专利名称：：21(s)阿加曲班定向合成和晶体结构及一水合物的制备的制作方法
技术领域：
：本发明属于医药
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，特别是涉及一种21(S)阿加曲班定向合成和晶体结构及一水合物的制备。阿加曲班作为一种凝血酶抑制剂已于1978年由日本Misubishi化学公司的S.Okamoto等首次进行了报导[US4101653]。1992年日本批准该药作为非肠道使用的凝血酶抑制剂[Hijikata-Okunomiya,A.,etal.,Thromb.Hemostasis,1992,18,135]。阿加曲班一(2R,4R)-l-[(2S)-5-[(aminoiminomethyl)amino]-l-oxo-2-[[(1,2,3，4-tetrahydro-3-methyl-8-quinolinyl)sulfonyl]amino]pentyl]-4-methyl-2-piperidinecarboxylicacid-其化学成分是21(R)和21(S)阿加曲班的混合物，通常两者的比例为6465:3635[US6440417，Cossy.J.,etal,Bioorganic&MedicineChemistryLetters,11(2001),1989-1992，JournalofPharmaceuticalSciences,Vol.82,No,6,672(1993)]。阿加曲班是L-精氨酸的衍生物，其只与凝血酶活性位点相互作用，是凝血酶的竞争性抑制剂。该药能够直接灭活凝血酶(因子IIa)的活性；对凝血酶的产生没有直接作用，其作用不依赖于体内的抗凝血酶；其不仅可以灭活血液中游离状态的凝血酶，而且还能够灭活与纤维蛋白血栓结合了的凝血酶；阻断凝血瀑布的正反馈；极低浓度时即可抑制由凝血酶诱导的血小板凝聚反应，间接抑制凝血酶的产生。另外，阿加曲班的分子量小，其能够进入到血栓内部，因此可以直接灭活巳经与纤维蛋白血栓结合的凝血酶，并对那
背景技术：
(IDX=CH3，Y=H，21(S)阿加曲班(WDX=H，Y=CH3，21(R)阿加曲班些陈旧的血栓仍能发挥抗血栓作用。此外，阿加曲班还能够大大降低血浆中TAT(凝血酶一抗凝血酶复合物)的水平，有效改善患者的高凝状态，因此在慢性血栓栓塞性疾病中具有非常好的临床效果。阿加曲班在世界各国治疗血栓等疾病的广泛应用引起了医学工作者对阿加曲班两个非对映异构体21(S)阿加曲班一(2R,4R)-l-[(2S)-5-[(aminoiminomethyl)amino]-l-oxo-2-[[[(3S)-1,2,3,4陽tetrahydro-3-methyl-8-quinolinyl]sulfonyl]amino]pentyl]-4-methyl-2-piperidinecarboxylicacid和21(R)阿加曲班一(2R,4R)-l-[(2S)-5-[(aminoiminomethyl)amino]-l-oxo-2-[[[(3R)-l^'S/Metrahydro-S-methyl-S-quinolinyUsulfonyUaminoJpeiitylM-methyU-piperidinecarboxylicacid的高度关注，主要涉及21(S)和21(R)阿加曲班的分离或立体选择性合成及二者生物活性的差异。近年来，世界各国卫生组织对药物成分的要求和规定越来越严格，除了规定各种杂质的总含量和单一杂质的最高含量之外，对药物成分中允许的异构体或光学异构体逐一进行分离鉴定，并严格控制其含量。消旋体药物是光学异构体的混合物，从降低治疗用量和减少对人体不良反应的角度，高活性单一成分光学活体作为药物代替消旋体是一个发展趋势。2006年中国炜杰科技有限公司宋洪海等报导了21(S)和21(R)阿加曲班的注射液对正常犬凝血指标的影响实验，实验结果表明单一成分的21(S)阿加曲班对延长正常犬全血凝固时间(CT)作用显著，其作用效果是21(R)阿加曲班的两倍；21(S)阿加曲班对延长正常犬复钙时间(RT)作用显著，其作用效果是21(R)阿加曲班的三倍；21(S)阿加曲班对延长正常犬凝血酶原时间(PT)作用显著，其作用效果是21(R)阿加曲班的两倍；21(S)阿加曲班对延长正常犬白陶土部分凝血活酶时间(APTT)作用显著，其作用效果是21(R)阿加曲班的两倍。21(S)阿加曲班对延长正常犬凝血酶时间(TT)作用显著，其作用效果比21(R)阿加曲班略强；21(S)阿加曲班对正常犬血小板粘附率和血小板聚集率有降低作用。显然21(S)作为凝血酶抑制剂将大大优于阿加曲班和21(R)阿加曲班[CN101032485A]。阿加曲班两个非对映异构体21(S)和21(R)的分离工作吸引了众多研究者。由于二者物化性质极为相似，因此分离难度很大。1993年Rawson,ThomasE.;VanGorp,KimmieA.;Yang,Janet等首次用高压液相色谱法和柱层析法分离而获得了单一的21(S)禾口21(R)阿力口曲班[JournalofPharmaceuticalSciencesvol,82,No.6，672];ThibaudeauKaren等报导了ProteinA层析分离法[US6440417]。但由于上述这些方法的分离量小、效率低，因此没有工业化实用价值。2006年中国天津炜杰科技有限公司宋洪海等报导了采用重结晶法分离21(S)和21(R)阿加曲班的方法[CN1951936A]，从而使批量生产21(S)阿加曲班成为可能，但该法收率低、操作繁杂、成本较高，并且产生大量含有少量21(S)的21(R)阿加曲班副产物，从工业化生产角度考虑，仍不是一种理想的方法。但到目前为止尚未发现21(S)阿加曲班定向合成及一水合物制备的报导。
