专利名称：含毛囊人工皮肤的制备方法及由其制备的人工皮肤的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学，涉及人工皮肤的制备方法，尤其涉及含毛囊人工皮肤 的制备方法以及由该方法制备得到的人工皮肤。
技术背景最近国内外已成功地研制出含有真皮和表皮的人工皮肤，但这些人工皮肤 尚没有其他细胞成份，如无皮脂腺腺体细胞，皮脂腺分泌的产物称皮脂，有润滑皮肤的作用，在皮肤表面形成脂膜，形成皮肤屏障(skin barrier)的一部分。脂 膜中的游离脂肪酸对某些病原微生物的生长起抑制作用；毛囊周围真皮组织中 的成纤维细胞能产生天然抗生素，有抗菌防御能力。毛囊中的外毛根鞘相当于表 皮的棘层和基底层细胞，具有表皮修复能力，这些细胞还存在有多种细胞因子受 体，又能分泌重要的细胞因子，成为皮肤细胞信息交换的重要场所。因此，如果在人工皮肤中具有上述细胞成分，人工皮肤就会在功能上较为完 善。由于毛囊在皮肤中的重要作用，研制出一种具有一定生理功能的含毛囊的 人工皮肤对研究创面的正常化愈合具有重要的理论意义和应用前景。目前临床上适用于大面积创面覆盖的人工皮肤主要是以胶原等天然材料为 支架的人工皮肤，该类人工皮肤具有培养面积小、产量低、易收縮和移植成功 率低等缺点；或是以合成材料为支架的，虽易生产，但易于感染，移植成功率 低，没有表皮层，不利于细胞生长；人工皮肤的研究重点集中在基质的改善和抗 感染能力方面，对人工皮肤中的细胞成份研究较少，虽然近年来国内外已成功 地研制出含真皮和表皮的人工皮肤，并具有一定的抗感染能力。毛囊是细胞生物学和皮肤病学等学科的研究热点，它涉及毛囊真表皮间相互作用、信号传导、生长因子和细胞因子的作用、毛囊生长周期的调控、毛发 的色素、毛发的定型、毛囊干细胞的定位及其生物学功能等多个方面，现在已 初步阐明毛囊干细胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附着处。如何利用皮肤毛囊干 细胞在人工皮肤中发挥重要的生理功能己成为发展趋势。毛囊的功能毛囊是皮肤的主要辅助器官，它具有重要的生理功能:如皮肤 的屏障作用，抗菌作用，抑制疤痕形成作用；同时毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺单位干细胞的所在部位，在适当的环境因素刺激下毛囊干细胞可定向分化为表皮、毛 囊和皮脂腺组织，这些组织细胞及其细胞因子对创面的正常化愈合具有不可替 代的作用。我们的前期研究应用鼠触须毛囊细胞在胶原/壳聚糖多孔支架上成功地研制出含毛囊的人工皮肤(专利申请号为200510050538.4)，其公开了一种含毛囊人工皮肤的制备方法，通过以下步骤实现分离鼠触须毛囊，加入分离酶消 化，离心，得毛囊上皮细胞；取去除毛干的鼠触须毛囊用胶原酶D消化，离心， 用DMEM培养基进行真皮鞘细胞培养和进行毛乳头细胞培养；将传代培养的细胞 分别与毛囊上皮细胞按5-l: 1-5比例进行混合，移植到胶原/壳聚糖多孔支架 上，加入DMEM培养基培养即得。该发明方法解决了大面积烧创伤中皮肤来源困 难的难题。但由于所用细胞来源于动物，因其抗原性使其临床应用受限，如果 能用人的毛囊细胞研制出含毛囊的人工皮肤，将会大大縮短临床应用研究时间。 对研究创面的正常化愈合和大面积烧伤的创面覆盖具有重要的理论意义和应用 前景。 发明内容为了解决上述的人工皮肤所用细胞来源于动物，因其抗原性使其临床应用 受限的技术缺陷。本发明的一个目的是提供一种含人毛囊人工皮肤的制备方法，其使人工皮肤得抗原性大大减弱，解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难题。 本发明的另外一个目的是提供由上述的制备方法得到的含毛囊人工皮肤。 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案 含毛囊人工皮肤的制备方法，其包括以下步骤(1) 毛囊上皮细胞制备分离人头皮毛囊，加入分离酶，消化，再将毛囊 移入缓冲盐溶液中，飘洗去除分离酶，从毛囊中挤出毛干，用0.125-0.25%胰 蛋白酶加EDTA消化成单个毛囊上皮细胞，离心去除胰蛋白酶，用角质形成细胞 培养基培养备用；(2) 毛乳头细胞培养将去除毛干的人毛囊用0.1-0. 5%的胶原酶￥1消化， 待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消化时，中止消化， 液洗，低速离心去除胶原酶VI，吸沉淀过200-400目的筛网，倒冲筛网，用角 质形成细胞培养基培养，进行毛乳头细胞培养备用；(3) 含毛囊人工皮肤将传代培养的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞按5:1至 1:5比例的进行细胞混合，分别注射到皮肤支架上，移植细胞的浓度分别为2.5 X1(^至1X106/1111，然后将皮肤支架置入多孔培养板中，每孔加入角质形成细 胞培养基培养，浸没培养1 3周后再行气液界面培养，培养5 10周。