专利名称：：能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位筛选方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种能激发机体抗结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTb)的保护性免疫反应的抗原表位筛选方法及用途。
背景技术：
：结核病是一种慢性传染病，是由一种叫做结核杆菌(Mtb)的细菌侵入机体而发生的坏死性疾病，机体任何部位或器官都可能发生，其中以肺部最容易受到侵袭。目前结核杆菌仍然是严重危害人类健康的重要病原微生物，每年在全球范围内其会引起超过一千万人口的感染并导致约三百万人口的死亡。随着近年来结核杆菌耐药株的不断出现以及BCG作为目前唯一用于预防结核病的疫苗，存在免疫保护效果不稳定；接种后使结核菌素试验呈阳性，干扰结核病的诊断，延误治疗时机；免疫功能缺陷患者如艾滋病等接种后可能引起严重的播散性结核病。因此，发展更安全、高效、低成本、并可广泛用于各类人群的新型结核病疫苗已经成为结核病预防工作中的当务之急。结核杆菌是一种细胞内病原体，机体对其的控制依赖于对受感染细胞的识别和破坏。小鼠模型中的研究表明，MHCn类限制性CD4+T细胞，MHCI类限制性CD8+T细胞，IFN-Y等在体内具有积极的保护性作用。在大多数的感染者中，肺是结核杆菌进入机体的大门并且为这种缓慢生长的病原体提供了一个适宜其复制的环境。机体的适应性免疫系统在被感染5-6周后才能识别病原体，而在此之前，Mtb已经进入肺泡中的巨噬细胞，并可存活于未活化的巨噬细胞中。随后，CD4+T和CD8+T细胞被招募到肺中，诱导产生保护性免疫。CD4+T和CD8+T细胞在抵御结核杆菌的保护性免疫中都起到了关键的作用，在抵抗结核杆菌入侵的过程中，T淋巴细胞识别的抗原是外来抗原经抗原提呈细胞APC处理后与MHC分子结合并提呈到细胞表面的短肽，既淋巴细胞表位，人体中的MHC分子称作HLA。APC细胞如树突状细胞(DC)从感染的肺泡处迁移至淋巴结，在其表面存在高密度的肽/MHC复合物，从而有效激活结核杆菌特异性的CD4+T和CD8+T细胞。尽管人们对机体抵抗结核杆菌入侵的免疫应答尚缺乏深入完整的认识，但在动物模型中那些能够刺激T细胞免疫反应的免疫策略是最为有效的，包括CD4+T和CD8+T细胞。在以往的利用致病菌中的单个或多个抗原表位通过蛋白多肽或DNA疫苗的方式进行免疫从而获得免疫保护作用的亚单位疫苗研究中，发现了多种在结核杆菌感染初期被识别并具有免疫保护性作用的分泌型蛋白。已知亚单位疫苗中有明显作用及部分作用的分泌型蛋白有:早期分泌性抗原靶6(ESAT6)、抗原85复合体(Ag85)、MPT232、MPT264以及热休克蛋白HSP65、HSP70等，其中Ag85蛋白复合体是近年来研究的热点。Ag85复合体被证实在结核杆菌菌体细胞壁形成和分枝菌酸转移过程中发挥作用，能和人纤维结合蛋白(FN)相互结合，促进结核杆菌侵入宿主细胞。Ag85B是Ag85复合体中一种重要的分泌性蛋白，它能诱导实验动物强烈的Thl型细胞免疫应答，接种Ag85B蛋白的小鼠具有了与传统BCG疫苗诱导相当的抗结核杆菌感染能力。表位疫苗是近年发展起来的一种崭新的免疫接种技术，以保护性抗原上的特异性表位为基础进行疫苗分子设计，并以抗原表位为靶抗原，既能诱生特异性免疫应答，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制，使免疫应答具有更强的特异性和更好的免疫效果，且不存在生物危害性和遗传变异致疫苗效力丧失等问题，因此，表位疫苗已成为研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。借鉴表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以结核杆菌表位为基础设计的疫苗由于其小分子、稳定和结构简单等特性，有可能打破机体产生的免疫抑制，防止自身免疫反应的发生，归避病原体因自身快速基因突变所形成的免疫逃避作用，达到预防和治疗结核杆菌感染的目的。因此，研究具有强大免疫保护能力蛋白中能够激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位，可能对结核疫苗的研发、致病机理的研究以及结核早期诊断中起到推动作用。
