专利名称：：矢车菊素3-o-葡萄糖苷在制备防治类风湿性关节炎药物或食品的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种矢车菊素3-0-葡萄糖苷在制备防治类风湿性关节炎药物或食品的应用。
背景技术：
：类风湿性类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种以关节病变为主的慢性全身性自身免疫性疾病，属中医痹证范畴，与"历节病"、"白虎历节"、"顽痹"等相似。RA具有反复发作、致残率高等特点，是常见而难治性疾病，目前国内外尚无特效治疗方法[l]。西药治疗副作用大，有些患者不能耐受，而且不适当的西药治疗所致药源性疾病的发病率更高。中药不仅来源广泛、种类数量众多、毒副反应小，而且具有多环节、多层次、多靶点综合作用的特点，因此治疗RA有着独特的优势。近几十年来，我国在RA的临床和实验研究中，取得了长足的进展，初步显示了中药对RA具有较好的临床疗效和抗炎、镇痛、改善血液流变性、改善关节滑膜超微结构及免疫调节等药理作用[2]。从传统的中药及天然产物中寻找有效部位或有效成分治疗RA已成为研究热点。佐剂性关节炎动物模型在临床上类似类风湿性关节炎，常用于评价天然药物对RA的治疗作用及可能的作用机理研究[3-4]。参考文献1.张银玲，陈文，彭雪芹，王甫英，江发寿，治疗类风湿性关节炎的中药研究概况，中国药业，2007,16(15):1-3.2.杨景峰，中医药治疗类风湿性关节炎的试验研究进展，现代中医药，2003，3:55-57.3.陆生，梁崇礼，林月秋，类风湿性关节炎动物模型研究应用进展，中国实验动物学杂志，2001，11(2):112-114.4.李万瑶，林锦泉，赖秀丽，赖先娥，尹利华，峰针对佐剂性关节炎动物模型的试验研究，中国中医基础医学杂志，2001，7(8):620-622.
发明内容本发明的目的是提供一种矢车菊素3-0-葡萄糖苷在制备防治类风湿性关节炎药物的应用。本发明的第二个目的是提供一种矢车菊素3-0-葡萄糖苷在制备预防类风湿性关节炎食品的应用。本发明的技术方案概述如下矢车菊素3-0-葡萄糖苷在制备防治类风湿性关节炎药物的应用。矢车菊素3-0-葡萄糖苷在制备预防类风湿性关节炎食品中的应用。矢车菊素3-0-葡萄糖苷具有较好的镇痛、抗急性炎症的作用，更重要的是具有抗佐剂性类风湿性关节炎的作用。体外细胞学试验证实其能够抑制巨噬细胞的NO的释放从而揭示其抗炎、镇痛及抑制佐剂性类风湿性关节炎的作用主要来自强大的抗氧化能力。矢车菊素3-0-葡萄糖苷所具有的多方面作用使其在防治类风湿性关节炎疾病方面的优势更加明显。矢车菊素3-0-葡萄糖苷来自于天然食物中，高效无毒，安全性极高，因此在临床防治类风湿性关节炎疾病中具有广阔的应用前景。本发明的矢车菊素3-0-葡萄糖苷是以天然健康食物为原料提取得到，安全无毒，且具有很好的抗炎镇痛作用，能够抑制佐剂性关节炎，预示其在类风湿性关节炎的预防和治疗中将有很好的应用前景。也可以应用于食品中用于预防类风湿性关节炎及其相关的急性炎症。.图1为含量为95%的矢车菊素3-0-葡萄糖苷样品与标准品的TLC薄层图；图2为含量为95%的矢车菊素3-0-葡萄糖苷样品的HPLC图谱。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1矢车菊素3-0-葡萄糖苷的最大耐受量试验及抗炎活性测试1.试验材料动物ICR小鼠，18~22g，雌雄兼用；SD大鼠，体重180~200g，雄性，北京试验动物研究中心提供。2.试剂矢车菊素-3-0-葡萄糖苷(以下简称C3G，纯度为95%);阿司匹林购自湖南永可轻工业品进出口有限公司；角叉菜胶购自中国联星实业有限公司；电子分析天平，旋涡混匀器。3.试验方法(1)最大耐受量试验将40只ICR小鼠分为两组，第l组，常水对照组；第2组，C3G组。每组20只，雌雄各半，禁食12h后，1天内给小鼠灌胃给药的C3G最大浓度0.4g/mL溶液，间隔4h给药1次。1天共给药3次，每次0.30ml/10g，连续观察7天。给药后正常颗粒料词养，自由饮水，自然光照12h/12h，室温2024'C，湿度60%。观察动物反应。(2)二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验小鼠50只，雌雄各半，随机分5组，灌服C3G溶液、阿司匹林水溶液或等容水后lh，于小鼠右耳用微量注射器滴二甲苯0.02ml并令二甲苯浸满鼠耳两面，40min后小鼠拉颈处死，沿鼠耳根部基线用眼科剪剪下两耳，称取左、右耳片重量，以右耳与左耳重量差的mg数表示炎症反应强度。