养血清脑颗粒对脑神经元损伤的治疗作用的制作方法

文档序号:1226661阅读:365来源:国知局
专利名称:养血清脑颗粒对脑神经元损伤的治疗作用的制作方法
技术领域
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本发明涉及一种中药制剂的新用途,特别涉及中药养血清脑颗粒对脑神经元 损伤的治疗作用。
背景技术
脑损伤是多种损伤机制造成的共同结果,其中脑缺血最常引起神经细胞损 伤。溶栓治疗和神经保护是治疗缺血性脑卒中的两大干预策略。溶栓治疗往往有 治疗时间窗,且副作用较多。因此,神经元保护并与其他治疗方法联合应用表现出 更明显的优越性。
养血清脑颗粒是由当归、川穹、鸡血藤、白芍、细辛等为主要成分组成的中 药复方制剂,临床应用于与脑微循环障碍相关的头痛、眩晕治疗。但是,对大脑 中动脉阻塞再灌注引起的大脑局部脑神经细胞的损伤是否具有保护作用等尚不 清楚,为此,本研究用大脑中动脉阻塞再灌注建立的大鼠局部脑神经细胞模型,
观察养血清脑颗粒对局部缺血再灌注后,大鼠脑神经元损伤的保护作用,并通过 免疫组织化学方法研究养血清脑颗粒对调亡相关的脑神经元P53、 PUMA、 Bcl-2、 Caspase-3表达的影响,探讨起作用机制。

发明内容
本发明提供一种养血清脑颗粒的新的治疗用途,特别是用养血清脑颗粒治疗 脑神经元损伤。
养血清脑颗粒是一种己经上市的中成药物,其配方组成为当归、赤芍、川 芎、鸡血藤、勾藤、夏枯草等临床上用于治疗头痛、眩晕等症。
本发明经过研究发现,养血清脑颗粒可以治疗脑神经元损伤因而扩大了其应 用范围,为此,本发明的内容主要包括,用养血清脑颗粒制备一种治疗脑神经元 损伤的药物。
为证明本发明的实验效果,现将有关实验数据整列如下 实验一、
本实验研究养血清脑颗粒后给药大脑中动脉缺血再灌注引起的大鼠脑局部神经 细胞损伤的治疗作用。动物
SD大鼠,雄性,体重270 300 g,购自北京大学医学部实验动物科学部,合格证 号SYXK (京)2002-0002。在12小时切换灯源,温度22。C,相对湿度40%的环 境下饲养,自由进食饮水。 药物
养血清脑颗粒主要组成为当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、 细辛等,天津天士力制药股份有限公司生产,国药准字Z10960082,批号050608。 实验前用生理盐水配制成0.08 g/ml 0.16 g/ml的溶液。 模型的建立
用20%乌拉坦肌肉注射麻醉大鼠(2.5 g/kg.bw),在颈部正中切开,逐层分离颈 部右侧肌肉(胸骨舌骨肌,胸锁乳突肌),小心分离颈总动脉及其分支,用微动 脉夹夹闭经总动脉近心端,双线结扎颈外动脉,并于中间剪断,于近心端游离断 支系一活结,分离颈内动脉致翼腭动脉(PtA)分支处,用微动脉夹夹闭颈内动 脉,用显微剪在结扎处和活结中间开一小孔,将动脉插线(3-0 prolene, Johnson&Johnson, USA)小心插入后将活结扎紧,去除颈内动脉微动脉夹,将动 脉插线插入1.8~2.2 cm,造成缺血,60 min后撤出动脉插线扎紧活结,开始再 灌注(I/R)。假手术组除了不插入动脉插线,其他操作同缺血再灌注组。给药组 在大脑中动脉缺血再灌注3小时后开始,灌胃给予养血清脑颗粒0.4g/kg或 0.8g/kg,每日一次,连续6曰。 氯化三苯四氮唑(TTC)染色
在缺血再灌注6日后,麻醉大鼠,剪下头部置于脑定位仪沿视交叉往后平均切成 5片,用含2%TTC的磷酸盐缓冲液在37'C染色30min,然后再用4%多聚甲醛固定并 拍照。用Image-Pro-Plus软件测量梗死体积比(即梗死区体积占同侧大脑半球的
百分比)。
光镜脑组织切片制备及Nissl染色
在缺血再灌注6日后,麻醉大鼠,经左心室插管灌注,用生理盐水250ml (室温) 快速灌注,再用4X多聚甲醛150ml (4'C)缓慢灌注,持续60min左右,迅速取 脑,在脑定位模具中沿视交叉冠状位切取脑组织,将其置于4%多聚甲醛溶液中 后固定6 8h后入30X的蔗糖中,待脑组织沉底后冰冻切片,制成20Mm厚的切片,每隔5张切片取5张分别行常规Nissl染色,脱水封片后于光镜下观察。 免疫组织化学染色