发明内容本发明的目的在于提供一种操作过程相对简单、成本低且收率高的21(S)阿加曲班定向合成方法和一水合物的制备及有关晶体结构研究。本发明提供的21(S)阿加曲班一水合物具有下述式I所示的化学结构式一一(2R，4R)-1-[N2-[(3S)-1,2,3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]丄-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸一水合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(I)本发明提供的上述21(S)阿加曲班的定向合成方法包括按顺序进行的下列步骤(见图1):1)以(2R，4R)-1-^(3-硝基丄-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯盐酸盐作为原料，将其溶于二氯甲烷中，用三乙胺作为缚酸剂，滴加(3S)-1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰氯，反应制得(211,410-1-^(}-硝基^2-[(38)-1,2,3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]丄-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸酯VI;2)将中间体VI在碱性溶液中水解酸化得中间体vn:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>3)将中间体Vn在醇中钯碳催化氢化脱硝基保护，得单一非对映异构体无水21(s)阿加曲班vra:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>'N、4)将上述无水21(S)阿加曲班VIII与蒸馏水混合，在8010(TC的温度下加热0.51.0小时，至固体全部溶解，之后冷却降温后再低温放置数小时，直至析出晶体，最后过滤、水洗、真空干燥而得到下述式I所示的21(S)阿加曲班一水合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>CI)。所述的步骤3)中氢化压力为1.0100kg/cm2，反应温度为25100°C，醇为甲醇或乙醇中的任一种。所述的步骤4)中无水21(S)阿加曲班与蒸馏水的重量比为1:30150，真空干燥温度为4060°C。所述的步骤4)中冷却降温时的速度为80100°C—50°C24小时；50°C—0°C24小时；低温放置温度为0°C，放置时间为510小时。所述的21(S)阿加曲班一水合物的水含量为3.33.8%。将所述的无水21(S)阿加曲班VIII用蒸馏水重结晶得晶型I。将所述的无水21(s)阿加曲班viii用甲醇一水重结晶得晶型n。本发明提供的21(S)阿加曲班的定向合成方法是将(2R，4R)-1-[1^-硝基丄-精氨酰基]-4-曱基-2-哌啶甲酸乙酯盐酸盐与(3S)-1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰氯縮合得(2R,4R)-1-^(}-硝基-^-[(3S)-1,2,3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]七-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸酯，然后经碱性水解及催化氢化脱硝基得单一非对映异构体21(S)阿加曲班，将21(S)阿加曲班溶于热水，控制冷却速度，制得21(S)阿加曲班一水合物。动物试验证明，21(S)阿加曲班一水合物的抗凝血作用为21(R)阿加曲班一水合物的23倍。将21(S)阿加曲班用蒸馏水重结晶而得到晶型I，经单晶和多晶粉末X衍射法，确认绝对构型为21(S)，晶体结构为正交晶系，19号空间群。将21(S)阿加曲班用甲醇一水重结晶而得到晶型II。图1为21(S)阿加曲班一水合物合成路线图。图2为本发明提供的21(S)阿加曲班晶型I单晶X—衍射空间结构图。图3为本发明提供的21(S)阿加曲班晶型I单晶X—衍射晶胞图。图4为本发明提供的21(S)阿加曲班晶型I多晶粉末X—衍射图。图5为本发明提供的21(S)阿加曲班晶型II多晶粉末X—衍射图。图6为本发明提供的21(S)阿加曲班一水合物差热分析图。