型对照组无明显差异，给药3天后VOMP鼻喷剂高、中剂量组豚鼠鼻炎症状开始明显减轻，其症状评分与模型对照组相比有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)。毕诺对照组在给药2天后开始减轻鼻炎症状(P＜0.05)，到给药第6天后症状明显减轻(P＜0.01)，结果见表14。
表14.VOMP鼻喷剂对豚鼠实验性过敏性鼻炎症状评分(n＝8，X±SD)
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 2.2.2鼻粘膜嗜酸性粒细胞计数 鼻粘膜经甲苯胺蓝染色显示，模型对照组豚鼠假复层纤毛状上皮被覆的粘膜处，固有膜内可见明显嗜酸性粒细胞浸润，细胞数目较正常对照组相比明显增多，且有显著性差异(P＜0.01)；VOMP鼻喷剂高、中剂量组细胞数目与模型对照组相比明显减少，其差异有显著性统计学意义(P＜0.01)；毕诺对照组细胞数目亦明显少于模型对照组(P＜0.01)，结果见表15。
表15.VOMP鼻喷剂对豚鼠实验性过敏性鼻炎浸润细胞数的影响
注与模型照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01 3.结论 3.1辛夷挥发油鼻喷剂能明显减少实验性过敏性鼻炎大鼠鼻部症状分值，能减轻鼻部鼻痒、喷嚏、清涕等症状，亦能减少肥大细胞在炎症局部的浸润。
3.2辛夷挥发油鼻喷剂能明显减少实验性过敏性鼻炎豚鼠鼻部症状分值，能减轻鼻部鼻痒、喷嚏、清涕等症状，亦能减少嗜酸性粒细胞在炎症局部的浸润。
六、评价与结论 过敏性鼻炎是一种常见病多发病，随着社会的变革，工业的发展，其发病率越来越高，而目前尚无安全、速效的治疗药物。本文研究了辛夷挥发油鼻喷剂对过敏性鼻炎的治疗作用，首先在多种急性炎症动物模型(醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、二甲苯致小鼠皮肤血管通透性增高、二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉莱胶致小鼠足肿胀、蛋清致大鼠足肿胀、角叉莱胶致大鼠胸膜炎)、小鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型、大鼠佐剂性关节炎(免疫性炎症)模型，观察了VOMP经口给药的抗炎作用。在大鼠过敏性鼻炎模型、豚鼠过敏性鼻炎模型上观察了辛夷挥发油鼻喷剂对过敏性鼻炎的治疗作用。研究结果表明，辛夷挥发油可通过降低炎症组织的血管通透性，抑制炎症组织的体积膨胀和重量增加，抑制肉芽组织增生，缓解局部过敏症状，减少嗜酸性粒细胞和肥大细胞在炎症局部的浸润等途径发挥其抗炎抗过敏作用，可在过敏性鼻炎的急性期和后期使用。
急性毒性实验 1、小鼠急性毒性实验 辛夷挥发油鼻喷剂灌胃给药后动物毒性反应及中毒死亡时间多在给药后当天。小鼠灌胃单次给药的LD50为13.6ml/kg，95％可信区间为10.38～15.30ml/kg。
2、兔急性毒性实验 辛夷挥发油鼻喷剂鼻腔粘膜喷入给药后动物毒性反应仅表现为鼻分泌物增多，给药后即刻出现。以最大给药量，即12h连续给药24次，每半小时一次，每次50μl，给药后动物无死亡，无严重毒性反应症状。
重复给药毒性实验 1、兔鼻喷重复给药毒性实验 以新西兰大白兔为受试动物，辛夷挥发油鼻喷剂对兔喷鼻给药一个月，给药剂量分别为高剂量组和溶媒对照组每天8次，低剂量组每天4次，每次50ul，连续一个月。停药后24h、7天每组分别处死3只动物。
给药后一般反应高剂量组给药后受试动物出现咳嗽、躁动不安、抓鼻现象，约2h后恢复正常。低剂量组个别动物偶尔有咳嗽、躁动不安、抓鼻现象，但很快恢复正常，无哮喘、窒息等局部刺激症状。溶媒对照组一般状况良好，无咳嗽、窒息、躁动不安、抓鼻等现象。各组受试动物摄食、饮水正常。
病理解剖与组织病理学检查给药结束后24h及恢复7天后各组处死动物的鼻粘膜、气管、支气管、肺组织均无异常改变。
结论以新西兰大白兔为受试动物，辛夷挥发油鼻喷剂对兔喷鼻给药一个月，在不超过每天喷鼻8次(每次50ul)条件下，对兔鼻腔及呼吸道粘膜无明显毒性作用。
2、大鼠重复灌胃给药毒性实验 以大鼠为受试动物，辛夷挥发油鼻喷剂灌胃给药，给药剂量分别为6、4、2ml/kg，每周连续给药7天，共连续给药5周；于末次给药后每组处死10只动物；余留继续观察2周，然后处死。所观察内容按计划书要求进行。
给药后一般反应大鼠灌胃给予辛夷挥发油鼻喷剂1个月，高剂量组动物的毒性表现主要为低伏、运动失调、俯卧等症状；中剂量组症状同高剂量组，但出现症状动物数及症状持续时间均低于高剂量组；低剂量组仅个别动物出现上述症状，但很快恢复正常。实验过程中各组大鼠摄食量、饮水量及体重无显著差别。
血液细胞学及血液生化学各给药组动物的血液学指标、血生化指标与对照组比较，均未发现明显的与药物作用有关的异常改变。
