专利名称：生物胶原对抗生药物的化学稳定性改善方法
技术领域：
本发明用牛胶原并修饰，对抗生药物盐酸米诺环素的化学稳定性的改善 方法，适用口腔医学的药物缓释系统，属于药剂领域。
技术背景药物缓释系统是控制释放给药系统(Controled Releases Drug Delivery System)，简称CRD。 CRD比传统剂型有其优越性。牙周炎是口腔常见病，发病率为70-80%。在牙周局部用药是牙周治疗中 重要的一项。目前牙周炎局部有效缓释剂有多种。合成的聚合物载体材料越 来越受重视。如半合成高分子，常用的是纤维素衍生物，如甲基纤维素醚。 合成高分子材料，常用的有聚乙烯醇、聚乳酸，还有美国的FDA。在我国临 床上使用的是日制派丽奥盐酸米诺环软膏。但他们的共同特点为不可吸收的 物质，在深牙周、冠周袋内载体可成异物，经缓释后如不修复，异物被吸收， 加重再感染，增加治疗费用和患者的痛苦，如氰基丙烯酸烷基酯P(ACA)，它 可生物降解，但在体内反应会生成甲醛，酯解生成水溶液的P(ACA)，产物有 毒性，这一点限制了它的应用。总之目前巿场及临床使用的为不可吸收物质， 载体仅起到缓释作用。我们研究的是一种胶原生物载体，它不仅起到缓释作 用，而且有组织可吸收，对牙周有修复功能。发明内容胶原作为一种常见的蛋白质，其特性有别于上述合成高分子。这种特性 就在于胶原与人体接触模式于其他高分子不同。胶原作载体，则接近人体组 织成分，是人细胞间质物质。胶原在组织与器官形成过程中所起到的重要作用，是与许多不同细胞表达功能相关的。研究表明胶原在组织再生过程中 起到作用，胶原同时也表现出生物可降解性、弱抗原性和优越的生物相容性。本发明用牛皮胶原作可吸收的、促进组织修复的牙周炎缓释系统载体。 但胶原的a >^112具有活跃的化学性质，活跃的氨基基团就会与醛类化合物发 生反应，生成弱碱，即所谓西夫碱，反应产物会进一步生成有色物质，该反 应式如下所示<formula>formula see original document page 4</formula>而口腔医学常用的抗生素盐酸米诺环素含有两个醛基如下图，很容易与 胶原的氨基基团发生反应，从而使得药物变色继而变性失效，疗效降低，治 疗效果大打折扣。<formula>formula see original document page 4</formula>本发明首先将胶原通过酶法水解制成可溶性胶原；胶原在溶液中与酸酐 进行胶原氨基化学修饰，将胶原的"-NH2〃基蒙蔽，胶原结构由H2N-R-COOH 生成R-OOH成为W相；另外，把盐酸米诺环与油混合，药物外层包有油层 增加其与胶原化学反应难度成为0相；再用增稠剂加入到修饰胶原W相与油 混盐酸米诺环0相制成0/W均一溶液，因W相中为R-00H，所以0/W乳 液具有低pH值。本发明利用胶原氨基化学修饰，增强了生物胶原对盐酸米诺 环抗生素的化学稳定性，制成0/W系统。胶原载体的盐酸米诺环素缓释剂能 够在口腔医学中得到应用。本发明改善生物胶原对盐酸米诺环素抗生药物的化学稳定性，分四个步骤1)可溶性胶原的调制；2)胶原修饰；3)油相调制；4) OAV系统调制。 步骤l)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，加入质量百分浓度为2 4。/。的浸灰剂Ca(OH)2，以 及10倍于灰皮质量的水进行浸灰，室温反应24 48h后，充分水洗；再用质量百分浓度为4 8。/。的脱灰剂NH4Cl或(NH4)2S04，以及5倍于灰皮 的水进行脱灰，室温反应3 10h后，充分水洗；破碎；用质量百分浓度为1 5。%。的胃蛋白酶或胰蛋白酶之一或者两者混合 进行酶水解；离心，转速为10000 20000rpm;用NaOH调节pH值至7，采用质 量百分浓度为4。/。