专利名称：：吲哚-2,3-二酮在制备抗真菌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及吲哚-2，3-二酮(MW147，indole-2,3-dione)在制备抗真菌药物中的应用。技术背景目前广谱抗生素、免疫抑制剂及糖皮质激素的大量应用及滥用，尤其是流行性疾病如流行性感冒、AIDS、SARS、禽流感等频繁发生的情况下，病人免疫力降低，导致真菌感染率逐年升高。而且已有抗真菌药物特异性低、毒性大、易耐药等不良因素，不仅使患者生活质量下降，而且浪费了大量的人力和财力。西药抗真菌药物效果虽然显著，但多数价格昂贵且毒性大，因此在传统植物和海洋物质中寻找广谱、毒副作用小的天然抗真菌药物是广大医药工作者共同关注的焦点。研发毒副作用小安全范围大的抗真菌的天然药物，而且有别于常规应用的抗真菌药品的保健型抗真菌药，是各国医药学专家所期盼的。随着近年对中药品及其它天然物质的广泛研究和开发，激发了医药科学工作者的浓烈兴趣。吲哚-2,3-二酮，是寄生于海洋生物龙虾体内微生物的一种菌株产生的抗生素物质，它是维持龙虾生存所必不可少的一种天然海洋活性物质，又存在于某些植物中药材中，现已人工合成，故资源丰富。其化学结构明确，是成份单一的紫红色有机单体结构。结构式为近年来又发现其是存在于人和动物体内的一种内源性活性因子，与体内多种内源性物质如:组成黑色素的基本单位4，5-吲哚醌，以及抗癫痫中药青黛中的靛玉红都有着极大的相似性。吲哚-2，3-二酮具有独特的分子结构特征，是现有抗真菌药和人工合成化学品均不具备的。吲哚-2,3-二酮分子量小，克服了空间位阻，并存在1位和2位的化学变构活性基团，增加了对粘膜上皮的穿透力，增加了机体的免疫力，为其开发为为人体所用的药物提供了天然优势。纵观吲哚-2，3-二酮的药理活性及其分子结构特征，为其开发为新型抗真菌药物提供吲哚-2,3-二酮了依据，其抗真菌作用与古典记载的青黛的清热解毒的药理作用及临床应用相吻合。因此将吲哚-2,3-二酮开发为具备广谱、低毒、高效又具备保健性质的天然新型抗真菌药物具备广泛的应用前景，并且有良好的经济价值和国内外市场潜力。
发明内容本发明的目的是提供吲哚-2，3-二酮在制备抗真菌药物中的应用。所述的吲哚-2，3-二酮为天然产物或人工合成产品。其纯化方法包括用超纯水和无水乙醇按hl-8比例混合，加入天然或人工合成的吲哚-2,3-二酮，在磁性搅拌器中缓慢加热至溶解，然后逐渐冷却呈针形橘红色结晶，加热温度为50-8(TC,滤去上清液，按上述方法重复纯化l-3次，以减少重金属离子，其结晶纯度达99%;将经纯化的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过80目筛，与药用淀粉按l:l-10重量比例混匀制成50或100mg规格的胶囊。或将经纯化的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过80目筛，按湿法制粒工艺制成50或100mg规格的片剂。服用方法治疗真菌时可用胶囊或片剂，每人每日300mg，可分2-3次饭后服用。本发明吲哚-2,3-二酮在制备抗真菌药物中应用的有益效果如下首先证明了卩引哚一2，3—二酮具有有效抑制和杀灭真菌的作用。已完成临床前在大鼠的急性和慢性毒理和药理学研究，对血液生化和心、肝、脾、肺、肾、生殖等二十种组织进行病理切片检测，完成了长期口服给药的安全性评价。结果如下1、体外抗真菌活性试验结果显示，吲哚一2，3—二酮对红色毛癣菌、羊毛状小孢子菌有明显抑菌作用。试管法结果表明，H引哚一2，3—二酮的MIC范围为0.500%0.016%,以抑制红色毛癣菌、紫色癣菌、羊毛状小孢子菌、断发癣菌效果最好。2、临床对20例患足癣的志愿者进行治疗，总有效率95.0%。3、吲哚一2，3—二酮小鼠急性毒性LD50为1091±359mg/kg，ig;在Wistar大鼠6个月长期毒性试验证明吲哚一2，3—二酮对进食情况及行为活动等无影响，血液生化学等指标未见异常，在22种脏器和组织的病理组织学观察也未见异常，说明H引哚一2，3一二酮毒性低。