具体实施方式实施例1:1)在500ml四口反应瓶内加入200ml氯仿和25g(0.061mole)(2R，4R)-1-[NG-硝基-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯盐酸盐，冷却至5'C，然后加入18.5g(0.18mole)三乙胺，并滴加14,7g(0.061mole)(3S)-l,2，3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰氯，室温下搅拌3小时，TLC跟踪反应，至(2R，4R)-1-[^-硝基丄-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯盐酸盐消失，反应结束，用50ml水洗两次，无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，柱层析分离，得黄色固体状(2R,4R)-l-[NG-硝基-N2-[(3S)-1，2，3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]丄-精氨酰基]—4-甲基-2-哌啶甲酸酯VI32.5g，收率为92.1%;2)在500ml四口反应瓶内加入100ml乙醇和30g(0.052mole)中间体VI，搅拌下加入100ml1NNaOH，室温下搅拌24小时，TLC跟踪反应，至中间体VI消失，反应结束，用1NNaOH调pH"11，用100ml乙酸乙酯和100ml氯仿洗涤，水相用1N盐酸酸化，析出固体，过滤。20ml水洗，干燥，得白色固体状中间体VII27g，收率为94.7%;3)在100ml高压盖中加入lg中间体VII，0.02g三苯基磷，0.2g5%pd/c，13ml无水乙醇和4ml冰乙酸，控制高压釜外温65.70'C。通入氢气，保持压力10atm，反应24小时，停止反应，过滤除去钯碳。脱溶，用20ml二氯甲垸溶解，饱和碳酸氢钠调节pH"7，分出水层，再用10ml饱和氯化钠洗漆，静置，分出有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，脱除二氯甲垸，得白色固体状无水21(S)阿加曲班VI0.75g，收率为82%;4)将上述lg无水21(S)阿加曲班Vffi加入到100ml蒸馏水中，搅拌，在0.51.0小时的时间内升温至IO(TC,此时固体全部溶解，然后冷却降温，冷却速度为约2小时内降至5(TC，再2小时降至0'C。在0"C下放置10小时，直至析出结晶，然后过滤，水洗，并在4050'C的温度下真空干燥，得21(S)阿加曲班一水合物0.73g，mp:227-229°C，含水量为3.8%(卡尔费休法)。差热分析表明，82"C时21(S)阿加曲班一水合物失结晶水，10(TC时21(S)阿加曲班一水合物的结晶水挥发(见图6)。实施例2:将lg21(S)阿加曲班加入到150ml蒸馏水中，搅拌，在0.51.0小时的时间内升温至95。C，此时固体全部溶解，然后冷却降温，冷却速度为2小时内先匀速降至8(TC，然后1小时内降至50°C，再2小时内降至0'C。在O'C下放置8小时，直至析出结晶，然后过滤，水洗，并在506(TC的温度下真空千燥，得21(S)阿加曲班一水合物O.65g，含水量为3.4%(卡尔费休法)。实施例3:将lg无水21(S)阿加曲班VI用蒸镏水重结晶得晶型I，经单晶和多晶粉末X衍射，确认其绝对构型21位为S体(见图2)，晶型I为正交晶系，P2(1)2(1)2(1)空间群(19号空间群)。晶胞参数a=9.372A，b=15.503A，c=21,735A,a=P=Y=90°C(见图3)。晶型I多晶粉末X衍射数据与单晶X衍射模拟数据相吻合(见图4，表l)。表121(S)阿加曲班晶型I单晶X-衍射模拟数据与多晶粉末X-衍射数据对照<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4:将lg无水21(S)阿加曲班WI溶于95%甲醇一水溶液中，冷却，放置，直至析出晶体，然后过滤，水洗，并在60-7(TC下进行干燥，得0.7g白色固体，晶型为晶型II，其多晶粉末X衍射图见图5，衍射数据见表2。表221(S)阿加曲班晶型II多晶粉末X—衍射数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例5:21(S)和21(R)阿加曲班对正常犬凝血作用实验试验材料1、供试品实施例12中制备出的21(S)阿加曲班一水合物；21(R)阿加曲班一水合物；无色澄明液体，规格20ml:10mg，贮存遮光、室温密闭保存。2、试剂0.9%氯化钠注射液，规格500ml，批号D510150401，由济南三九益民制药有限公司生产；枸橼酸钠，分析纯，规格500g，批号20021105，由山东博山化学试剂厂生产，使用时用生理盐水配成3.2%的溶液；凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间试剂盒均由上海太阳生物技术有限公司提供；ADP:由北京东方普利生科贸有限公司提供。3、动物普通家犬(Ca"^/aw^"n^"朋e),18条，雌雄各半，10-15kg，由市场购入。