的NaCl进行盐析，室温静置24h以上；二次离心，转速为 10000 20000rpm;用0.5mol/L的醋酸，进行酸溶解，得到可溶性胶原；步骤2)胶原修饰将可溶性胶原溶液用NaOH或NaHC03调至pH7 9，加入丁二酸酐使 pH=3~4，室温反应18h以上，将胶原的a-NH2蒙蔽，修饰成为羧基化合物， 反应式如下<formula>formula see original document page 5</formula>其中P代表胶原蛋白冷冻干燥，l(TC以下保存； 步骤3)油相调制将盐酸米诺环抗生素与三乙酸甘油酯以质量比1:5 1:10，在室温下混合， 调制成油相；步骤4) 0/W系统调制将上述步骤2)冷冻干燥物采用0.5mol/L的醋酸或盐酸进行酸溶解，成 为水相，将调制油相分散到水相中，再用增稠剂丙三醇配制成相对质量比^^^^=5%的O/W系统。 丙二醇+水相+油相制备成以胶原为载体的盐酸米诺环素缓释剂。化学稳定性改善说明对胶原氨基进行修饰，胶原分子上侧链氨基转变 为酰氨基，改变氨基活性，改善胶原的化学稳定性。将胶原分子上侧链氨基 转变为酰氨基，同时衍生出羧基，增加了侧链的羧基基团，使系统的pH值降 低，创造了盐酸米诺环素的稳定环境；胶原为水相，盐酸米诺环素为油相， 胶原与药相互蒙蔽，又使系统增加了化学稳定性。以上提高生物胶原对盐酸 米诺环素抗生药物的化学稳定性，适用口腔医学的药物缓释剂系统。本发明的效益胶原材料在药物缓释载体有广阔的应用空间。就其良好 的生物相容性和生物降解性来说，是金属、陶瓷和其他高分子材料不可比拟 和代替的一种优良天然高分子材料。近年来，蛋白质修饰技术现已广泛应用 于改善胶原蛋白生物材料的机能和生物稳定性。对胶原进行定量可控的化学 修饰，研制出新一代生物医用材料，可以赋予胶原新的特性。在提高生物医 用材料科技含量的基础上，扩大了我国医用生物材料市场份额，为我国人民 的生活健康质量提供保证。可以说，本发明的原料由于使用制革废弃物，不仅缓解了制革产业的环境压力，实现了生物资源的再生循环利用，具有重大 的经济及社会意义，而且为实现生物材料的更广泛应用开辟了新的道路。
图1用蛋白酶去除非螺旋区 图2胶原修饰前后的红外线图谱 图3胶原修饰前后的等电点具体实施方式
盐酸米诺环抗生素在低pH范围里较稳定.但其分子结构含有"=0〃化学 键易与胶原中的"-NH/基发生"西夫碱〃 化学反应生成物为黑色，失去药 效。本发明胶原在溶液中与酸酐进行胶原氨基化学修饰，将胶原的、、-NH/ 基蒙蔽，胶原结构由H2N-R-COOH生成R-OOH成为W相；另外，把盐酸米 诺环与油混合，药物外层包有油层增加其与胶原化学反应难度成为O相；再 用增稠剂加入到修饰胶原W相与油混盐酸米诺环O相制成0/W均一溶液， 因W相中为R-00H，所以O/W乳液具有低pH值。本发明利用胶原氨基化 学修饰，增强了生物胶原对盐酸米诺环抗生素的化学稳定性，制成0/W系统。例采用NH4C1 -胃蛋白酶-NaHC03调制的0/W系统 步骤l)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为3%的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室温反应24h后，充分水洗，再用质量百分浓度 为6。/。的脱灰剂NH4Cl，水50ml，进行脱灰，室温反应6h;充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度3^的胃蛋白酶水解，4"72h;离心，转速为15000rpm;用NaOH 调节pH值至7，采用质量百分浓度为4。/。的NaCl盐析，静置24h; 二次离心，转 速为15000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，得到可溶性胶原，10g 灰皮得到0.9g胶原。