专利名称：一种具有趋化作用的人类rantes蛋白的异源表达和纯化方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种具有趋化性的人类RANTES蛋 白的异源表达和纯化方法。
背景技术：
多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及 艾滋病HIV等疾病是多种危害人类健康的重要疾病，这些疾病给人类带来了极大 的痛苦，每年大量的人由于这些疾病夺去健康和生命，特別是HIV，至今尚无有 效的治疗方法。多年来，研究人员花了大量人力物力致力于研究治疗这些疾病 的方法。
趋化因子(chemokine， CK)是一组具有趋化作用的细胞因子，能趋化免疫细 胞到免疫应答反应局部，参与免疫调节和免疫病理反应。他们多为小于100个氨 基酸的小分子蛋白质。根据其分子一级结构中N-端前两个半胱氨酸残基(Cys) 间是否隔有其他氨基酸，可以将趋化因子分为4个亚族(共50余种)即 Cys-X-Cys (CXC) , Cys-Cys (CC), Cys (C) ， Cys-X3-Cys (CX3X)亚家族。他们不仅参 与炎症反应，也参与免疫，造血，血管生成，器官发育等生理，病理过程。其 中趋化因子RANTES (regulated upon activation nomal T cell expressed and secreced, RANTES)是CC类趋化因子亚族成员，又名CCL5，其分子量为8KD，近 年来才发现的一种趋化因子，它通过结合细胞表面的趋化因子受体诱发致炎性 免疫应答。诱导白细胞向炎症部位浸润，介导炎症反应的发生，对单核细胞、 巨噬细胞、记忆性T细胞、树突状细胞、嗜酸粒细胞、嗜石咸粒细胞均有强烈的 趋化作用，并能调节效应细胞的功能，参与很多炎症反应。在很多疾病的病理 生理过程中起着重要作用，如多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、 心脑血管疾病、肺瘤以及HIV等，为临床治疗这些疾病展示了诱人前景。RANTES是第一个被发现的对人类某些T细胞具有活性的趋化因子，他的这一 特征可能对于损伤和感染部位招引记忆性T细胞的聚集有重要作用。然而，自首 次发现十年后，RANTES才受到广泛重视，因为它能通过与CCR5受体竟争结合而 抑制巨嗟纟田胞的R5 HIV-1抹进入细胞。随着对HIV-l的深入研究，有关RANTES结 构和功能的阐述也随之清晰。现有的研究结果表明，RANTES以单体，双聚体或 多聚体的形式，通过与相应的受体结合，可以发挥诱导白细胞活化，调节炎症， 调节免疫的作用，继而在多种感染性疾病，过萄文性疾病以及免疫性疾病中起着 重要的作用。
目前蛋白的体外表达主要有大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物细胞和酵母四大 外源基因表达体系。关于RANTES蛋白的表达主要限于大肠杆菌表达体系，此体 系对于蛋白表达的翻译后加工机制不完善，产生的蛋白活性低，不利于后期的研 究工作。
巴斯德毕赤酵母(戶/c力"f or A)表达系统是发展迅速应用广泛的商业化 重组真核宿主表达系统，是上世纪80年代被开发出的一种新型的外源蛋白表达 系统，该系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。主要具备以下优点1) 属于真核表达系统，可对蛋白进行多种翻译后修饰；2)表达系统所需要的成本 低，只需要简单的盐培养基即可；3)高表达。他能利用很强的启动子，具有较 快的细胞生长速度，所以表达量也相对较高；4)高稳定。该系统的载体能和真 核基因组进行整合，构建的菌林相对稳定， 一般不会出现外源基因随生长繁殖 而丟失的现象；5)高分泌。它可以利用多种信号引导外源基因分泌，其分泌量 可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是罕见的；6)适用于高密度连续发酵； 7)该系统自身分泌的背景蛋白非常少，诱导的培养基皆由小分子物质组成，成 分简单，纯化工艺简单易行。
因此本发明利用巴斯德毕赤酵母作为表达体系来表达人RANTES融合蛋白。
发明内容