发明内容本发明的目的是提出一种能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位筛选方法及用途，具体为来自结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTb)的具有疫苗开发前景的抗原表位的分子模拟肽及其编码DNA，本发明提供了结核杆菌研究中一个重要基因Ag85B中所包含的T淋巴细胞抗原表位，并提供了推断或筛选这些抗原表位的方法，有益于进一步开发出新型的多联多聚表位结核疫苗，更有效的预防和控制结核病的发生和发展。本发明为今后利用上述抗原表位进行合成肽疫苗、表位疫苗及核酸疫苗的开发奠定了基础，也为基于蛋白表位的病原生物诊断试剂盒的开发带来新的思路。本发明综合应用基因组序列、生物信息学和免疫学研究，提供了一种能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽，所述肽含有选自以下的氨基酸序列FVRSSNLKFQDAYNA(SEQIDNO:1)。本发明还提供了一种能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽的筛选方法，其特征在于，它包括以下步骤I、通过査阅文献，同源性以及蛋白理化特性分析，确定具有携带较强免疫原性T细胞表位潜力的基因序列，利用生物信息学软件Omiga2.0中的Parker算法进行免疫原性分析，得到高分值的抗原区域；登陆Propred(www.imtech.res.in/raghava/propred)分析可能被人51个HLA所提呈的肽段；将Parker算法所得到区域和Propred算法所得到的提呈肽断进行联合分析，预测得到基因所编码的可能被人体HLA分子提呈的具有免疫原性的T细胞表位多肽，以人工化学法合成上述预测得到的分子模拟肽；II、上述分子模拟肽经过细胞增值实验、和特异性抗体检验，确定能产生较强增值反应、并能诱导产生特异性抗体的分子模拟肽。本发明还提供了上述的能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在制备多联多聚表位结核疫苗上的用途，该多联多聚表位结核疫苗，它含有上述分子模拟肽SEQIDNO:l中一个或多个直接或间接地连接而成的肽段。本发明所述的分子模拟肽可以用常规方法人工合成，也可以用基因工程重组方法获得。上述的分子模拟肽在制备免疫原、免疫动物、或产生免疫保护上的应用。本发明还提供了能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在病原生物诊断中的应用。本发明大大有助于对结核杆菌表位的预测和确定，有助于结核病的预防和治疗，也有利于研究结核病中的分子、细胞作用机制，促进困扰临床的多耐药性难题的解决。图l蛋白T细胞抗原表位预测流程简要图。图2Ag85B基因DNA序列在Mycobacterium不同种属间的保守性分析。图3Janhi算法分析结核杆菌Ag85B的疏水性。图4Parker算法分析结核杆菌Ag85B的抗原区域。图5Ag85B中的多肽抗原表位FVRSSNLKFQDAYNA暴露在蛋白空间表面的a螺旋处。图6猴淋巴细胞在不同剂量抗原表位的分子模拟肽刺激下的增值指数SI。具体实施例方式下面结合附图和实例对本发明作进一步描述。实施例h1材料与方法1.1野生来源恒河猴中结核菌素阳性4例，均经尸检检验确定肺结核。l例结核阴性注射过卡介苗的健康猴作为阳性对照，1例结核阴性未注射过卡介苗的健康猴作为阴性对照。1.2试剂和试剂盒.-淋巴细胞分离液ACK，PRMI1640培养基和胎牛血清均购自大连宝生物公司；多肽由百泰克生物公司合成。HRP标记的羊抗猴IgG(H+L)抗体购自晶美公司。1.3主要仪器550型酶标仪购自伯乐公司；1.4抗原表位预测和分子模拟肽合成如图1，表位预测按照以下过程进行。根据检索文献我们选择了在结核杆菌疫苗研发中发挥重要作用的保护性抗原Ag85B作为候选基因进行T细胞表位分析。