具体实施方式选用天然或人工合成的吲哚一2，3—二酮，对其进行纯化。纯化方法包括用超纯水和无水乙醇按hl-8比例混合，加入人工合成的吲哚一2，3—二酮，在磁性搅拌器中缓慢加热至溶解，然后逐渐冷却呈针形橘红色结晶，加热温度为50-8(TC，滤去上清液，按上述方法重复纯化1-3次，以减少重金属离子，其结晶纯度达99%;将经纯化的吲哚一2，3—二酮研磨成粉末过80目筛，与药用淀粉按l:1-10重量比例混匀制成100mg规格的胶囊。或将经纯化的吲哚一2，3—二酮研磨成粉末过80目筛。按下述方法制成500mg规格的片剂。实施例l:制剂的制备片剂的制备口引哚-2,3-二酮100mg乳糖100mg淀粉295mg硬脂酸镁5mg共500mg各自称量出上述各种成分，将吲哚-2，3-二酮结晶粉碎过80目筛的粉末、乳糖、淀粉混合，用湿式法制粒，干燥，整合后与硬脂酸镁混合，压片，制成每片重量500mg的片剂。胶囊的制备吲哚-2,3-二酮100mg淀粉395mg硬脂酸镁5mg共500mg各自称量出上述各成份,与过80目筛的吲哚-2，3-二酮结晶粉末混合均匀，慎充胶囊，制成每个纯重500mg的胶囊剂。霜剂的制备吲哚-2,3-二酮lg霜剂基质加至100g混匀制成1%的吲哚-2，3-二酮的霜剂，分装成每支10g或15g的包装。下面通过试验例进一步阐述本发明n引哚-2，3-二酮在制备抗真菌药物中应用的有益效果。试验例l吲哚一2，3—二酮体外抗真菌活性实验研究试验材料与方法一、ISA抑菌实验1、材料1.1吲哚醌由青岛大学医学院药理组提供。取1%吲哚醌(8磅灭菌)，4'C保存备用。用前倍比系列稀释，共稀释10个浓度(0.5%0.0001%)。1.2实验菌种由青岛大学医学院病源微生物教研室提供。红色毛癣菌、羊毛状小孢子菌。1.3培养基沙氏琼脂平板。2、方法实验菌的新鲜培养物用灭菌生理盐水配成相当于3xl06/ml细菌数浊度的菌液,取50^1涂布接沙氏琼脂平板，以菌体单个分散为宜;分别在平板表面滴加5(HilISA液，平放待被琼脂平板吸干,置37'C生化培养箱培养。2448h后观察平板加ISA部位是否形成抑菌圈,抑菌圈内有无细小菌落;在低倍显微镜下观察抑菌圈内实验菌的形态大小及细小菌落的形态特征;并涂片革兰染色，镜检观察菌体大小、形态结构、染色反应。根据加ISA部位形成抑菌圈及抑菌圈内接种的实验菌、细小菌落中菌体大小、形态结构、染色反应的改变判定溶菌酶对实验菌的抗菌作用。二、试管法测定ISA的抗真菌MIC1、材料1.1吲哚醌由青岛大学医学院药理组提供。取1%吲哚醌(8磅灭菌)，4'C保存备用。用前倍比系列稀释，共稀释10个浓度(0.5%0.0001%)。1.2实验菌种由青岛大学医学院病源微生物教研室提供。白色念珠菌、红色毛癣菌、新型隐球菌、石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌、申克氏孢子丝菌、絮状表皮癣菌、断发癣菌、羊毛状小孢子菌、裴氏着色芽生菌、黄曲霉菌、紫色癣菌2、方法2.1药基配制:对照管不加药物。培养基含药浓度为倍比稀释,即0.50%、0.25%、0.125%、至0.0001%共10个浓度。2.2菌液制备:取培养2周菌种置消毒乳钵,加生理盐水少许,研磨呈乳浊液，再加生理盐水调节菌液浓度为3xl06/ml菌丝碎片。白色念珠菌和新型隐球菌直接稀释。2.3菌液接种:每管不同浓度含药培养基分别接种50^1菌液，置37'C生化培养箱培养。含最小药物稀释浓度管,若无真菌生长则为最小抑菌浓度(MIC)。试验结果一、ISA抑菌实验1、接种红色毛癣菌的平板于24h在各加ISA的部位均形成直径1.61.8cm的抑菌圈;48h后在加7.813吗125pglSA的抑菌圈内形成细小菌落,菌落数量随ISA量增加而减少。镜下见加7.813吗62.5吗ISA的抑菌圈内实验菌呈单个分散存在，形态大小无明显改变或形成菌落,细小菌落为颗粒型,菌落中部的菌体膨大或破裂。