本发明的目的，是提供一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和 纯化方法。采用本发明方法可以得到纯度较高、产量较大的人RANTES蛋白，可用于制备治疗多发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾 病、肺瘤以及HIV药物的用途。
该方法主要包括以下步骤
(1).人类RANTES基因的克隆
(2 ).人类RANTES融合蛋白表达载体的构建
(3 ).人类MNTES融合蛋白的诱导表达和分离纯化
(4 ).人RANTES蛋白的分离纯化
所述步骤(l)中，根据已报道人类RANTES基因序列(NCBI登录号NM 002985 ) 设计引物，以人体血液提取RNA为模板，经过RT-PCR方法扩增人类RANTES基因 片l殳，并连接到pMD18-T载体上形成重组质粒pMD18-T/rantes。
所述步骤(2)中，i殳计一对引物，在上游引物的5，端顺次加入I酶切 位点，6个组氨酸的DNA序列和1个肠激酶识别位点，在下游引物的5，端加入 AW I酶切位点，然后以重组质粒pMD18-T/rantes为模板，PCR扩增出人类RANTES 融合蛋白基因片段，将该融合蛋白基因与毕赤酵母栽体pPIC9K质粒重组构建表 达质粒pPIC9K/rantes。
在融合蛋白N端引入6xHis-tag用于蛋白亲和层析，并在組氨酸纯化标签 和融合蛋白之间加入肠激酶(E!O酶切位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),以便于去除 亲和层析纯化后融合蛋白的6 x His-tag。
表达本发明融合蛋白的真核表达的宿主是毕赤酵母。
所述步骤(3)中，电转化毕赤酵母GS115宿主菌，经G418筛选得到高表达的 阳性克隆，鉴定为甲醇利用快型(Mut+)。在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定和 分泌性表达。培养液上清经超滤离心、亲和层析纯化到单一的人类RANTES融合 蛋白。
所述步骤(4)中，采用亲和层析去除6 x His-tag,纯化到人类RANTES蛋白。 本发明的优点
利用巴斯德毕赤酵母作为表达体系来表达人类RANTES融合蛋白，极大方便 了 RANTES融合蛋白的纯化，使纯化工艺变得简单易行，有助于提高表达量。便于进行高密度培养和放大发酵规模。并且，曱醇营养型酵母真核表达体 系能使表达的外源蛋白通过一定途径分泌到胞外，这样可以减轻大量表达产物
对宿主细胞的代谢负荷；同时，在分泌过程中，还能对外源蛋白进行多种翻译 后修饰，使分泌蛋白更接近于天然蛋白构象和活性，更适于临床治疗使用。
本发明所述重组融合蛋白以可溶性形式存在，保证重组融合蛋白能形成 正确的空间构j象。
通过本发明制备方法得到高表达量的人类RANTES蛋白，可用于制备治疗多 发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及 HIV的药物。
图1为人类MNTES基因的RT-PCR扩增电泳图2为人类RANTES融合蛋白表达载体的构建图3为人类RANTES融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图4为人类RANTES融合蛋白的Western blot鉴定结果。
具体实施方式
材料
1 DNA Ligation Kit (Takara公司产品，中国大连)
2. pMD18-T载体克隆试剂盒(Takara公司产品，中国大连)
3. I、 Abd、 5WI等限制性内切酶(Takara公司产品，中国大连)
4. 质粒载体pPIC9K ( Invitrogen公司产品，美国)
5. 质粒小量制备试剂盒(百泰克生物技术有限公司产品，中国北京)
6. DNA凝胶回收试剂盒(上海博亚公司产品，中国上海)
7. HiTrap prepacked columns ( Pharmacia公司产品，美国)
8. 大肠杆菌JM109 (Takara 乂>司产品，中国大连)
9. 酵母菌GS115 ( Invitrogen/^司产品，美国)
10. BCA蛋白定量试剂盒(北京天泰生物公司产品，中国北京)
11. G418、氨节青霉素(Roche公司产品，德国)
12. 酵母提取物、胰蛋白胨、右旋糖、无氨基酸酵母氮源(Oxford公司产品，
美国)
13. LB培养基
酵母提取物 5g
胰蛋白胨 10g