利用NCBI中的Gene数据库可以査询到结核杆菌标准株H37Rv中Ag85B基因的DNA序列及其氨基酸编码序列。登陆NCBI使用Blastn2.2.18在nr/nt数据库中对Ag85B基因的DNA序列进行比对分析，随后使用进化距离分析对各菌株(包括同属不同种以及同种不同株的)基因组中的Ag85B进行了同源性分析比较。应用序列分析软件包Omiga2.0分析Ag85B编码蛋白氨基酸序列的基本理化特性。通过上述工作确定Ag85B为一个具有携带免疫保护力优势抗原表位潜力的基因序列。应用序列分析软件包Omiga2.0中的Parker算法对Ag85B潜在的免疫区域进行预测分析。随后，登陆Propred(www.imtech.res.in/raghava/propred)比对分析可能被人51个HLA所的呈递的Ag85B肽段。最后，联合评估不同表位在不同算法中的打分情况确定优势表位，寻找具有较强免疫原性且能够被人HLA提呈的T细胞抗原表位。使用保守序列数据库(conserveddomaindatabaseCDDv2.13))寻找Ag85B编码氨基酸序列是否和已知保守序列相关，并査找其空间结构。下载后利用蛋白质三维结构浏览软件Cn3D4.1可将上述分析得到的抗原表位进行空间分析定位，选择位于蛋白外部的肽段，确定编码序列。由百泰克生物公司以人工化学法合成上述预测得到的多肽，合成的抗原均经纯化，并经质谱鉴定。冻干粉保存于-20摄氏度，用前以无菌PBS复苏多肽(200Pg/ml)。1.5猴淋巴细胞的分离抽取上述6只实验猴末梢血，使用15ml离心管分装3ml末梢血，向上述离心管中添加12ml红细胞裂解液(ACK)，37摄氏度水浴裂解红细胞；4摄氏度、500g离心5分钟；除去上清，再次添加7mlACK溶液，37摄氏度水浴5分钟；4摄氏度、500g离心5分钟；除去上清，添加2mlPBS，混匀细胞；取出10ul细胞悬浮液进行计数，用40ulTurk染液即5倍稀释细胞悬浮液，计数板计数用酒精擦计数板和盖玻片，然后用绸布轻轻擦拭。15ul细胞悬浮液稀释液滴入计数板内，置于显微镜下计数。细胞压中线时，只左不右，只上不下。细胞数/ml-(4大格细胞数之和/4)X104x稀释倍数(100)。根据细胞数目的多少，用完全培养液调整细胞浓度为2.5X106/ml。1.6细胞增值实验向96孔培养板每孔加入上述调整好细胞胞数目的淋巴细胞悬液200u1、不同浓度的合成多肽50y1，对照空加入50u1的PRMI1640培养液，每孔均设3个复孔，置37摄氏度、5%C02孵箱中培养72小时。于终止培养前4小时加入5mg/ml的MTT20y1，37摄氏度、5%C02孵箱中继续培养4小时后，1500r/min离心10min，小心吸去上清，每孔加入盐酸酸化的异丙醇100u1，将96孔板置于酶标仪中振板2min后，于570nm波长下测定吸光度(0D570)。刺激指数(SI)=各组加入多肽剌激的样品OD值/空白对照的OD值，以待测样本OD值/空白对照OD值>2为阳性标准。2.4猴抗体滴度的测定采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，测定肺结核猴中特异性抗体滴度。以抗原为包被底物包被96孔酶联板，抗原浓度为50ug/ml，4摄氏度过夜；以5%BSA-PBS37摄氏度封闭120min，洗涤3次，3min/次；加倍比稀释的被测动物血清，37摄氏度孵育90min。洗涤3次后，加入HRP酶标的抗猴二抗，37摄氏度30min;洗涤3次后，加入DAB底物，37摄氏度10rain，终止反应。酶标仪于490nm测定吸光度A值，以正常未注射过BCG小猴血清作阴性对照。结果以双复孔OD值表示。以待测标本0D值/阴性对照0D值〉2为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该样本中抗体滴度。2.5抗原表位的分子模拟肽在蛋白表位的病原生物诊断中的应用。2.5.1供检验猴血清的制备新鲜采集30只检验猴的lml外周血，置于37摄氏度孵育2小时，室温4000r/m离心10分钟，吸取上层血清。2.5.2血清中特异抗体的检测采用同上的间接ELISA法，以抗原为包被底物包被96孔酶联板，抗原浓度为50yg/ml，4摄氏度过夜；以5y。