切片入O. 01mol/L PBS摇洗3次后,入Triton X-100液30min (37°C),入3% 过氧化氢20min (避光),血清封闭lh (室温),分别滴加1: 100抗Ca印ase-3、 抗PUMA、抗P53、抗NF-icB抗体各50W于各组不同的切片上,置于室温下lh, 入4'C冰箱过夜。第二天复温lh后入滴加ABC试剂盒中B、 C液50ul于对应的 切片上,室温下各孵育lh,各步骤之间均入0. 01mol/L PBS摇洗3次,DAB显色, 常规梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察。每组各5张切片, 每张切片随机取5个视野计数阳性细胞数,并作统计分析。 结果
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑梗死体积比的影响
图1是TTC染色结果,白色区域代表缺血梗死区。假手术组未见梗死苍白区,I/R 组脑切片中缺血侧脑皮质及皮质下基底核都有明显的白色梗死灶。养血清脑颗粒 预防给药后梗死区域均有所减小。
图2表示的是养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑梗死体积比的影响。与假手 术组相比,1/R组大鼠大脑梗死体积比明显升高,养血清脑颗粒预给药浓度依存 性降低了缺血再灌注后的大脑梗死体积比。 养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑Nissl染色的影响 图3是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织Nissl染色的 结果。Sham组镜下可见正常大脑皮质各层细胞排列整齐、规则,神经元结构完 整,神经基质无水肿。基底神经节区神经元结构也正常,神经纤维无损坏;皮质 神经元胞体体积较大,胞浆淡染,内含大而圆的泡状核,胞核规整,核仁明显, 染色质分布均匀,细胞质内可见尼氏体。1/R组低倍镜下淡染区较大,半影区20 倍镜下显示尼氏小体减少,神经细胞数量减少。CG0.4+I/R组低倍镜下淡染区较 1/R组减少,半影区20倍镜下细胞排列紊乱、部分神经细胞核固縮、尼氏小体 减少,可以观察到正常神经元。CGO. 8+I/R组低倍镜下淡染区较I/R组明显减少, 半影区20倍,虽然观察到少量核浓縮的神经元,但是大部分神经元细胞大而圆, 尼氏体深染,形态与假手术组相似。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑Caspase-3表达的影响图4是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织Caspase-3 免疫组织化学染色的图像。Sham组Caspase-3未见明显表达。1/R组大鼠脑皮质 可以观察到大量的Caspase-3阳性神经元细胞。CGO. 4+I/R组大鼠脑皮质内 Caspase-3阳性神经元细胞较I/R组明显减少,CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质内 Caspase-3阳性神经元细胞更少。
养血清脑颗粒剂量依存性减少了缺血再灌注引起的大鼠脑Caspase-3阳性神经 元细胞数量(图8)。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑PUMA表达的影响 图5表示的是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织PUMA 免疫组织化学染色的图像。Sham组大鼠脑组织内未见PUMA的明显表达。I/R组 大鼠脑皮质可以观察到广泛的PUMA阳性区域,20倍镜显示PUMA在神经元的胞 核胞浆均有表达,部分皱縮细胞则呈现均匀一致性表达。CGO. 4+I/R组和 CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质区PUMA阳性细胞明显减少。