酶水解提取胶原蛋白的原理如图l所示(a)为前胶原蛋白的原始存在状 态，中间是规则的螺旋区域，两端是非螺旋区，正是由于两端非螺旋区域的 存在导致胶原蛋白不可溶，所以需要选择合适的方法除去非螺旋区以使胶原能够溶解。本发明选用胃蛋白酶作催化剂，该酶能够有选择性地切断非螺旋 区域的N-端和C-端伸展肽，如图(b)，规则螺旋区的胶原得以成可溶性胶原。 步骤2)胶原修饰将可溶性胶原溶液用NaHC03调至pH8，加入丁二酸酐，使溶液pH-3.5， 室温反应24h，溶液冷冻干燥，l(TC以下保存。由图2可以看出未修饰胶原 中酰胺I带位于1641cm—1，为C二O键伸縮振动峰，酰胺II带位于1539cm"， 为N-H弯曲和C-N伸缩振动峰的混频峰，酰胺II—带位于1235cm—1 ，为C-N伸 縮振动峰。这些胶原蛋白的FT-IR特征吸收峰证明了胶原的结构。修饰后胶 原位于3430 cm—处N-H伸縮振动峰向短波方向发生位移，这主要与胶原中 NH及H键有关，在一定程度上破坏了螺旋之间的氢键，-NH2被蒙蔽，氨基 转变为酰胺基，同时衍生出羧基，-COOH数量增加，系统的pH值向酸性方 向移动，故等电点由pH5.5降低至pH4.5，如图3。胶原中的氨基得到了修饰， 修饰率达到85%。步骤3)油相调制将盐酸米诺环抗生素与三乙酸甘油酯以1:5的质量比室温混合，调制成油相。步骤4) 0/W系统调制上述2)修饰胶原冻干物用0.5mol/L的醋酸充分溶解，制成2%的胶原溶 液，将调制油相分散到水相，再用添加剂丙三醇配制成相对质量比^i^/L韭=5%的Q/W系统。制成以胶原为载体的盐酸米诺环素缓释 丙二醇+水相+油相剂。例2:采用NH4C1 -胃蛋白酶-NaOH调制的0/W系统 步骤l)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为"/。的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，在室温反应48h后，充分水洗，再用质量百分浓度 为4%的脱灰剂,4(:1，水50ml，进行脱灰，室温反应10h;充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度2^的胃蛋白酶水解，4。C72h;离心，转速为15000rpm;用NaOH 调节pH值至7，采用质量百分浓度为4。/。的NaCl进行盐析，静置48h; 二次离心， 转速为15000rpm;用0,5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，得到可溶性胶原。步骤2)胶原修饰将可溶性胶原溶液用NaOH调至pH7，加入丁二酸酐，使溶液pH=4,室 温反应18h，溶液冷冻干燥，l(TC以下保存。修饰前后胶原的红外图谱与例1 中图2的红外图谱大致相似。且修饰后胶原的等电点由原来的pH5.3降低至 pH4.4。说明胶原中的氨基得到了修饰。在本例中用NaOH替代例1弱碱性 NaHC03目的是为了提高系统的溶液浓度，但是带来了负面影响，修饰率为 66%。这是由于NaOH的碱性较强，破坏了胶原的一级结构。步骤3)油相调制及步骤4) 0/W系统调制同例1步骤3) 、 4)。例3:采用(NH4)2S04-胃蛋白酶-NaHC03调制的0/W系统 步骤l)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为4%的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室温反应24h后，充分水洗，再用质量百分浓度4% 的脱灰剂(NH4)2S04，水50ml，进行脱灰，室温反应5h后，充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度5^的胃蛋白酶水解，4°C36h;离心，转速为20000rpm;用NaOH 调节pH值至7，釆用质量百分浓度为4。