BSA-raS37摄氏度封闭120min,洗涤3次，3min/次；加入被测动物血清20n1，37摄氏度孵育90min。洗涤3次后，加入HRP酶标的抗猴二抗，37摄氏度30min;洗涤3次后，加入DAB底物，37摄氏度10min,终止反应。酶标仪于490nm测定吸光度A值，以确证的肺结核阳性猴的血清为阳性对照，以正常未注射过BCG小猴血清作阴性对照。结果以双复孔A值表示。以待测标本0D值/阴性对照0D值>2为阳性标准。2结果2.1表位预测及多肽合成结果2丄1基因序列同源性分析中，我们登陆NCBI使用Blastn2.2.18在nr/nt数据库对Ag85B基因的DNA序列进行比对分析，随后使用进化距离分析对各菌株(包括同属不同种以及同种不同株的)基因组中的Ag85B进行了同源性分析比对。结果发现结核杆菌标准株H37Rv中基因Ag85B与种内菌株H37Rv，H37Ra，Fll，CDC1551及同属菌株MycobacteriumbovisBCGPasteur1173P2完全一致(见图2)。这提示Ag85B在不同菌株间高度保守，因此本工作所分析得到的T细胞表位适合用于针对不同结核杆菌菌株的表位疫苗开发。2丄2应用序列分析软件包0raiga2.0对Ag85B编码氨基酸序列进行基本理化特性分析，Ag85B疏水性分析结果(见图3)。2丄3应用Parker算法进行免疫原性分析，结果得到7个高分值的Ag85B抗原区域(见图4)。2丄4Pr叩red算法则是将结核杆菌Ag85B的氨基酸序列和人的51个类型的等位HLA分子所能提呈的数据库进行比对分析而得到T细胞表位。将Parker算法所得到区域和Propred算法所得到的提呈肽断进行联合分析，结果得到表1中的14条结核杆菌Ag85B基因所编码的可能被机体HLA分子提呈T细胞表位多肽。2.1.5在14条来自结核杆菌Ag85B基因所编码蛋白中的多肽序列中，我们发现多肽FVRSSNLKFQDAYNA存在于高分的抗原区域中，，并且能够被51个HLA亚型中的42个亚型所提呈，其是14个抗原表位中的最优选抗原表位。我们利用NCBI保守序列搜索服务器(CD-Searchservicev2.13)在数据库CDDv2.13-24083PSSMs中检索得到Ag85B的蛋白质空间结构图谱。随后，利用软件Cn3D4.1分析发现序列FVRSSNLKFQDAYNA暴露于Ag85B空间结构表面(见图5)。这提示用该表位激活的免疫系统在随后遭遇结核杆菌入侵时能够及时发现并清除该菌。表1结核杆菌Ag85BT细胞抗原表位预测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>"9-165aaWLSANRAVK(9/51)*VKPTGSAA(5/51)*IGLSMAGSSAM(11/51)*202-243aaWERNDPTQQ(4/51)*LVANNTRLW(22/51)*247-265aaWVYCGNGTP(8/51)*270-298aaFVRSSNLKFQDAYNA(42/51)*VFNFPPNGT(8/51)*302-325aaWGAQLNAMK(4/51)*MKGDLQSSL(6/51)**同51个类型HLA所能提呈的表位库进行比对分析所得T细胞表位，括号中数字表示该肽断能被51个HLA类型中的多少个HLA提呈。2.1.5在14条来自结核杆菌Ag85B基因所编码蛋白中的多肽序列中，我们发现多肽FVRSSNLKFQDAYNA存在于高分的抗原区域中，并且能够被51个HLA亚型中的42个亚型所提呈，其是14个抗原表位中的最优选抗原表位。我们利用NCBI保守序列搜索服务器(CD-Searchservicev2.13)在数据库CDDv2.13-24083PSSMs中检索得到Ag85B的蛋白质空间结构图谱。随后，利用软件Cn3D4.1分析候选表位在蛋白三位结构中所处的位置。2.1.6经过上述方法的预测，选择以下的的优势抗原表位肽序列迸行人工合成。合成的多肽经质谱鉴定，经高压液相色谱(I1PLC)分析大于60%。FVRSSNLKFQDAYNA2.2淋巴细胞的分离，用细胞计数器计算出细胞数目如表l。表2淋巴细胞分离数目统计<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.3细胞增值实验以细胞增殖反应评价此表位肽诱导PBMC中抗原特异性T细胞应答水平。