NaCl 10g
溶于1000ml去离子水中，并用lmol/L的NaOH调节pH值至7. 0,高 压蒸汽灭菌。
14. YPD培养基
酵母提取物 2g
胰蛋白胨 4g 溶于180ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml经滤器除菌后的20% 的右旋糖和0. 2ml浓度为100mg/ml的氨节青霉素。
15. 磷酸盐緩冲液
NaCl 8g KC1 0.2g
Na2,4 1.44g
KH2P04 0,24g
溶于水1000ml，并用HC1调节pH值至7.4,高压灭菌。
16. BMGY培养基
酵母提取物 2g
胰蛋白胨 4g 溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml滤器除菌后浓度为13. 4°/。 的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml lraol/L磷酸盐緩沖液、20ml 10%甘油、0.4ml 0. 02%生物素和0. 2ml 100mg/ml的氨千青霉素。
17. B丽培养基
酵母提取物 2g无氨基酸酵母氮源 生物素 葡萄糖
无氨基酸酵母氮源
胰蛋白胨 4g 溶于140ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入2Oml滤器除菌后浓度为13. 4% 的无氨基酸酵母氮源贮存液、20ml lmol/L磷酸盐緩冲液、20ml 5%曱醇、0. 4ml 0. 02°/。生物素和0. 2ml 100mg/ml的氨千青霉素。
18. MDS培养基160ml lmo1/ L山梨糖醇加入3. Og琼脂，高压灭菌，冷却 至60 。C后，依次加入20ml 13. 4。/。的无氨基酸酵母氮源，20ml 20%葡萄糖，0. 4ml 0. 02%生物素。
19. MD培养基 1. 34% 4 x 101 2%
20. 應培养基 13. 4%
4 x 10-5 % 生物素 0.5% 曱醇 实施例1: 人类RANTES基因的克隆
根据已报道人类RANTES基因序列(NCBI登录号丽002985 )设计二条引 物Fl ( SEQ ID NO: 3 )和Rl ( SEQ ID NO: 4 )，从人体血液提取RNA，采用RT-PCR 扩增人类RANTES基因片段。引物序列如下
上游引物Fl: 5，——ATGAAGGTCTCCGCGGCAGCCC——3， 下游引物Rl: 5，——CTAGCTCATCTCCAAAGAGTTGATG——3， 反转录体系为20ul，其中含10 x RT反应緩冲液2ul, 25mMMgCl24ul, 10mM dNTP 2ul, 200U/ul RNase Inhibitor 0. 5ul, AMV Reverse Transcriptase lul, 下游引物R1(20 |aM) lul,总RNA(2 ug/Ml)2ul。
反应条件为42。C温育 60 rain, 8(TC加热5 min， 水上冷却5 min。 然后以上述>^转录产物cDNA为才莫板， 进行PCR扩增。PCR的反应体系为50u 1,其中含引物F1和R1各20pmo1, 200 Hmol的dNTP, 2jal cDNA, 10 x 7^ 反应缓冲液5 p 1, 7s《聚合酶lU。 PCR的反应条件为第一阶段95。C预变性5分钟；第二阶段94°C变性30秒，52。C退火 30秒，72。C延伸30秒，循环35次；第三阶段7^C延伸10分钟。所得PCR产物 (SEQ ID NO: 5 )经1. 5°/ 琼脂糖电泳检测可见约300bp大小电泳带(图1 )，将 PCR产物回收、纯化后与pMD18-T载体进行连接。连接产物通过电转化法转化 JM109大肠杆菌感受态细胞，经氨节青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆于LB 液体培养基中37。C振荡过夜，次日提取质粒DNA，用PCR鉴定，对于有约300bp 大小DNA片段出现的重组质粒进行测序，测序结果表明阳性重组质粒多克隆位点 中插入的DNA片段即是完整的RANTES基因，该重组质粒命名为pMD18-T/rantes。
实施例2:人类RANTES融合蛋白表达载体的构建