/。的NaCl盐析，静置36h; 二次离心，转 速为20000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，得到可溶性胶原。相对 例l，得到相同的可溶性胶原，制备工艺縮短了25h，工业成本下降，但是排 除水中增加了SO/.离子，增加了废水处理的难度及费用。步骤2)胶原修饰同例1步骤2)。红外检测结果表明修饰前后胶原的红外图谱与例1中 图2的红外图谱大致相似。且修饰后胶原的等电点由原来的pH5.4降低至 pH4.2。说明胶原中的氨基得到了修饰，修饰率为83%。步骤3)油相调制.-将盐酸米诺环抗生素与三乙酸甘油酯以1:10的质量比室温混合，调制成 油相。步骤4) 0/W系统调制 同例1步骤4)。例4:采用(NH4)2S04-胃蛋白酶-NaOH调制的0/W系统步骤l)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为3%的浸灰剂Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室温反应48h后，充分水洗，再用质量百分浓度6% 的脱灰剂(NH4)2S04，水50ml，进行脱灰，室温反应3h后；充分水洗；绞碎； 用质量百分浓度为1%。的胃蛋白酶水解，4"C72h;离心，转速为10000rpm;用 NaOH调节pH值至7，采用质量百分比4。/。的NaCl进行盐析，静置12h; 二次离 心，转速为10000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，得到可溶性胶原。 步骤2)胶原修饰将可溶性胶原溶液用NaOH调至pH9，加入丁二酸酐，使溶液pEN3，室 温反应20h，溶液冷冻干燥，l(TC以下保存。修饰前后胶原的红外图谱与例1 中图2的红外图谱大致相似。且修饰后胶原的等电点由原来的pH5.6降低至 pH4.8。说明胶原中的氨基得到了修饰，修饰率达到63%。步骤3)油相调制及步骤4) 0/W系统调制同例1步骤3) 、 4)。例5:采用NH4C1 -胰蛋白酶-NaHC03调制的0/W系统 步骤l)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为4%的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室温反应48h后；充分水洗，再用质量百分浓度为 8e/。的脱灰剂NH4Cl，水50ml，脱灰，室温反应6h后，充分水洗；绞碎；用质 量百分浓度为3%。的胰蛋白酶水解，4°C96h;离心，转速为15000rpm;用NaOH 调节pH值至7，采用质量百分比4。/。的NaCl盐析，静置24h; 二次离心，转速为 15000rpm;用0.5mol/L的醋酸200ml进行酸溶解，得到可溶性胶原。各种酶具有专一性，胃蛋白酶对苯丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸作用力较强， 消化力为14.06，而胰蛋白酶对赖氨酸、精氨酸作用力较强，消化力为11.32， 对于本实验胰蛋白酶和胃蛋白酶在胶原酶解的得率上区别不大。步骤2)胶原修饰同例1步骤2)。红外检测结果表明修饰前后胶原的红外图谱与例1中 图2的红外图谱大致相似。且修饰后胶原的等电点由原来的pH5.5降低至 pH4.3。说明胶原中的氨基得到了修饰，修饰率为84%。步骤3)油相调制以及步骤4) OAV系统调制 同例1步骤3) 、 4)。例6:采用NH4C1 -胃蛋白酶順蛋白酶-NaHC03调制的0/W系统步骤1)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，称取10g，破碎。