专利名称：一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术医药领域，本发明更具体涉及了一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物。
技术背景对于贫血的治疗方法的选用需要根据贫血的病因来确定，对于急性失血性贫血可以采用最常见的输血 来补血，但是，对于慢性贫血以及骨髓造血功能障碍所引起的贫血就不是简单的输血就能够解决的。骨髓移植是目前采用的补血方法之一， 一般用在再生障碍性贫血病人或者白血病病人的补血治疗上， 但是因为用于骨髓移植的造血干细胞需要配型，且来源及其有限，因此也限制了该种治疗方法的应用，干 细胞的来源是个至关重要的问题，因此，期望着能够自身克隆干细胞的方法的出现。除了输血、骨髓移植等补血方法治疗贫血外，用于补血的就是药物补血。在我国有各种各样的补血药 物，而最常见最著名的补血药物就是阿胶，阿胶不但有补血、止血还有造血的功能，其卓越的功效己经被 千百年来的临床应用所证实。在国际上的补血类药物有红细胞生成素(EP0)、白介素(IL-ll)以及粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)。 EPO主要是应用在促进红系祖细胞向成熟的红细胞分化，IL-11是用来提升血小板的数量，GM-CSF主要是 促进祖细胞增殖的功效。该类药物在临床上用于治疗骨髓造血机能的贫血，其生产方式大都是基因工程的 方法生产，蛋白质的氨基酸组成大都超过100个氨基酸，分子量较大。多肽是以氨基酸为单位的一类涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质,且常经过糖基化、磷酸化 或酰化衍生,具有安全、副作用小，用量小，功能多样、特异性强等特点，在细胞生理及代谢功能的调节 上具有重要的作用。 发明内容本发明目的是针对上述问题，提供一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物，该类药物具有治疗多种骨 髓造血干祖细胞缺陷性疾病、先天性贫血和再生障碍性贫血，以及各种失血性贫血疾病，也应用于白血病 病人的骨髓移植的治疗等，该类药物是一种可解决造血干细胞缺陷所引发的全血细胞减少症的药物，是可 以有效解决造血干细胞缺陷导致的疾病的有效药物。本发明的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物，其特征在于组成短肽的氨基酸主序列〈1〉和编码 短肽的核苷酸主序列〈2〉如下<1〉 J-Asn-A印-B-Gly-0-Lys其中，J代表氨基酸Phe或lie; B代表氨基酸Ala或Leu; 0代表氨基酸Leu或Glu; <2> GCA或GCG AAT GCA GTT GGC CTT AAA 所述短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列，其间隔的位置选择排列相对应的氨基酸。本发明的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽片段，其氨基酸主序列具有与该短肽氨基酸主 序列》70%的相同性，》90%的相似性，片段为把所述的7个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个 或5个或6个氨基酸组成的与所述短肽具有同样生物活性的短肽。本发明的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽类似物具有与所述短肽相同的生物活性，所述 类似物是指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质 而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。本发明的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽衍生物，其氨基酸序列具有与短肽氨基酸主序 列》70%的相同性，》90%的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基 酸的某个基团用另外的基团取代后与所述短肽具有同样生物活性的短肽。本发明的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽变体，其氨基酸序列具有与短肽氨基酸主序列 》70%的相同性，》90%的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或 编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或 替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。本发明的短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗人髓系各 类造血细胞所引起的贫血症、诊断与检测贫血的发生以及贫血发生程度药物的应用。本发明的短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试 剂的应用。本发明的显著优点是本发明的短肽来自于运用生物信息学的方法把国际蛋白质数据库的蛋白进行序 列比对，筛选出来的一种新型的具有活性功能的生物活性肽，运用本发明的短肽促进骨髓造血细胞增殖， 细胞结构正常，无副作用。本发明的肽类药物具有治疗多种骨髓造血干祖细胞缺陷性疾病、先天性贫血和 再生障碍性贫血，以及各种失血性贫血疾病，也应用于白血病病人的骨髓移植的治疗等，该类药物是一种 可解决造血干细胞缺陷所引发的全血细胞减少症的药物，是可以有效解决造血干细胞缺陷导致的疾病的有 效药物。
图1是本发明涉及的短肽促进再生障碍性贫血病人骨髓有核细胞增殖的试验结果。其中增殖率的i十算 是试验组和对照组的比值，图中，横坐标表示本发明涉及的肽的浓度，纵坐标表示该肽促进骨髓单个核细 胞的增殖率。
具体实施方式