养血清脑颗粒剂量依存性减少了缺血再灌注引起的大鼠脑PUMA阳性神经元细胞 数量(图8)。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑P53表达的影响
图6表示的是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织P53 免疫组织化学染色的图像。Sham组大鼠脑组织内未见P53的明显表达。I/R组大 鼠脑皮质区可以观察到广泛的P53阳性区域,20倍镜可以观察到较多的P53阳 性神经元。CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质P53阳性细胞明显减小。 养血清脑颗粒剂量依存性减少了缺血再灌注引起的大鼠脑P53阳性神经元细胞 数量(图8)。
养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑NF- k B表达的影响
图7表示的是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织NF- k B 免疫组织化学染色的图像。Sham组大鼠脑组织内未见NF-KB的明显表达。I/R 组大鼠脑皮质区可以观察到广泛的NF-k B阳性染色区域,20倍镜可以观察到较 多的NF- k B阳性神经元。CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质区NF- k B阳 性神经细胞明显减小。
养血清脑颗粒剂量依存性减少了缺血再灌注引起的大鼠脑NF-k B阳性神经元细胞数量(图8)。 结论
大脑中动脉缺血1小时再灌注6日可以引起同侧脑梗死和神经细胞损伤,引起神 经细胞内Caspase-3、 P53、 PUMA和NF-k B表达的增强。大脑中动脉缺血再灌注 3小时后开始,并每日一次,连续6日灌胃给予养血清脑颗粒可以减少大鼠脑梗 死区域和神经元的损伤,该作用与其抑制Caspase-3、 P53、 PUMA和NF- k B的表 达相关。


图1是TTC染色结果,白色区域代表缺血梗死区。假手术组未见梗死苍白区,I/R 组脑切片中缺血侧脑皮质及皮质下基底核都有明显的白色梗死灶。养血清脑颗粒 预防给药后梗死区域均有所减小。
图2表示的是养血清脑颗粒对缺血再灌注后大鼠大脑梗死体积比的影响。与假手 术组相比,1/R组大鼠大脑梗死体积比明显升高,养血清脑颗粒预给药浓度依存 性降低了缺血再灌注后的大脑梗死体积比。
图3是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织Nissl染色的 结果。Sham组镜下可见正常大脑皮质各层细胞排列整齐、规则,神经元结构完 整,神经基质无水肿。基底神经节区神经元结构也正常,神经纤维无损坏;皮质 神经元胞体体积较大,胞浆淡染,内含大而圆的泡状核,胞核规整,核仁明显, 染色质分布均匀,细胞质内可见尼氏体。1/R组低倍镜下淡染区较大,半影区20 倍镜下显示尼氏小体减少,神经细胞数量减少。CG0.4+I/R组低倍镜下淡染区较 1/R组减少,半影区20倍镜下细胞排列紊乱、部分神经细胞核固縮、尼氏小体 减少,可以观察到正常神经元。CGO. 8+I/R组低倍镜下淡染区较I/R组明显减少, 半影区20倍,虽然观察到少量核浓縮的神经元,但是大部分神经元细胞大而圆, 尼氏体深染,形态与假手术组相似。
图4是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织Caspase-3 免疫组织化学染色的图像。Sham组Caspase-3未见明显表达。1/R组大鼠脑皮质 可以观察到大量的Caspase-3阳性神经元细胞。CGO. 4+I/R组大鼠脑皮质内 Caspase-3阳性神经元细胞较I/R组明显减少,CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质内 Caspase-3阳性神经元细胞更少。图5表示的是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织PUMA 免疫组织化学染色的图像。Sham组大鼠脑组织内未见PUMA的明显表达。I/R组 大鼠脑皮质可以观察到广泛的PUMA阳性区域,20倍镜显示PUMA在神经元的胞 核胞浆均有表达,部分皱縮细胞则呈现均匀一致性表达。CGO. 4+I/R组和 CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质区PUMA阳性细胞明显减少。