为了便于人RANTES蛋白的分离纯化，在目的蛋白N端融合一个6 x His纯化 标签，并在His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点构建人RANTES 融合蛋白。为此，设计一对引物F2和R2，引物序列如下
F2: 5， ——GCGAATTC CATCATCATCATCATCAT GATGACGATGACAAG ATGAAGGTC—— 3，
R2: 5，——GC GCGGCCGC CTA GCT CAT CTC CAA AGA GT——3，
在上游引物F2的5'端顺次加入AcoR I酶切位点、，6个组氨酸的DNA序列 和1个肠激酶识别位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) ( SEQ ID NO: 6 ),在下游引物 R2的5，端加入淑I酶切位点(SEQ ID NO: 7 ),然后以重组质粒pMD18-T/rantes 为模板，PCR扩增出人类RANTES融合蛋白基因片段(SEQ ID NO: 2 ),该融合蛋 白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示。以ScoR I和I分别酶切上述PCR产 物和毕赤酵母载体pPlC9K质粒DNA，然后利用DNA连接试剂盒将人类RANTES融 合蛋白基因片段连接到pPIC9K载体上，构建成重组表达质粒pPIC9K/rantes, 构建过程参见图2。
实施例3:人类RANTES融合蛋白工程酵母的构建
pPIC9K是一种整合性载体，可以通过同源重组把外源基因整合到毕赤酵母 细胞染色体中，并且能够发生多位点整合获得多拷贝，一4殳来说，外源蛋白的 表达量和拷贝数正相关。由于pPIC9K含有可抗G418的Kanamycin(Kan)基因，转化时Kan基因与外源基因将一起整合到染色体上，使转化子具有G418抗性， 其抗性水平与Kan基因的数目呈正相关。因此我们通过转化子的G418抗性筛选 来获得高表达量的重组转化子。筛选出的转化子还需鉴定表型，即确定是Mut+ 还是Mu t s 。可以4巴丰争4匕子同时点在MD和MM两i夹平^反上。在MD和MM平^反上生 长差别不大的转化子为Mut+;相反，在MD上生长快，顧上生长很慢的转化子 为Muts,对于分泌表达的外源蛋白，可以优先选用Mut+转化子以缩短后续的发 酵时间。
本实施例中采用限制性内切酶5WI线性化人类R緒TES融合蛋白表达载体 pPIC9K/rantes，利用电穿孔法转化毕赤酵母GS115。由于毕赤酵母GS115菌抹 具有HIS4营养缺陷标记，可用于阳性转化子的筛选，首先用不含His的MDS平 板初篩，选取该培养基上生长良好的菌落150个，接种到添加2mg/L G418的YPD 平板上进行复筛，并同时接种到对应的MD和羅平板上完成表型Mut+筌定。菌 落PCR鉴定RANTES融合基因DNA片段的存在，结果选出在MD和薩平板上都能 正常生长，并能在G418抗性平;^反上生长的抗G418、 Mut+转化子，并加甘油于-80 'C冻存。
实施例4:人RANTES融合蛋白的诱导表达与纯化
取-8(TC保存的含有pPIC9K/rantest的酵母工程菌种接种于YPD平板活化， 挑取外观优良的单个菌落接种于5ml BMGY培养基，3(TC恒温摇床300rpm振荡 培养16 18小时，室温下1500g离心5rain,去上清，收集菌体，用B觀Y培养 基重悬菌体，使0D600 =1. 0左右，将重悬菌液置于250ml三角瓶中，用双层 灭菌纱布封口， 300rpm, 30。 C震荡培养，每24h向培养基中添加无菌曱醇至终 浓度为l. 0%, 96h后停止培养，离心菌液收集上清液。对摇瓶培养的菌液离心 得到的上清液进行超滤离心，去除培养基成分，同时更换为亲和层析进样援冲 液。用AKTA层析4义和HiTrapChelating HP Columns (Pharmacia)对蛋白质 进行亲和层析纯化，经二次重复上样，通过柱洗脱将带His-tag的蛋白经亲和 层析纯化出来。对纯化产物进行SDS-PAGE电泳(如图3),样品1为未诱导的表 达对照，样品2为亲和层析纯化前的超滤产物，样品3为亲和层析纯化后的产物。纯化结果表明，经纯化后3号产物的杂蛋白较少，有一条单一明亮的目的
蛋白条带，纯化效果好。根据常用的BCA法，取纯化后的蛋白溶液，测定溶液
中总蛋白的浓度为0. 943 mg/ml。