短肽的制备方法采用化学合成的方法，即本领域熟知的已经非常成熟的固相肽合成方法，既可以采用 Boc方法也可以采用Fmoc方法。具体做法就是将被保护的氨基酸逐个偶联到惰性固相载体上去，然后利用 强酸将肽链从载体上裂解下来，同时去除侧链保护。短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列，其间隔的位置选择排列相对应的氨基酸，例如，在 J位置的氨基酸有2种Phe或Ile;，此2种氨基酸都可以单一地安放在〈1〉中J的位置上，不管选择其中 任何一种，该短肽仍具有其原有的生物活性，即一种促进骨髓造血细胞增殖，同样地B和O所代表的位置 的氨基酸也有如此特性。核苷酸采用人工合成方法制备；编码短肽的核苷酸包含下组中的一种(a) 编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；(b) 与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；(c) 与(a)或(b)中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；该核苷酸基本由编码具有〈1〉氨基酸序列短肽的核苷酸组成，本发明的核苷酸序列包括〈2〉中的核苷酸 序列，其形式为DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。 DNA可以是单链的也可以是双链的。编码短肽的编 码区序列可以和〈2〉中的核苷酸相同，也可以不同，称为变异体,.其中变异体是指具有编码〈1〉中的氨基酸 序列的编码，但可以和〈2〉中的核苷酸不同。变异体可以是一个或几个核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸 序列，但不会改变编码〈1〉中氨基酸序列的短肽的活性功能。该短肽或核苷酸的"变体"是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列。改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入、添加或替换。变体可具有"保守性"改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，也可以有"非保守性"改变，其中替换的氨基酸不具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质。"缺失"是指在氨基酸序列或核苷 酸序列中一个或几个氨基酸或核苷酸的缺失；"插入"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中间任意位置插入一个或几个氨基酸；"添加"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸；"替 换"是指用不同的氨基酸或核苷酸替换一个或几个氨基酸或核苷酸。该短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗包括但不限于下 述疾病的药物的用途促进骨髓造血细胞增殖的造血类短肽药物。例如治疗多种骨髓造血干祖细胞缺陷性疾病、先天性贫 血和再生障碍性贫血，以及各种失血性贫血和血小板减少症疾病，也应用于白血病病人的骨髓移植的治疗 等，也就是本发明涉及的肽类药物是一种可解决造血干细胞缺陷所引发的全血细胞减少症的药物。在计算短肽片段、短肽衍生物和短肽变体的氨基酸主序列具有与短肽氨基酸主序列的相同性和相似性 时，"相同性百分率"是指两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同的百分率。根据Cluster法 (Higging D.G. & Sharp P.M. ，Gene 1988， 73:234-237 )通过检査所有配对之间的距离将各组序列排列 成簇，然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算_序列A与序列B之间匹配的残基个数X 100%_序列A的残基个数-序列A中间隔的残基个数-序列B中间隔的残基个数 "相似性"是指在确定两条氨基酸序列比对中相同氨基酸序列位置确定后，在相同氨基酸之间排列的 对应的氨基酸的保守性取代程度。根据生物信息技术领域周知的氨基酸得分PAM 250 scoring matrix (Dayhoff' M. Schwartz, R. M. and Orcutt， B. C. Atlas of Protein Structure 1978， 345-352; DeLisi， C. and Kanehisa, M. Mathematical Biosciences 1984.69: 77-85; Schwartz, R. M. and Dayhoff, M. O. Atlas of Protein Structure, 1979.353-358)，当相对应的不同氨基酸比较得分》0时，该两个氨基酸相似；当不同氨基酸得分 <0时，两个氨基酸不相似。两个氮基酸序列如序列C和序列D之间的相似性百分率通过下式计算(序列C与序列D之间匹配的残基个数+序列C与序列D之间相似的残基个数)X 100%序列C的残基个数_序列C中间隔的残基个数-序列D中间隔的残基个数 其中，序列C中间隔的残基个数和序列D中间隔的残基个数都不包括相似氨基酸的个数。下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列所有列举实施例所涉及的所有合成短肽都具有本发明涉及的药物功能而不限于所列举功能。 实施例1促进再生障碍性贫血病人骨髓有核细胞增殖(Ile-Asn-Asp-Leu-Gly-Leu-Lys)人再生障碍性贫血病人骨髓细胞，经过淋巴细胞分离液分离出来单个核细胞，种植入96孔细胞板， 细胞的培养是用含有10%胎牛血清的D肥M培养基来培养，以105/孔的细胞密度种植，同时把本发明涉及 的短肽按照不同的浓度加入到细胞培养板中，以等体积的PBS为对照组，实验结果表明该骨髓有核细胞在 短肽药物的作用下，3天的促增殖率达到175%。 实施例2促进骨髓有核细胞增殖后的形态学检验(合成本发明涉及的短肽片段，在序列中截取4个或者5个氨基酸: Asn-Asp-Leu-Gly-或Asp-Leu-Gly-Leu-Lys)骨髓有核细胞的培养是用含有10%胎牛血清的DMEM培养基来培养，以IOV孔的细胞密度种植入24孔 细胞板后，立刻把本发明涉及的短肽按照不同的浓度加入到细胞培养板中，以等体积的PBS为对照组，24 小时后，把细胞离心后去上清，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定细胞颗粒1天(4'C)以后，1%锇酸 -1.5%亚铁氰化钾后固定1.5h， PBS漂洗；70%酒精饱和醋酸铀染液块染，酒精-丙酮梯度脱水，环氧树 脂618包埋剂包埋。