4、主要仪器设备HEMAVET-950型全自动血球计数仪，由DrewScientific公司生产；C2000型血凝仪，由北京东方普利生科贸有限公司生产；LBY-NJ2型血小板聚集仪，由北京东方普利生科贸有限公司生产；血小板粘附仪，由北京东方普利生科贸有限公司生产；试验方法1、动物分组取健康普通家犬(C""^/aOT///fl^"m7e)18只，随机分为三组，分别为正常对照组、阿加曲班注射液S体、R体三个试验组，每组6只动物。2、给药剂量选择及依据供试品临床用法通常对成人在开始的2日内1日6支(阿加曲班60mg)以适当量的输液稀释，经24小时持续静脉滴注。其后的5日中1日2支(阿加曲班20mg)，以适当量的输液稀释，每日早晚各1次，每次1支(阿加曲班10mg)，1次3小时静脉滴注。参考阿加曲班注射液临床用量，以成人每天15mg计，按成人70kg和12kg犬等效剂量折算系数法可得犬用药剂量为人用量X0.32/12，初步定为0.4mg/kg。3、动物药液配制0.4mg/kg剂量溶液取相应的供试品溶液0.8ml(0.5mg/ml测试药物)+0.9%氯化钠注射液9.2ml;4、试验过程每只动物给药前取血测定全血凝固时间(CT)、复钙时间(RT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、白陶土部分凝血活酶时间(APTT)、血小板粘附率、血小板聚集率等指标作为药前值，测定完毕，每组动物按10ml/kg体积给予相应的动物药液，每天一次，连续3天，第三天给药后15分钟取血测以上凝血相关指标，测试结果见表39。其中，全血凝固时间的测定方法取试管3个，标号为1、2、3号。用一次性无菌注射器顺利地抽取犬静脉血3ml，自血流入针头开始计时，去针头后沿管壁每管缓慢注入血液lml，置37"水浴中。每隔一定时间将第一管倾斜1次，直至将试管倒置血液不流动为止；再依次观察第二管，第二管凝固后，再观察第三管。以第三管凝固时间为凝血时间。复钙时间测定方法取枸橼酸钠抗凝血lml，离心取血浆0.2ml，加0.025mol/L的氯化钙溶液0.2ml，混匀后置于37。C水浴，从加钙起计时，直至凝固的时间为复钙时间。其它测试采用仪器测定。5、数据统计及结果判定每组动物药前和药后各个指标以均数士标准差(^±5)表示。将各药物组药后变化值与空白对照组药后变化值进行t检验，以判断药物的效果。表3:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬全血凝固时间(CT)的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*P<0.05**P〈0.01与正常对照组比较。结果表明，与正常对照组相比，阿加曲班注射液S体和R体均能明显延长全血凝固时间(CT)，其中S体的作用效果约为R体的两倍。表4:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬复钙时间(RT)的影响(x士SD，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明，与正常对照组相比，阿加曲班注射液S体和R体均能明显延长复钙时间(RT)，其中S体的作用效果约为R体的三倍。表5:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬凝血酶原时间(PT)的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*P〈0.05**P<0.01与正常对照组比较。结果表明，阿加曲班注射液S体能明显延长犬凝血酶原时间(PT)，与正常对照组比较，有显著性差异(P〈0.05或P〈0.01);R体亦有一定的作用，但与正常对照组比较无显著性差异(P〉0.05)。S体的作用效果约为R体的两倍。表6:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬凝血酶时间(TT)的影响(x土SD，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*P<0.05**P〈0.01与正常对照组比较。结果表明，阿加曲班注射液R体和S体均都能明显延长犬凝血酶时间(TT)，与正常对照组相比，有显著性差异(P〈0.01)，其中S体的作用效果略强于R体。表7:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬白陶土部分凝血活酶时间(APTT)的影响(^c土SD，n==6)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*P〈0.05**P<0.01与正常对照组比较。结果表明，阿加曲班注射液S体能明显延长犬白陶土部分凝血活酶时间(APTT)，与正常对照组相比，有显著性差异(P〈0.Q5);R体亦有-一定的作用，但与正常对照组比较无显著性差异(P〉0.05)。S体的作用效果约为R体的两倍。