专利名称：：锦灯笼多糖的免疫增强用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物多糖的生物学活性，具体涉及锦灯笼多糖在增强机体免疫功能中的用途。
背景技术：
：随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，各种新型疫苗如亚单位疫苗、合成肽疫苗和重组核酸疫苗不断涌现。这些新型疫苗虽然纯度高、特异性强，但是分子量小，免疫原性弱，难以诱导机体产生有效的免疫应答，因而疫苗佐剂的研究备受关注。尽管许多原料可以应用于疫苗佐剂，但大多只能诱发抗体反应或者产生一些副作用，因而限制了它们的实际应用。如铝胶佐剂是目前唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂，但是存在许多缺点只能激发体液免疫；对人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、流感病毒以及血吸虫病、百日咳和伤寒等抗原无免疫佐剂性效果；需要在低温状态下运输；产生局部反应、形成肉芽肿许多副作用等。所以新型佐剂的研究日益受到重视。理想的疫苗佐剂能同时诱发Thl和Th2细胞免疫反应。Thl细胞免疫反应由Thl辅助细胞介导，在小鼠中增强IgG2a、IgG2b和IgG3的产生。Th2细胞免疫反应由Th2辅助细胞介导增强IgGl和IgA的产生。大量研究结果表明，植物多糖对免疫系统发挥多方面的重要调节作用。植物多糖源自天然，具有资源丰富、价格低廉、毒副作用小、无残留、作用广泛等优点，因此，植物多糖作为免疫增强与疫苗配合使用，在科研与应用中具有重要的研究价值。锦灯笼(外wa7i'ssAe化77^'L.)为茄科植物。秋季果实成熟，宿萼红色或橙红色，略呈灯笼状；成熟果实味甘，微酸，可以食药两用，营养丰富。锦灯笼全国各地均有分布,尤其盛产于吉林省长白山地区；吉林省现正在对其进行广泛的开发利用。本课题组以锦灯笼果实为实验材料，提取分离纯化锦灯笼多糖；动物实验结果表明锦灯笼多糖具有明显的降血糖功效，并申请专利"锦灯笼多糖在制备治疗糖尿病药物和保健品中的应用"(200510119145)。
发明内容本发明目的在于寻找锦灯笼多糖在增强机体免疫功能中的作用，以便开发出一类新的提高机体免疫能力的保健品。本研究发现，锦灯笼多糖对ConA和LPS刺激的脾淋巴细胞增值反应明显增高；明显的刺激了血清中抗体IgG、IgGl和IgG2b的产生。表明锦灯笼多糖不仅诱发了较强的体液免疫，而且诱导较强的细胞免疫，可用于疫苗佐剂或免疫增强功效的保健品。1、本发明通过对新鲜的或干燥的锦灯笼果，离子水加热沸腾，滤液浓縮后乙醇搅拌沉淀，沉淀物经过离心，真空干燥，得到总锦灯笼多糖的粗制品；再对锦灯笼粗多糖反复冻溶后离心，弃沉淀；将上清液中多糖配制成水溶液，加入乙醇溶液调节其终浓度，静止过夜，沉淀物经过离心，真空干燥，得到的锦灯笼多糖可作为疫苗佐剂或免疫增强作用保健品。2、通过动物分组及其免疫方法；小鼠脾淋巴细胞转化；ELISA检测小鼠抗血清中抗OVA特异性抗体等实验，结果证明锦灯笼多糖可作为疫苗佐剂或免疫增强作用保健品，其免疫增强效果明显优于铝佐剂。锦灯笼多糖对免疫系统，源自天然，具有资源丰富、价格低廉、毒副作用小、无残留、作用广泛等优点，在增强机体免疫功能中发挥重要调节作用。具体实施例方式实施例1锦灯笼多糖的制备步骤1:新鲜的或干燥的锦灯笼果，离子水加热沸腾，滤液浓縮后乙醇搅拌沉淀，沉淀物经过离心，真空干燥，得到总锦灯笼多糖的粗制品。步骤2:将步骤1中的锦灯笼粗多糖反复冻溶后离心，弃沉淀；将上清液中多糖配制成5%的水溶液，加入乙醇溶液使其终浓度为70%(pH=2.5)，静止过夜，沉淀物经过离心，真空干燥，得到的锦灯笼多糖可作为疫苗佐剂或免疫增强作用保健品。实施例2锦灯笼多糖免疫增强药效实验一动物分组及其免疫方法五周龄雄性ICR小鼠用于动物实验，每组5只；以鸡清蛋白(OVA)为抗原，皮下注射。实验分组如下第一组(Saline):注射生理盐水，作为空白对照第二组(OVA):注射OVA100)ig/只，作为阴性对照第三组(AL):注射OVA100昭/只+Al(OH)3胶体200ng/只，为阳性对照第四组(锦灯笼多糖)注射OVAl00ng/只+锦灯笼精多糖100pg/只以上各组以0VA为抗原均免疫两次，间隔14天。第一次OVA免疫前第四组(锦灯笼多糖)要连续两天单独注射锦灯笼多糖，其它对照组注射生理盐水。第二次免疫后14天后，MTT法检测动物脾淋巴细胞增值反应；用ELISA方法检测动物抗血清中抗OVA特异性抗体IgG、IgGl及IgG2b的变化。二小鼠脾淋巴细胞转化实验1、无菌取小鼠脾脏，并制成单细胞悬液，用RPMI1640培养液将细胞稀释成2xl07ml。2、于96孔培养板中，每孔加100u1脾细胞悬液，各孔分别加等体积的ConA溶液(终浓度为5yg/ral)或LPS溶液(终浓度为10ixg/ml)，并设空白对照组。3、37°C、5%(]02培养箱中培养68小时后，各孔分别加10u1MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时，每孔分别吸去100y1上清，加入100u1酸性二甲基亚砜(DMSO)溶液，振荡，于室温放置15min。