实施例5:人RANTES融合蛋白的Western Blot鉴定
融合蛋白的N端有6 x His-tag，因此可以用Anti-His Antibody对目的蛋 白进行Western Blot鉴定。分离純化的人RANTES融合蛋白经过SDS-PAGE电泳 后，通过电转移将PAGE胶上的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜用高浓度蛋白 质进行封闭，然后用His抗体进行结合反应，用洗液漂洗PVDF膜，加显色试剂 进行显色。蛋白质印迹结果如图4所示，样品2为亲和层析纯化后产物，样品3 为亲和层析纯化前的超滤产物，样品1为未诱导表达对照。结果表明，目的蛋 白在曱醇诱导前无表达，曱醇诱导能使重组菌林表达外源蛋白，经超滤离心和 亲和层析纯化后，在菌液上清中分离出单一的目的蛋白。 实施例6:人RANTES蛋白的分离纯化
利用蛋白酶EK切割人JUNTES融合蛋白，然后采用亲和层析去除6 xHis-tag， 操作同实施例4所述，纯化得到人类RANTES蛋白。
结论
本发明通过RT-PCR扩增、载体构建、蛋白的曱醇诱导表达以及纯化鉴定等 分子生物学技术和蛋白纯化技术，采用毕赤酵母表达系统来实现人RANTES蛋白 的分泌表达，得到了纯度较高、产量较大的人RANTES蛋白，该蛋白可用于制备 治疗多发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿 瘤以及HIV的药物。序列表
〈110〉重庆大学
〈120〉 一种具有趋化作用的人类RANTES的异源表达和纯化方法
〈130〉
〈160〉 2
<170〉 Patent In version 3.2
〈210〉 1 〈211〉 102 〈212〉氨基酸
〈213〉人RANTES融合蛋白的氮基酸序列
〈400〉 his his 1
ala ala pro ala phe ala tyr phe val thr trp val
1
his his ala leu S6r ala tyr ile tyr thr arg lys srg glu
his his 5
ala val
20 ser pro
35 ala arg
50
ser gly
65 asn m:g
80
tyr ile 95
asp asp asp asp 10
ile leu ile ala 25
tyr ser ser asp 40
pro leu pro arg 55
lys cys ser asn 70
gin val cys ala 85
asn ser leu glu 100
lys met lys val thr ala leu cys thr thr pro cys ala his ile lys pro ala val vsl asn pro glu lys met ser
15
sla
30 cys
45 glu
60 phe
75 lys
90
<210> 2 <211> 325 〈212〉 腿
〈213〉人KANTES融合蛋白的DNA序列 <400〉 2
gcgaattccatxatcatcatacgatgacaagatg朋ggtctccgcggcag60
ccctcgctgtcatcctcattgctactgccctctgcgctcctgcatctgcctccccatatt120
cctcggacaccacaccctgctgctttgcctacattgcccgcccactgccccgtgcccaca180
tc犯ggagtatttctacaccagtggcaagtgctccaacccagcagtcgtctttgtcaccc240
g犯ag肌ccgccaagtgtgtgccaacccagagaagaaatgggttcgggag tacatc犯ct300
ctttggagatgagctaggcggccgc325
<210> 3<211〉 22 <212〉 DNA
<213>人类RANTES基因引物Fl的序列 <400〉 3
atgaaggtct ccgcggcagc cc 22
<210> 4 <211> 25 <212> DNA
<213>人类RANTES基因引物Rl的序列 <400〉 4
ctogctcatc tccaaagagt tgatg 25
<2，0> 5 <211> 276 <212〉 腿
<213>以Fl和Rl为引物，PCR扩增人类RANTES基因产物的序列 <400> 5