图6表示的是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织P53 免疫组织化学染色的图像。Sham组大鼠脑组织内未见P53的明显表达。I/R组大 鼠脑皮质区可以观察到广泛的P53阳性区域,20倍镜可以观察到较多的P53阳 性神经元。CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质P53阳性细胞明显减小。 图7表示的是Sham组,I/R组,CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑组织NF- k B 免疫组织化学染色的图像。Sham组大鼠脑组织内未见NF-!cB的明显表达。I/R 组大鼠脑皮质区可以观察到广泛的NF- k B阳性染色区域,20倍镜可以观察到较 多的NF- k B阳性神经元。CGO. 4+I/R组和CGO. 8+I/R组大鼠脑皮质区NF- k B阳 性神经细胞明显减小。
图8是养血清脑颗粒剂量依存性减少了缺血再灌注引起的大鼠脑NF- k B阳性神
经元细胞数量。
具体实施例方式
以下实施例用于进一步说明本发明但不作为对本发明的限制。 实施例1
养血清脑颗粒,由如下重量份的原料药制成当归250- 420份;川芎280-400 份;白芍200-380份;熟地黄200-400份;钩藤580-750份;鸡血藤550-780 份;夏枯草600-720份;决明子500-750份;珍珠母560-750份;延胡索200-420 份;细辛30-IOO份。颗粒的制备采用制剂学常规技术制备成lOOOg。
权利要求
1、养血清脑颗粒在制备一种治疗脑神经元损伤药物的应用。
2、 权利要求l的应用,其特征在于,所述养血清脑颗粒是由当归250- 420份; 川芎280-400份;白芍200-380份;熟地黄200-400份;钩藤580-750份; 鸡血藤550-780份;夏枯草600-720份;决明子500-750份;珍珠母560-750 份;延胡索200-420份;细辛30-100份为主要成分制成的中药复方制剂。
3、 权利要求l的应用,其特征在于,所述应用是养血清脑颗粒对大脑中动脉缺 血再灌注引起的脑局部神经细胞损伤的治疗作用。
4、 权利要求l的应用,其特征在于,所述应用是养血清脑颗粒后给药减少脑梗 死区域和神经元的损伤,该作用与其抑制Caspase-3、 P53、 PUMA和NF-k B 的表达相关。
5、 权利要求l的应用,其特征在于,所述应用是养血清脑颗粒后给药减少了缺 血再灌注引起的大鼠脑Caspase-3阳性祌经元细胞数量。
6、 权利要求l的应用,其特征在于,所述应用是养血清脑颗粒后给药减少了缺 血再灌注引起的大鼠脑PUMA阳性神经元细胞数量。
7、 权利要求l的应用,其特征在于,所述应用是养血清脑颗粒后给药减少了缺 血再灌注引起的大鼠脑P53阳性神经元细胞数量。
8、 权利要求l的应用,其特征在于,所述应用是养血清脑颗粒后给药减少了缺 血再灌注引起的大鼠脑NF- k B阳性神经元细胞数量。
全文摘要
本发明涉及一种中药制剂的新用途,特别涉及中药养血清脑颗粒对脑神经元损伤的治疗作用,本发明实验数据表明,养血清脑颗粒对大脑中动脉缺血再灌注引起的脑局部神经细胞损伤有治疗作用。
文档编号A61P25/00GK101530500SQ20081005243
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者周长满, 安丽华, 昕 常, 芳 王, 琴 胡, 胡白和, 赵新荣, 陈春花, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司
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