4、用酶标仪于570nm处测定OD值。5、实验结果(1)锦灯笼多糖对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响见表1.表1:锦灯笼多糖对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响组别0D值(570nm)Saline0.105±0.003OVA0.lll士O.011AL0.124±0.018锦灯笼多糖0.188±0.013*注实验结果用平均值土标准差表示(n-5)，各实验组与OVA对照组比较，*尸<0.01表l实验结果表明与OVA组相比，锦灯笼多糖组对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应具有明显的增强作用，而铝佐剂组差异不显著。(2)锦灯笼多糖对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响见表2.表2:锦灯笼多糖对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响ifl^OD值(570nm)Saline^TT02士0.002,OVA0.098±0.008AL0.104±0.008锦灯笼多糖lOOpg0.248±0.016*注实验结果用平均值士标准差表示(n=5)，各实验组与OVA对照组比较，*尸<0.01表2实验结果表明与OVA组相比，锦灯笼多糖组对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应具有明显的增强作用，而铝佐剂组差异不显著。三ELISA检测小鼠抗血清中抗OVA特异性抗体1、于96孔酶标板上，每孔加入100u1包被液(含50ug/ml0VA的0.05M，PH9.6的碳酸盐缓冲液)，置4'C孵育24小时。2、用洗涤缓冲液液洗涤3次，每次3分钟。3、每孔加封闭液100ul，于37'C孵育1小时后洗涤。4、每孔分别加100"1待测小鼠抗血清稀释液，37'C孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤。5、分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，IgGl或IgG2b抗体稀释液100u1,37°C孵育0.5小时,洗涤。6、每孔分别加50u1底物显色液A和底物显色液B，室温放置15分钟，每孔加终止液(2MH2S04)50nl终止反应，用酶标仪于波长450/630nm处测定0D值。7、实验结果(1)小鼠抗血清抗OVA特异性抗体IgG的变化实验结果(见表3)表明与OVA组相比，锦灯笼多糖组抗血清抗OVA特异性抗体IgG差异显著，其作用效果与铝佐剂组相当。表3:锦灯笼多糖对小鼠抗血清中抗OVA抗体IgG含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注实验测定值用平均值±标准差表示01=5),各组与OVA对照组比较，*尸<0.01。(2)小鼠抗血清抗OVA特异性抗体IgGl的变化实验结果(见表4)表明与OVA组相比，锦灯笼多糖组抗血清抗OVA特异性抗体IgGl差异显著，其作用效果与铝佐剂组相当；说明锦灯笼多糖与铝佐剂一样明显的剌激了Th2细胞。表4:金灯笼多糖对小鼠抗血清中抗OVA抗体IgGl的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>锦灯笼多糖lOOpg1.142±0.077*注实验测定值用平均值土标准差表示(n=5)，各组与OVA对照组比较，*尸<0.01。(3)鼠抗血清抗OVA特异性抗体IgG2b的变化实验结果(见表5)表明与OVA组相比，锦灯笼多糖组抗血清抗OVA特异性抗体IgG2b差异显著，而铝佐剂组差异不显著相当；说明锦灯笼多糖明显的刺激了Thl细胞，其免疫增强效果明显优于铝佐剂。表5:锦灯笼多糖对小鼠抗血清中抗0VA抗体IgG2b的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注实验测定值用平均值土标准差表示(n=5),各组与OVA对照组比较，*尸<0.01。权利要求1.锦灯笼多糖在制备增强机体免疫功能的保健品中的用途。全文摘要本发明属于植物多糖的生物学活性，具体涉及锦灯笼多糖在增强机体免疫功能中的用途通过对新鲜的或干燥的锦灯笼果，离子水加热沸腾，滤液浓缩后乙醇搅拌沉淀，离心，真空干燥，得到总锦灯笼多糖的粗制品；再对锦灯笼粗多糖反复冻溶后离心，弃沉淀；将上清液中多糖配制成水溶液，加入乙醇溶液调节等等，得到锦灯笼多糖可作为疫苗佐剂或免疫增强作用保健品。通过动物分组及其免疫方法；小鼠脾淋巴细胞转化；ELISA检测小鼠抗血清中抗OVA特异性抗体等实验，证明锦灯笼多糖可作为疫苗佐剂或免疫增强作用保健品。锦灯笼多糖源自天然，具有资源丰富、价格低廉、毒副作用小、无残留、作用广泛，在增强机体免疫功能中发挥重要调节作用。文档编号A61P37/00GK101371851SQ200810051229公开日2009年2月25日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者李永刚,王桂云申请人:东北师范大学