ccgcggc战ccctcgctgtcatcctcattg ctactgccct ctgcgctcct60
gcatctgcctCCCC3t3t1Xct.r,ggancacaccctgct gctttgccta cattgcccgc120
ccactgccccgtgcccacatcaaggagtatttctacacca gtggcaagtg ctccaaccca180
gcsgtcgtctttgtcacccg旭ag肌ccgccaagtgtgtg ccaacccaga gaagaaatgg240
gttcgggsgtacatcaactctttgg哪Lgagctag276
<210> 6 <2U> 50 <212〉 薩
<213>在人KANTES蛋白N端融合6XHis标签，His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶酶切位点构建人 RANTES融合蛋白的引物F2的序列
<400> 6
gcg33ttcca tcatcatcat cstC3tgatg acgatgaca3 gstg3aggtc 50
〈210〉 7 〈211〉 30 <212〉 DNA
<213〉在人RANTES蛋白N端融合6XH，' s标签，His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶酶切位点构建人 RANTES融合蛋白的引物R2的序列
<400〉 7
gcgcggccgc ctagctca.tr, tccaaagagt 30
权利要求
1.一种具有趋化作用的人RANTES蛋白的异源表达和纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1).人RANTES基因的克隆根据人类RANTES基因序列设计引物，以人体血液提取RNA为模板，RT-PCR方法扩增人类RANTES基因片段，并连接到pMD18-T载体上形成重组质粒pMD18-T/rantes；(2).人RANTES融合蛋白表达载体的构建在人RANTES蛋白N端融合6×His纯化标签，并在His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点，以重组质粒pMD18-T/rantes为模板，PCR扩增出人类RANTES融合蛋白基因，将该融合蛋白基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒pPIC9K/rantes，构建策略见图2；(3).人类RANTES融合蛋白的诱导表达和分离纯化电转化表达系统的宿主，经G418筛选得到高表达的阳性克隆，在摇瓶中融合蛋白高效、分泌性表达；然后采用超滤和亲和层析纯化人类RANTES融合蛋白；(4).人RANTES蛋白的分离纯化利用肠激酶酶切人类RANTES融合蛋白，然后经亲和层析去除6×His-tag，纯化到人类RANTES蛋白。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，表达系统的 宿主为毕赤酵母GS115。
全文摘要
本发明涉及一种具有趋化作用的人类RANTES蛋白的异源表达和纯化方法。采用具有高表达、高稳定、高分泌和低成本的毕赤酵母表达体系，通过RT-PCR克隆人RANTES基因、人RANTES融合蛋白表达载体构建、人RANTES融合蛋白的甲醇诱导表达以及纯化鉴定等分子生物学技术和蛋白表达与纯化技术，实现人RANTES蛋白的分泌表达。为了便于人RANTES蛋白的分离纯化，在目的蛋白N端融合一个6×His纯化标签，并在His-tag和RANTES蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点构建RANTES融合蛋白，然后通过亲和层析和EK酶切得到纯度较高、产量较大的人RANTES蛋白，该蛋白可用于制备治疗多发性硬化关节炎、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及HIV药物的用途。
文档编号A61P19/02GK101407812SQ20081006995
公开日2009年4月15日 申请日期2008年7月9日 优先权日2008年7月9日
发明者刘志昭, 胡宗利, 邓晓洁, 陈国平, 峰 顾 申请人:重庆大学