超薄切片80訓，醋酸铀、柠檬酸铅各染色5min;在日立Hu-12A型或飞利浦EM 208 型透射电镜下观察,细胞的形态和对照组没有区别，形态正常，属于正常造血。序列表<110>福州大学<120>—种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物<160><210>3<211>7<212> PRT<213>人工序列<220><223> J代表氨基酸Phe或lie; B代表氨基酸Ala或Leu; O代表氨基酸Leu或Glu <400> 1J-Asn-Asp-B-Gly-O-Lys<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400> 2gca aatgcagttggcctt aaa<210> 3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400> 3gcg aatgcagttggcctt aaa
权利要求
1.一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽，其特征在于组成短肽的氨基酸主序列<1>和编码短肽的核苷酸主序列<2>如下<1>J-Asn-Asp-B-Gly-O-Lys其中，J代表氨基酸Phe或Ile；B代表氨基酸Ala或Leu；O代表氨基酸Leu或Glu；<2>GCA或GCG AAT GCA GTT GGC CTT AAA所述短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列，其间隔的位置选择排列相对应的氨基酸。
2. —种如权利要求1所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽片段，其特征在于短肽片段的氨 基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述片段为把所述的7个 氨基酸的序列从任意位置截取成4个或5个或6个氨基酸组成的与所述短肽具有同样生物活性的短肽。
3. —种如权利要求l所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽类似物，其特征在于所述短l太类 似物具有与所述短肽相同的生物活性，所述类似物是指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述 短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
4. 一种如权利要求1所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽衍生物，其特征在于所述短肽衍 生物的氨基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述衍生物是 指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述短 肽具有同样生物活性的短肽。
5. —种如权利要求1所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽变体，其特征在于所述短肽'变体 的氨基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述变体是指一种具 有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列 或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基 酸或核苷酸。
6. 根据权利要求1、 2、 3、 4或5所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物，其特征在于所述编码短 肽的核苷酸包含下组中的一种(a) 编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；(b) 与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；(C) 与(3)或0))中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；所述核苷酸采用人工合成方法制备。
7. 根据权利要求6所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽，其特征在于所述的短肽采用化学 合成方法制备；所述核苷酸采用人工合成方法制备。
8. —种如权利要求1、 2、 3、 4或5所述的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽的应用，其特征在于所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗人髓系各类造血细胞所引起的贫血症、诊断与检测贫血的发生以及贫血发生程度药物的应用。
9. 一种如权利要求6所述的促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽的应用，其特征在于所述核苷酸用于制备具有治疗人髓系各类造血细胞所引起的贫血症、诊断与检测贫血症的发生以及贫血发生的程度药物的应用。
10. —种如权利要求6所述的一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物的短肽的应用，其特征在于所述短 肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试剂的应用。
全文摘要
本发明提供一种促进骨髓造血细胞增殖的肽类药物。该短肽的短肽片段、类似物、衍生物、变体的氨基酸主序列具有与该短肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗多种骨髓造血干祖细胞缺陷性疾病、先天性贫血和再生障碍性贫血，以及各种失血性贫血疾病，也应用于白血病病人的骨髓移植的治疗等，也就是本发明涉及的肽类药物是一种可解决造血干细胞缺陷所引发的全血细胞减少症的药物。
文档编号A61K38/08GK101270151SQ20081007103
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月13日 优先权日2008年5月13日
发明者昊 李, 饶平凡 申请人:福州大学