加入质量百分浓度为3%的浸灰剂 Ca(OH)2，水100ml，浸灰，室温反应24h后，充分水洗，再用质量百分浓度为 6。/。的脱灰剂NH4C1，水50ml，进行脱灰，室温反应6h后，充分水洗；绞碎；用质量百分浓度为3%。的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，二者质量比为l: l的混合酶，4'C72h;离心，转速为15000rpm;用NaOH调节pH值至7，采月j质量百分 比4。/。的NaCl进行盐析，静置24h; 二次离心，转速为15000rpm;用0.5mol/L 的醋酸200ml进行酸溶解，得到可溶性胶原。胶原的产率相对例l提高将近八 个百分点，10g灰皮得到1.5g胶原，比单独一种酶提取胶原的优越性大。 步骤2)胶原修饰同例1步骤2)。红外检测结果表明修饰前后胶原的红外图谱与例1中 图2的红外图谱大致相似。且修饰后胶原的等电点由原来的pH5.6降低至 pH4.2。说明胶原中的氨基得到了修饰，修饰率为87%。步骤3)油相调制以及步骤4) 0/W系统调制同例1步骤3) 、 4)。
权利要求
1、一种生物胶原对抗生药物的化学稳定性的改善方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1)可溶性胶原的调制将牛二层皮制成灰皮，加入质量百分浓度为2～4％的浸灰剂Ca(OH)2，以及10倍于灰皮质量的水进行浸灰，室温反应24～48h后，充分水洗；再用质量百分浓度为4～8％的脱灰剂NH4Cl或(NH4)2SO4，以及5倍于灰皮的水进行脱灰，室温反应3～10h后，充分水洗；破碎；用质量百分浓度为1～5‰的胃蛋白酶或胰蛋白酶之一或者两者混合进行酶水解；离心，转速为10000～20000rpm；用NaOH调节pH值至7，采用质量百分浓度为4％的NaCl进行盐析，室温静置24h以上；二次离心，转速为10000～20000rpm；用0.5mol/L的醋酸，进行酸溶解，得到可溶性胶原；步骤2)胶原修饰将可溶性胶原溶液用NaOH或NaHCO3调至pH7～9，加入丁二酸酐使pH＝3～4，室温反应18h以上，将胶原的α-NH2蒙蔽，修饰成为羧基化合物，反应式如下其中P代表胶原蛋白冷冻干燥，10℃以下保存；步骤3)油相调制将盐酸米诺环抗生素与三乙酸甘油酯以质量比1∶5～1∶10，在室温下混合，调制成油相；步骤4)O/W系统调制将上述步骤2)冷冻干燥物采用0.5mol/L的醋酸或盐酸进行酸溶解，成为水相，将调制油相分散到水相中，再用增稠剂丙三醇配制成相对质量比的O/W系统。
全文摘要
生物胶原对抗生药物的化学稳定性改善方法属药剂领域。盐酸米诺环抗生素在低pH较稳定，但结构含有“＝O”化学键易与“-NH<sub>2</sub>”基发生“西夫碱”反应，而胶原具有“-NH<sub>2</sub>”、“-COOH”基的两性蛋白质做其载体易发生如上反应。本发明首先将胶原通过低温酶法水解制成可溶性胶原；胶原在溶液中与酸酐进行胶原氨基化学修饰，将胶原的“-NH<sub>2</sub>”基蒙蔽，胶原结构由H<sub>2</sub>N-R-COOH生成R-OOH成为W相；另把盐酸米诺环与油混合，药物外层包有油层增加其与胶原化学反应难度成为O相；再用增稠剂加入到修饰胶原W相与油混盐酸米诺环O相制成O/W均一溶液，O/W乳液具有低pH值。本发明利用胶原氨基化学修饰，增强了生物胶原对盐酸米诺环抗生素的化学稳定性，有望应用在生物医用材料中。
文档编号A61K31/65GK101239188SQ200810057378
公开日2008年8月13日 申请日期2008年2月1日 优先权日2008年2月1日
发明者刘晶冰, 张文熊, 芳 武, 長南康正, 马明霞 申请人:北京工业大学