革兰染色片镜检见大量菌体膨大呈球形、不规则或粗长丝状的革兰阴性或阳性细胞,革兰阴性细胞内有呈革兰阳性的斑块或颗粒，或菌体裂解释放大量颗粒,及细胞结构疏松或呈空壳状的细胞。2、接种羊毛状小孢子菌的平板48h后在各加ISA部位形成直径1.21.6cm的抑菌圈,72h后在加15.625吗62.5吗ISA的抑菌圈内有针尖大小的菌落。镜下见抑菌圈内的实验菌呈单个分散存在，或形成颗粒型L型菌落,菌落中部菌体显著膨大或裂解。革兰染色镜检见大量菌体膨大呈巨球形或大小不一形态多样的革兰阴性或革兰阳性细胞,革兰阴性的膨大细胞内有呈革兰阳性的大斑块或颗粒，或细胞裂解释放大量革兰阳性颗粒。实验结果显示微量ISA对红色毛癣菌和羊毛状小孢子菌即有显著抗菌作用。二、试管法测定ISA的抗真菌MIC对照组接种后,一般均在13d开始生长。试管法ISA的MIC范围为0.500%0.016%,以红色毛癣菌、紫色癣菌、羊毛状小孢子菌、断发癣菌效果最好，对白色念珠菌、申克氏孢子丝菌和裴氏着色芽生菌效果较差，见表1。表lISA对真菌MIC测定结果菌种名称ISA(%)白色念珠菌0.5000红色毛癣菌0.0156新型隐球菌0.1250石膏样毛癣菌0還5石膏样小孢子菌0.0625申克氏孢子丝菌0.2500絮状表皮癣菌0.0625断发癣菌0.0313羊毛状小孢子菌0.0313裴氏着色芽生菌0.2500黄曲雾菌0.0625紫色癣菌0.0156试验例2:吲哚一2，3—二酮(癣迪)I期临床试验研究试验材料与方法(一)受试者的选择条件经过体检无皮肤病，无药物接触过敏史，四周内未参加其他皮肤外用药物试验及年龄在20至60岁之间的健康人。(二)局部用药浓度1、基质2、癣迪(标准体)3、癣迪(5倍体)以上制剂皆由青岛医学院临床药理研究所配制。(三)分组，选取符合上述条件的受试者20人，分成癣迪标准组和5倍体组各IO人，每组男女各5人，随机分组。选观察标准组，无反应后再观察5倍体组。(四)给药方法癣迪与基质按斑贴方法给予，即在左前臂屈侧皮肤贴敷2X2Cm2面积的癣迪，右侧皮肤贴敷同样面积的基质作为对照，覆盖纱布和玻璃纸，保留24小时。(五)观察指标及时间贴敷后24、48、72h及至7d,观察局部皮肤反应和自觉症状(痛、痒)，并用分级法记录结果。试验结果癣迪标准体和基质对照组标准体贴试验均为阴性，而5倍体有1例于24小时出现红斑及瘙痒，无水泡，72h皮诊及瘙痒消失。结果见表2。表2癣迪皮肤反应结果试验例数贴敷后不同时间反应例数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>试验结论癣迪标准组斑贴试验未出现皮肤反应和自觉症状，5倍体有1例出现皮肤红斑反应，故建议临床应用癣迪标准体为好，不宜随意提高浓度。试验例3:n引噪一2，3—二酮(癣迪)临床疗效观察足癣是临床常见病，再次感染率极高，尤以夏季多发为特点，表现为糜烂滋水，浸渍发白，干燥脱屑，角化过度。皲裂疼痛等症状虽不致有生命之忧，但也确实常困扰人们的生活，并有逐年上升趋势。临床使用吲哚一2，3—二酮霜剂，由20名患足癣的志愿者试用，获得满意疗效。临床资料本组20例，男12例，女8例，年龄20~60岁，病程3个月~9a。治疗方法治疗时使用吲哚一2，3—二酮霜剂(癣迪)涂于患处，每日35次，7d为一疗程，一般连用2~3个疗程即可。疗效标准临床症状全部消失，无水疱，色泽转变，皮损痊愈，真菌镜检阴性且随访3个月内无复发为治愈；临床症状明显减轻，皮损恢复，真菌镜检阴性为好转；使用2个疗程治疗后症状及皮损均无明显改善，真菌镜检阳性为无效。治疗结果治疗结果见表3。20例志愿者中，最长治疗10天，最短5天，总有效率95.0%。表3癣迪对20例足癣志愿者的疗效<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>试验例4:吲哚一2，3—二酮的急性、慢性毒性试验试验材料1、动物昆明种小鼠(二级)，体重18—22g，由河北医科大学试验动物中心提供，合格证号:冀医动字04056。