病理解剖与组织病理学检查实验过程中死亡动物尸检肉眼未见明显异常，估计可能由于操作不当导致大鼠死亡。给药结束时解剖，各组动物脏器大体外观检查均未发现肉眼可见明显改变，病理组织学检查肾脏发生病变，且高、中剂量组病变程度与剂量相关。经2周恢复期后上述改变基本恢复正常。给药结束后，高、中剂量组大鼠肝脏脏器系数显著高于对照组，且恢复期结束时高剂量组脏器系数仍高于对照组。根据本实验条件及结果，推测大鼠灌胃给予辛夷挥发油鼻喷剂毒性靶器官可能是肾脏和肝脏。
本实验条件下，大鼠灌胃给予辛夷挥发油鼻喷剂1个月的无毒性反应剂量为2ml/kg，有毒性反应剂量为4ml/kg。结果提示，经口给药辛夷挥发油对大鼠毒性较大。
五、局部刺激性实验 1、辛夷挥发油鼻喷剂鼻部刺激性实验 为考察辛夷挥发油鼻喷剂对家兔鼻局部的刺激性，在家兔鼻部喷入受试物50ul，每天2次，连续给药7天。结果表明辛夷挥发油鼻喷剂对家兔鼻部无刺激性。
2、辛夷挥发油鼻喷剂眼部刺激性实验 为考察辛夷挥发油鼻喷剂对家兔眼局部的刺激性，在家兔左眼滴入50ul的辛夷挥发油鼻喷剂，每日3次，连续给药4周，结果表明辛夷挥发油鼻喷剂对眼局部有轻度刺激性，但在给药24小时后结膜充血、水肿症状可消失，无分泌物。
综上，对辛夷挥发油鼻喷剂药效学、安全性研究表明，辛夷挥发油鼻喷剂局部鼻喷用药安全、对过敏性鼻炎治疗有效。
具体实施例方式 辛夷挥发油生产方法可采用现有技术进行制备，本发明举例如下 采用水蒸气蒸馏法、油水分离等工艺从辛夷中提取挥发油制成单方制剂，而现有产品均为复方制剂。取辛夷花蕾，粉碎，过二十目筛，加入至水蒸气蒸馏釜中，以药材重量比例加入10％的水进行湿润，然后通入水蒸气，控制蒸汽压力为0.1Mpa，连续蒸馏10h。油水分离后挥发油加入10％(重量比)无水CaC12干燥剂干燥过滤即得挥发油。
实施例1 它是由按下列体积份数比的原料药和辅料制成的 辛夷挥发油40ml，聚山梨酯80 40ml， 甘油20ml。
本发明的制备方法是 取配方中的聚山梨酯80和甘油，加入100ml无水乙醇，搅拌使之溶解，在以900r/min的转速搅拌下，缓缓加入辛夷挥发油后，用900r/min的转速搅拌10分钟，再加入蒸馏水至定容至1000ml，经0.22μm微孔滤膜，滤过，分装。
实施例2 辛夷挥发油50ml，聚山梨酯80 50ml，甘油26ml。
本发明的制备方法是 取配方中的聚山梨酯80和甘油，加入300ml无水乙醇，搅拌使之溶解，在以1000r/min的转速搅拌下，缓缓加入辛夷挥发油后，用1000r/min的转速搅拌10分钟，再加入蒸馏水至定容至1000ml，经0.22μm微孔滤膜，滤过，分装。
实施例3 辛夷挥发油60ml，聚山梨酯80 60ml， 甘油32ml。
本发明的制备方法是 取配方中的聚山梨酯80和甘油，加入500ml无水乙醇，搅拌使之溶解，在以1100r/min的转速搅拌下，缓缓加入辛夷挥发油后，用1100r/min的转速搅拌10分钟，再加入蒸馏水至定容至1000ml，经0.22μm微孔滤膜，滤过，分装。
本发明药物质量控制方法包括鉴别和含量测定方法如下 鉴别方法 (1)取本品2ml，置5ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取桉树脑对照品1ml，置100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-环己烷(1∶9)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，100℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点； (2)在桉树脑含量测定项下记录的色谱图中，供试品中桉树脑的主峰保留时间应与桉树脑对照品的主峰保留时间一致。
含量测定 总挥发油，照挥发油测定法(中国药典2005年版附录X D甲法)测定； 测定法取本品20ml，置烧瓶中，加水300ml与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸约5小时，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处为止。放置1小时以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，并计算供试品中挥发油的含量。
本品含挥发油应为标示量的90.0％～110.0％之间。
桉树脑照气相色谱法(附录VI E)测定。
色谱条件与系统适用性试验GC-7900气相色谱仪；色谱柱为HP-519091J-413(30m*0.32mm)石英毛细管柱。FID检测器(280℃)；汽化室温度为260℃；进样口温度为220℃；升温程序柱温80℃，保持25分钟，再以20℃/min的速度升至220℃(保持3分钟)；分流比为10∶1。