表8:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬血小板粘附率的影响(x士SD，n=6)组别剂量药前粘附率药后粘附率粘附率变化值(mg/kg)(%)(%)(%)正常对照组—30.1±5.329.5±5.1-O.6±3.4s体0.429.6±4.124.2±3.8_5.4±4.4R体0.429.0±4.924.7±4.6—4.3±6.6P〉0.05与正常对照组比较。结果表明，阿加曲班注射液R体和S体对血小板粘附率都有一定的降低作用，但与正常对照组相比，无显著性差异(P〉0.05)。表9:阿加曲班注射液S体、R体及正常对照组药液对正常犬血小板聚集率的影响(S土SD，n=6)组别剂量药前聚集率药后聚集率聚集率变化值(mg/kg)(%)(%)(%)正常对照组一51.2±8.845.2±6.2-6.0±9.0s体0.447.1±4.442.2±8.6-4.9±9.9R体0.451.5±9.943.5±9.2-8.0±13.6P>0.05与正常对照组比较。结果表明，阿加曲班注射液R体和S体对血小板聚集率都有一定的降低作用，但与正常对照组相比，无显著性差异(P>0.05)。试验结果表明，21(S)阿加曲班一水合物比21(R)阿加曲班一水合物能更显著延长全血凝固时间(CT);能更显著延长复钙时间(RT);能更明显延长犬凝血酶时间，能更明显延长犬白陶土部分凝血活酶时间(APTT)，较强延长犬凝血酶时间(TT)，上述试验21(S)阿加曲班与正常对照组相比均有显著性差异。二者对血小板粘附率和聚集率均有降低作用，但无显著性差异。试验结果表明，21(S)阿加曲班一水合物与21(R)阿加曲班一水合物比较，有更显著的抗凝血作用，单一成分21(S)阿加曲班作为抗凝血酶药物将提高效果或降低用量。权利要求1.一种具有化学结构式I的21(S)阿加曲班一水合物——(2R，4R)-1-[N2-[(3S)-1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸一水合物，其特征在于该化合物内含有一个结晶水。2.—种如权利要求1所述的21(S)阿加曲班一水合物的制备方法，其特征为(1)21(S)阿加曲班与水混合，在80-10(TC下加热0.5-1.0小时，固体溶解，控制冷却速度，析出结晶，得21(S)阿加曲班一水合物；(2)制备21(S)阿加曲班一水合物时，21(S)阿加曲班水=1:30150(w/w)(3)制备21(S)阿加曲班一水合物时，冷却速度80100°C—40-5CTC24小时；40-50°C—0°C2小时；0'C放置510小时；(4)制备21(S)阿加曲班一水合物时，晶体干燥温度40-50°C;(5)制得的21(S)阿加曲班一水合物，其含水量为3.3-3.8%。3.根据权利要求2，21(S)阿加曲班的定向合成方法，其特征为(1)以(2R，4R)-l-[NG-硝基-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯盐酸盐作为原料，与(3S)-1,2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰氯反应得中间体VI——(211,411)-1-|7^-硝基-]^-[(38)-1,2,3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]丄-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(2)将中间体VI在氢氧化钠水溶液中水解，酸化，得中间体VH——(2R,4R)-l-[N^硝基-N24(3S)-1,2,3,4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰基]丄-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(3)中间体vn经钯碳催化氢化，得阿加曲班vm:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4.根据权利要求3，无水21(S)阿加曲班VIL经单晶和多晶粉末衍射确认21位绝对构型为S型，晶体结构为晶型I:正交晶系，19号空间群——P2(l)2(l)2(l);无水21(S)阿加曲班用甲醇-水重结晶，晶体经多晶粉末X衍射证明的晶型为晶型II。5.根据权利要求l，21(S)阿加曲班一水合物的抗凝血作用为21(R)阿加曲班一水合物的23倍。全文摘要一种21(S)阿加曲班定向合成和晶体结构及一水合物的制备。定向合成方法是以(3S)-1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉磺酰氯为原料制得单一非对映异构体21(S)阿加曲班。通过单晶和多晶粉末X衍射法，确认绝对构型为21(S)及晶型I和II。21(S)阿加曲班溶于热水，控制冷却速度，制得21(S)阿加曲班一水合物。动物试验证明21(S)阿加曲班一水合物的抗凝血作用为21(R)阿加曲班一水合物的2～3倍。文档编号A61P7/00GK101235031SQ20081005238公开日2008年8月6日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者宋洪海申请人:天津市炜杰科技有限公司