2、药和试剂U引哚-2,3-二酮、西黄蓍胶试验方法1、d引哚-2,3-二酮的急性慢性毒性试验1.1动物分组昆明种小鼠50只，大鼠160只，雌雄兼有，体重18—20g，180—220g随机分为5组，每组10只；试验前禁食12h，自由饮水；控制室温在20士2'C。1.2药品的配备西黄蓍胶用生理盐水配制成1.25%的胶体供试验使用；吲哚-2,3-二酮为橙色粉末状，不溶于水，试验前用1.25%的西黄蓍树胶配制成所需浓度的悬浊液供试验使用。1.3给药方法一次性ig，剂量分别为3，2，1.5，1，0.7g'kg-l,组间比为1^0.7，ig容积0.6ml/只。试验于上午进行。1.4半数致死量(LD5Q)测定观察给药后24h各组动物的死亡和存活情况，计算死亡率，采用孙氏改良法计算LD50。试验结果1、吲哚-2,3-二酮的急性毒性试验动物的一般表现中毒动物表现为少动、萎靡不振、行走不稳等。存活动物观察7d，生长良好，体重增加，尸检，心肝肾脑等组织肉眼观察未发现异常变化。2、半数致死量(LD50)的测定为用药后24h的死亡率，采用孙氏改良法计算LD5(^1091士359mg'kg-l(95%可信区间为751~1374mg'kg陽l)为确保长期用药的安全性，按国家医药食品监督管理局、国家I类新药慢性毒性试验标准，对吲哚-2,3-二酮进行安全性综合评价。d引哚-2,3-二酮按临床用量的1.17、58.5、117倍的不同剂量给大鼠连续灌胃3个月、6个月及第7个月恢复期对大鼠的体重增长、进食情况以及行为活动等无显著影响，对大鼠的血液学、血液生化学及心电图等各项指标亦无明显的不利影响。22种脏器与组织的病理组织学观察与空白对照组比较均未见异常。结果表明，吲哚-2，3-二酮长期大剂量口服用药，对动物无明显损害，未发现因蓄积而对机体产生的毒性反应，是一种安全可靠的药物。权利要求1、吲哚-2，3-二酮在制备抗真菌药物中的应用。2、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述的吲哚-2，3-二酮为天然产物或人工合成产品。3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的吲哚-2，3-二酮通过下述方法纯化用超纯水和无水乙醇按hl-8比例混合，加入吲哚-2,3-二酮，在磁性搅拌器中缓慢加热至溶解，然后逐渐冷却呈针形橘红色结晶。4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于加热温度为50-8(TC。5、根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所得到的针形橘红色结晶再按同样方法重复纯化l-3次，以减少重金属离子。6、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将所述的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末过80目筛，与药用淀粉按l:l-10重量比例混匀制成50或100mg规格的胶囊。7、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将所述的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过80目筛，按湿法制粒工艺制成50或100mg规格的片剂。全文摘要本发明涉及吲哚-2，3-二酮在制备抗真菌药物中的应用，所述的吲哚-2，3-二酮为天然产物或人工合成产品，其毒性低，副作用小，具有良好的抗真菌作用。文档编号A61K31/404GK101214241SQ20081005573公开日2008年7月9日申请日期2008年1月8日优先权日2008年1月8日发明者于兹东,三周,旺岳,丽张,霞黄申请人:青岛大学