(3)角叉菜胶致大鼠足肿胀试验大鼠40只随机分成5组，灌胃给药后lh，于每只大鼠右后脚足跖皮下注射1%角叉菜胶50pL致炎，玻璃容积法测量致炎前及致炎后1、3和5h足容积，计算肿胀度和各组的肿胀抑制率。4.试验结果(1)灌胃给药7天内小鼠无一死亡，给药第3、8天分别称重，体重变化两组没有差异，动物均增重。8天称重后逐只处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各器官均无异常。矢车菊素-3-0-葡萄糖苷灌胃给药的最大给药量为12g/kg，说明该提取物安全无毒。(2)测试结果显示组合物能够显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，且呈现量效依赖关系，其高剂量组与阿司匹林组的抗炎作用相当。表1C3G对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>与对照组比较，**P<0.01;采用T检验(n=10)(3)结果各药物组于致炎后lh与对照组比较均有显著性差异，致炎后3h和5h，高剂量组与对照组比较仍具有显著性差异，且与阳性药阿司匹林组作用相当，提示矢车菊素3-0-葡萄糖苷对角叉菜胶所致大鼠足肿胀有明显抑制作用，结果见表3。表2C3G对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>与对照组比较，**P〈0.01;T检验(n=8);EV:肿胀程度；EI:肿胀抑制率。实施例2矢车菊素3-0-葡萄糖苷的镇痛活性测试1.试验材料动物ICR小鼠，18~22g，雌雄兼用；北京试验动物研究中心提供。2.试剂矢车菊素3-0-葡萄糖苷(C3G)(矢车菊素3-0-葡萄糖苷含量95%);阿司匹林购自湖南永可轻工业品进出口有限公司；醋酸为分析纯，电子分析天平，旋涡混匀器。3.试验方法(l)醋酸扭体试验小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，分别灌胃药物或等量水，药后lh，各鼠腹腔注射0.7%HAC生理盐水溶液0.2ml，观察注射HAC后20min内小鼠扭体反应的次数，并计算镇痛抑制百分率。对照组扭体反应数-给药组扭体反应数镇痛百分率(％)=-xl00%对照组扭体反应数(2)小鼠热板法试验按赵一法进行试验，雌性小鼠于60士0.5。C热板测定小鼠舔后爪反应的潜伏期，选取于热板仪内不跳跃、于515s内出现反应的小鼠60只随机分5组，灌胃药物或等容水，药后lh，2h将小鼠置热板测定痛阈一次，超过60s不反应者立刻取出，反应时间按60s计。4.试验结果(l)醋酸扭体法试验结果显示矢车菊素3-O-葡萄糖苷能够一定程度抑制醋酸所致小鼠扭体反应。结果见表3。表3矢车菊素3-0葡萄糖苷对醋酸所致小鼠扭体的镇痛作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)热板法测试结果显示矢车菊素3-0葡萄糖苷具有一定的镇痛作用，且低剂量随着作用时间延长，作用效果越发显著。详细结果见表4表4组合物对热板试验小鼠舔足反应时间的影响(x±s，n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3矢车菊素-3-0-葡萄糖苷抗佐剂性类风湿性关节炎的作用1.试验材料动物ICR小鼠，18~22g，雌雄兼用；SD大鼠，体重180~200g，雄性，北京试验动物研究中心提供。2.试剂矢车菊素-3-0-葡萄糖苷(纯度为95%);弗氏完全佐剂，Sigma公司产品；地塞米松注射液，电子分析天平，旋涡混匀器。3.试验方法取雄性大鼠48只，体重160180g，按体重随机分为6组，分别为对照组(NS10mL/kg);模型组(NS10ml/kg);地塞米松组(0.85mg/kg);C3G中、高剂量(25、50、100mg/kg)组。各组每日ig给药l次，连续24d。实验开始后，先用容积法测量左、右后足跖容积，然后于第1天给药后1h，除对照组外，各组大鼠右后足跖SC弗氏完全佐剂O.lmL致炎。此后每3天测量大鼠右后足跖容积，并观察鼠耳红斑、尾部结节等出现情况及体重变化。计算并比较各组动物在不同时间的足跖肿胀度(足跖肿胀度=致炎后足跖容积一致炎前足跖容积)。4.试验结果给佐剂后模型组大鼠右后足足跖肿胀度明显增加，且与对照组比较差异显著(PO.01);而地塞米松组、组合物中、高剂量组大鼠右后足足跖肿胀度明显减小(P0.05、0.01)。表明组合物对佐剂诱发的原发性足跖肿胀具有良好的对抗作用。结果见表5。