作为优选，上述的角质形成细胞培养基选用无血清角质形成细胞培养基。 无血清角质形成细胞培养基降低免疫排异反应、减少通过血液传播疾病的机率、 使培养条件成为可控。作为优选，上述的步骤(1)中的无血清角质形成细胞培养基含表皮生长因 子EGF5 15ng/mL 、氢化考的松0.2 6 W g/mL、胰岛素2 8ug/mL。作为优选，上述的步骤(1)缓冲盐溶液选用D-Hanks或PBS。作为优选，上述的步骤(1)分离酶的浓度为0.2-0.8%。分离酶的选择，低浓度无法快速有效地分离，高浓度消化快但易损伤细胞，从而影响人工皮肤中 的细胞活性。作为优选，上述的步骤(2)中的角质形成细胞培养基含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 0.5 5ng/mL，添加bFGF可明显促进毛乳头细胞生长。作为优选，上述的步骤(3)中的角质形成细胞培养基含表皮生长因子EGF 5 15ng/mL 、氢化考的松0.2 0.6 y g/mL、胰岛素2 8 u g/mL和bFGF 0.5 5ng/mL，加了上述成份的培养基可促进毛囊上皮和真皮成份的生长。 作为优选，上述的步骤(3)中传代培养的毛乳头细胞<6代。 作为优选，上述的步骤(3)中皮肤支架选用胶原/壳聚糖多孔支架或鼠尾胶原。本发明另外还公开了含毛囊人工皮肤，其通过上述的任意一种技术方案所 述的制备方法制备得到。本发明由于采用了上述的技术方案，具有以下特点(1)首次在皮肤支架 上用人毛囊细胞制备含毛囊人工皮肤，比用动物细胞制备的人工皮肤的抗原性 大大减弱；(2)该人工皮肤含有毛囊，使其具有一定的皮肤生理功能；(3)具 有不易收縮、可吸收特点；(4)可作为临床上大面积烧创伤患者的创面覆盖的 材料，促进创面的正常化愈合；(5)解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难 题；(6)制备方法设计合理、操作方便，容易规模化生产。
图1是人毛囊细胞移植到人工支架上培养6周后做H.E.染色，从共聚焦显 微镜观察可见成团细胞，从中有毛干长出。图2是人毛囊细胞移植到人工支架上培养6周后形成毛囊样结构和散在的 细胞，放大200倍。图3是人毛囊细胞移植到人工支架上培养6周后形成毛囊样结构和散在的细胞，放大400倍。图4是人毛囊细胞移植到人工支架1周再移植到裸鼠背部皮肤6周后形成 完整的毛囊结构和散在的细胞，放大100倍。图5是人毛囊细胞移植到人工支架1周再移植到裸鼠背部皮肤6周后形成 完整的毛囊结构和散在的细胞，放大200倍。
具体实施方式
实施例l(1) 毛囊上皮细胞制备分离人头皮毛囊，加入一定浓度0.5%的分离酶 (dispase， Sigma公司)，4°C，消化12 18小时，将毛囊移入D-Hanks缓冲盐溶液中，飘洗去除分离酶，从毛囊中挤出毛干，用0. 15%胰蛋白酶加0.02% EDTA(Sigma公司)消化成单个毛囊上皮细胞，离心去除胰蛋白酶，用无血清角质 形成细胞培养基，含表皮生长因子(EGF， Sigma-aldrich公司)10ng/mL 、氢 化考的松0.4lig/mL、胰岛素5lig/mL，培养备用。(2) 毛乳头细胞培养将去除毛干的人毛囊用0.1-0.59&的胶原酶VI， 37 °C，消化2-6h，待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消 化时，中止消化，D-Hanks液洗，300rpm低速离心5分钟，离心去除胶原酶VI 三次，吸沉淀过200-400目的筛网，倒冲筛网，用角质形成细胞培养基(添加 碱性成纤维细胞生长因子bFGF3ng/mL， bFGF可明显促进毛乳头细胞生长)培 养，37°C， 5%〔02中进行毛乳头细胞培养。(3) 含毛囊人工皮肤将传代培养的毛乳头细胞(<6代)与毛囊上皮细胞 分按1:1比例的进行细胞混合，分别注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞 的浓度分别为2.5X104/ml。每一含毛囊细胞的胶原/売聚糖多孔支架或胶原置入24孔培养板中，每孔加入角质形成细胞培养基，含表皮生长因子(EGF) 10ng/mL 、氢化考的松0.4"g/mL、胰岛素5 u g/mL和碱性成纤维细胞生长因 子bFGF3ng/mL, Sigma-aldrich公司)lmL培养，每2天换液1次。浸没培养 2周后再行气液界面培养。培养6周后做H.E.染色，见毛囊样结构形成如图1 所示。人毛囊细胞移植到人工支架上培养6周后形成毛囊样结构和散在的细胞， 如图2、图3所示。人毛囊细胞移植到人工支架1周再移植到裸鼠背部皮肤6周 后形成完整的毛囊结构和散在的细胞，如图4、图5所示。 