结果表明，4例肺结核阳性猴PBMC对不同剂量的分子模拟肽均产生不同程度的阳性增殖反应，以在20y1/ml浓度剌激下的SI最高(见表3及图6),这提示我们此剂量可以作为蛋白表位多肽刺激淋巴细胞增值的适宜刺激浓度。1例注射过BCG的阳性对照猴也能产生阳性增值反应，SI为2.0885±0.27而在肺结核阴性健康对照组未能产生阳性增殖反应(如表3所示)。表3各组猴在不同剂量抗原表为肽刺激下的SI:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.4猴抗体滴度的测定，肺结核猴中存在有针对多肽的特异性抗体，滴度达最高l:16，而阴性对照组未检测到抗体。证明此抗原表位的分子模拟肽具有良好的抗原性，可以与特异抗体结合。2.5供检验的30只猴血清及阴性对照血清0D值/阴性对照0D值〈2，而阳性对照OD值/阴性对照OD值〉2，证明此抗原表位的分子模拟肽可以应用于蛋白表位的病原生物诊断。3结论综合应用基因组序列、生物信息学和免疫学研究的技术方法，结果证实此预测方法得到的抗原表位分子模拟肽，可以激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应FVRSSNLKFQDAYNA(SEQIDNO:1)，模拟来源H37RVAg85B蛋白序列aa272-286。权利要求1.一种能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽，所述肽含有选自以下的氨基酸序列FVRSSNLKFQDAYNA(SEQIDNO1)。2、一种如权利要求1所述的能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤-I、通过査阅文献，同源性以及蛋白理化特性分析，确定具有携带较强免疫原性T细胞表位潜力的基因序列，利用生物信息学软件Omiga2.0中的Parker算法进行免疫原性分析，得到高分值的抗原区域；登陆Pr叩red(www.imtech.res.in/raghava/propred)分析可能被人51个HLA所提呈的肽段；将Parker算法所得到区域和Propred算法所得到的提呈肽断进行联合分析，预测得到基因所编码的可能被人体HLA分子提呈的具有免疫原性的T细胞表位多肽，以人工化学法合成上述预测得到的分子模拟肽；II、上述分子模拟肽经过细胞增值实验、和特异性抗体检验，确定能产生较强增值反应、并能诱导产生特异性抗体的分子模拟肽。3、如权利要求1所述的分子模拟肽，其特征在于所述肽用常规方法人工合成或用基因工程重组方法获得。4、一种如权利要求1所述的激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽在制备多联多聚表位结核疫苗上的用途。5、如权利要求1所述的分子模拟肽在制备免疫原、免疫动物、或产生免疫保护上的应用。6、如权利要求1所述的分子模拟肽在制备多联多聚表位结核疫苗上的用途，该多联多聚表位结核疫苗，它含有权利要求1所述的分子模拟肽SEQIDNO:l中一个或多个直接或间接地连接而成的肽段。7、如权利要求1所述的分子模拟肽在病原生物诊断中的应用。全文摘要一种能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位筛选方法及用途，具体为来自结核杆菌的具有疫苗开发前景的抗原表位的分子模拟肽及其编码DNA，本发明提供了结核杆菌研究中一个重要基因Ag85B中所包含的T淋巴细胞抗原表位，并提供了推断或筛选这些抗原表位的方法，有益于进一步开发出新型的多联多聚表位结核疫苗，更有效的预防和控制结核病的发生和发展；为今后利用上述抗原表位进行合成肽疫苗、表位疫苗及核酸疫苗的开发奠定了基础；提供了一种能激发机体抗结核杆菌的保护性免疫反应的抗原表位的分子模拟肽，所述肽含有选自以下的氨基酸序列FVRSSNLKFQDAYNA(SEQIDNO1)。文档编号A61P31/06GK101289496SQ20081005847公开日2008年10月22日申请日期2008年5月30日优先权日2008年5月30日发明者代解杰,匡德宣,唐东红,孙晓梅,罕园园,高家红申请人:中国医学科学院医学生物学研究所