实施例4(1)提取5Kg黑豆皮中加入5000g的水常压5(TC温浸提取5次，提取时间分别为5、4、3、2、l小时，过滤，滤网的目数为120，提取液合并过滤，滤网的目数为100，得上清液；(2)大孔树脂吸附分离将(1)中提取液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-0-德萄糖苷的组分，将其合并，在温度^6(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，糖度为40，得矢车菊素3-0-葡萄糖苷的富集物；矢车菊素3-0-葡萄糖苷的含量为31.7%;(3)聚酰胺树脂分离大孔树脂吸附分离后得到的矢车菊素3-0-葡萄糖苷的富集物分散至水中(1:4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20%、50%、70%、95%的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-0-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度^6(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，糖度为10，得矢车菊素3-0-葡萄糖苷的富集物。矢车菊素3-0-葡萄糖苷的含量为54.3%。步骤(3)中所述的薄层层析检测方法采用聚酰胺薄膜，展开溶剂为体积比为4:1的甲醇-水，显色剂为重量百分浓度为5%三氯化铁乙醇溶液，与矢车菊素3-0-葡萄糖苷标准品对照；(4)Toyopearl树脂柱层析分离将通过聚酰胺分离后富含矢车菊素3-0-葡萄糖苷的组分进行Toyopearl树脂柱层析，用水洗脱除去杂质，再用体积百分比为20%、30%、40%的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以矢车菊素3-0-葡萄糖苷纯品作为对照品，收集富含矢车菊素3-0-葡萄糖苷的组分，并将其在温度56(TC，真空度为0.060.08MPa减压浓縮，糖度为15，矢车菊素3-0-葡萄糖苷的含量为77.3%。(5)MCI凝胶柱层析进行纯化将(4)中得到的含有矢车菊素3-0-葡萄糖苷的组分进行MCI凝胶柱层析纯化，用水洗脱除去杂质，再用体积百分比30%的甲醇进行洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以矢车菊素3-0-葡萄糖苷纯品作为对照品，收集富含矢车菊素3-0-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度^6(TC，真空度为0.06-0.08MPa减压浓縮，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到矢车菊素3-0-葡萄糖苷(3g)，矢车菊素3-0-葡萄糖苷的含量为95%。本实施例中的原料还可以选黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果。矢车菊素3-0-葡萄糖苷的HPLC检测方法7色谱柱YMCC-l8(250X4.6mm)检测波长520nm流速0.8ml/min进样量10ul柱温3Q°C流动相A:含0.5%的磷酸水溶液B:水:乙腈邻醋酸:磷酸=50:48.5:1:0.5梯度如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表5C3G对大鼠佐剂性关节炎原发性反应的影响(x±s，"=8><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与对照组比较MP<0.01;与模型组比较*P<0.05，**P<0.0权利要求1.矢车菊素3-O-葡萄糖苷在制备防治类风湿性关节炎药物的应用。2.矢车菊素3-0-葡萄糖苷在制备预防类风湿性关节炎食品中的应用。全文摘要本发明公开了矢车菊素3-O-葡萄糖苷在制备防治类风湿性关节炎药物或食品的应用，矢车菊素3-O-葡萄糖苷具有较好的镇痛、抗急性炎症的作用，更重要的是具有抗佐剂性类风湿性关节炎的作用。体外细胞学试验证实其能够抑制巨噬细胞的NO的释放从而揭示其抗炎、镇痛及抑制佐剂性类风湿性关节炎的作用主要来自强大的抗氧化能力。矢车菊素3-O-葡萄糖苷所具有的多方面作用使其在防治类风湿性关节炎疾病方面的优势更加明显。矢车菊素3-O-葡萄糖苷来自于天然食物中，高效无毒，安全性极高，因此在临床防治类风湿性关节炎疾病中具有广阔的应用前景。文档编号A61P29/00GK101306003SQ20081005274公开日2008年11月19日申请日期2008年4月15日优先权日2008年4月15日发明者丹刘,刘岱琳,於洪建申请人:天津市尖峰天然产物研究开发有限公司