实施例2将传代培养的毛乳头细胞(<6代)与毛囊上皮细胞分按1:2比例的进行细 胞混合，分别注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度分别为5X104/ ml。其他技术方案如实施例l，培养6周后做11卫.染色，见毛囊样结构形成。 实施例3将传代培养的毛乳头细胞(<6代)与毛囊上皮细胞分按2:1比例的进行细 胞混合，分别注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，移植细胞的浓度分别为1X105/ ml。其他技术方案如实施例l，培养6周后做RE.染色，见毛囊样结构形成。 实施例4制备方法参照实施例1，将传代培养的真皮鞘细胞(<6代)与毛囊上皮细 胞在各种比例进行细胞混合，注射到胶原/壳聚糖多孔支架上，任一种细胞浓度。 培养8周后均未见毛囊样结构形成，部分可见角囊肿形成。
权利要求
1.含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)毛囊上皮细胞制备分离人头皮毛囊，加入分离酶，消化，再将毛囊移入缓冲盐溶液中，飘洗去除分离酶，从毛囊中挤出毛干，用0.125-0.25％胰蛋白酶加EDTA消化成单个毛囊上皮细胞，离心去除胰蛋白酶，用角质形成细胞培养基培养备用；(2)毛乳头细胞培养将去除毛干的人毛囊用0.1-0.5％的胶原酶VI消化，待包绕毛囊的真皮鞘消化成单细胞而其内的毛乳头尚未开始消化时，中止消化，液洗，低速离心去除胶原酶VI，吸沉淀过200-400目的筛网，倒冲筛网，用角质形成细胞培养基培养，进行毛乳头细胞培养备用；(3)含毛囊人工皮肤将传代培养的毛乳头细胞与毛囊上皮细胞按5∶1至1∶5比例的进行细胞混合，分别注射到皮肤支架上，移植细胞的浓度分别为2.5×104至1×106/ml，然后将皮肤支架置入多孔培养板中，每孔加入角质形成细胞培养基培养，浸没培养1～3周后再行气液界面培养，培养5～10周。
2. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于角质形成 细胞培养基选用无血清角质形成细胞培养基。
3. 根据权利要求2所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(l) 中的无血清角质形成细胞培养基含表皮生长因子EGF 5 15ng/mL 、氢化考 的松0. 2 6 w g/mL、胰岛素2 8iig/mL。
4. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(l) 缓冲盐溶液选用D-Hanks或PBS。
5. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(l) 分离酶的浓度为0. 2-0. 8%。
6. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(2)中的角质形成细胞培养基含碱性成纤维细胞生长因子bFGF 0. 5 5ng/mL。
7. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(3) 中的角质形成细胞培养基含表皮生长因子EGF 5 15ng/mL 、氢化考的松 0. 2 0. 6 u g/mL、胰岛素2 8 u g/mL和碱性成纤维细胞生长因子bFGFO. 5 5ng/mLc
8. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(3) 中传代培养的毛乳头细胞<6代。
9. 根据权利要求1所述的含毛囊人工皮肤的制备方法，其特征在于步骤(3) 中皮肤支架选用胶原/壳聚糖多孔支架或鼠尾胶原。
10. 含毛囊人工皮肤，其特征在于通过权利要求1 9任意一项权利要求所述的制备方法制备得到。
全文摘要
本发明属生物医学，涉及人工皮肤的制备方法，尤其涉及含毛囊人工皮肤的制备方法以及由该方法制备得到的人工皮肤。含毛囊人工皮肤的制备方法，其包括以下步骤(1)毛囊上皮细胞制备；(2)毛乳头细胞培养；(3)含毛囊人工皮肤培养。本发明具有以下特点(1)首次在皮肤支架上用人毛囊细胞制备含毛囊人工皮肤，比用动物细胞制备的人工皮肤的抗原性大大减弱；(2)该人工皮肤含有毛囊，使其具有一定的皮肤生理功能；(3)具有不易收缩、可吸收特点；(4)可作为临床上大面积烧创伤患者的创面覆盖的材料，促进创面的正常化愈合；(5)解决了大面积烧创伤中皮肤来源困难的难题；(6)制备方法设计合理、操作方便，容易规模化生产。
文档编号A61L27/60GK101264344SQ20081006026
公开日2008年9月17日 申请日期2008年4月3日 优先权日2008年4月3日
发明者吕中法, 吴贤杰, 蔡绥勍, 敏 郑, 列 马, 高长有 申请人:浙江大学医学院附属第二医院;浙江大学