对照品溶液的制备取桉树脑对照品约0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备 取本品2ml，置5ml量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法 取对照品溶液和供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算，即得。
本品含桉树脑(C18H18O)不得少于1.0％(g/ml)。
权利要求
1、一种辛夷挥发油鼻喷剂，其特征在于它是由按下列体积份数比的原料药和辅料制成的
辛夷挥发油40～60ml，聚山梨酯80 40～60ml，
甘油20～32ml。
2、如权利要求1所述的辛夷挥发油鼻喷剂，其特征在于它是由按下列体积份数比的原料药和辅料制成的
辛夷挥发油50ml，聚山梨酯80 50ml，甘油26ml。
3、如权利要求11所述的辛夷挥发油鼻喷剂的制备方法，其特征在于包括下列步骤
取配方中的聚山梨酯80和甘油，加入100～500ml无水乙醇，搅拌使之溶解，在以900～1100r/min的转速搅拌下，缓缓加入辛夷挥发油后，用900～1100r/min的转速搅拌10分钟，再加入蒸馏水至定容至1000ml，经0.22μm微孔滤膜，滤过，分装。
4、如权利要求1或2所述的药物的质量控制方法，该方法中的鉴别方法包括
(1)取本品2ml，置5ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取桉树脑对照品1ml，置100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版附录IV B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-环己烷(1∶9)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，100℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(2)在桉树脑含量测定项下记录的色谱图中，供试品中桉树脑的主峰保留时间应与桉树脑对照品的主峰保留时间一致。
5、如权利要求1或2所述的药物的质量控制方法，该方法中的含量测定方法包括
总挥发油，照挥发油测定法(中国药典2005年版附录X D甲法)测定；
测定法 取本品20ml，置烧瓶中，加水300ml与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸约5小时，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处为止。放置1小时以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，并计算供试品中挥发油的含量。
本品含挥发油应为标示量的90.0％～110.0％之间。
桉树脑 照气相色谱法(附录VI E)测定。
色谱条件与系统适用性试验GC-7900气相色谱仪；色谱柱为HP-519091J-413(30m*0.32mm)石英毛细管柱。FID检测器(280℃)；汽化室温度为260℃；进样口温度为220℃；升温程序柱温80℃，保持25分钟，再以20℃/min的速度升至220℃(保持3分钟)；分流比为10∶1。
对照品溶液的制备 取桉树脑对照品约0.25g，精密称定，置50ml量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本品2ml，置5ml量瓶中，加无水甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法 取对照品溶液和供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算，即得。
本品含桉树脑(C18H18O)不得少于1.0％(g/ml)。
全文摘要
本发明涉及一种辛夷挥发油鼻喷剂，属于中药制剂领域。它是由按下列体积份数比的原料药和辅料制成的辛夷挥发油 40～60ml，聚山梨酯80 40～60ml，甘油20～32ml。制备方法是取配方中的聚山梨酯80和甘油，加入100～500ml无水乙醇，搅拌使之溶解，在以900～1100r/min的转速搅拌下，缓缓加入辛夷挥发油后，用900～1100r/min的转速搅拌10分钟，再加入蒸馏水至定容至1000ml，经0.22μm微孔滤膜，滤过。本发明具有散风寒，通鼻窍，抗过敏。用于急性、慢性鼻炎，过敏性鼻炎，鼻窦炎，鼻塞，鼻渊，鼻流浊涕。一次喷4次，一日2次。
文档编号A61P11/02GK101313938SQ200810050958
公开日2008年12月3日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者王晓华, 付雅彬, 邢哲勋, 宋明武, 敏 李, 刘建恒 申请人:吉林省辉南天泰药业股份有限公司