专利名称：：大肠杆菌及其基因工程菌在制备抗肝癌实体瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及大肠杆菌及其基因工程菌的用途，具体是大肠杆菌及其基因工程菌在制备抗肝癌实体瘤药物中的应用。
背景技术：
：肿瘤的发生率高，其中，主要以实体瘤为主。肝癌作为高发性恶性肿瘤，因其恶性程度高、预后差，被称为"癌中之王"[']，居恶性肿瘤病死率的第二位[2]。目前，临床肝癌等实体瘤的治疗效果不理想，其主要原因是源头创新药物和治疗手段少，治疗针对性差，还存在着复发转移率高等问题。因此，研究开发针对肝癌等实体瘤治疗的新技术、新方法具有十分重要的意义。目前，细菌作为肿瘤靶向性载体和细胞因子用于肿瘤治疗已有报道，研究较多的细菌有梭状芽孢杆菌属、双歧杆菌属、沙门菌属等厌氧菌属。其抗肿瘤的机制有(1)细菌所含的脂多糖(LPS)能刺激白细胞增殖分化，诱发TNF-a等细胞因子的释放，从而大大加强机体的免疫应答能力。(2)细菌大量聚集于肿瘤部位，引起局部炎症反应，浓集大量特异性与非特异性免疫效应细胞。(3)细菌毒性产物破坏肿瘤微环境。(4)细菌分泌的蛋白水解酶等破坏了肿瘤细胞[7]。(5)感染诱导了与肿瘤抗原有关的交叉免疫以及机体的抗肿瘤免疫反应。(6)大肠杆菌在有氧和无氧环境中均可生存，能在肿瘤组织中优先复制增殖，与肿瘤组织竞争微环境中的营养素和生长因子。但是，厌氧芽孢杆菌具有在肿瘤坏死部位聚集的特性[8]，但肿瘤太小则无法吸引细菌聚集[9]。研究表明，厌氧芽孢杆菌联合化学治疗比单用细菌或化疗有更好的抗肿瘤效果[1()]，但由于厌氧芽孢杆菌的毒性，实验动物的存活率很低[11]。1967年开始实施的人类临床实验，因病人注射厌氧芽孢杆菌后l周内出现发烧和菌血症而不得不使用抗生素治疗，且大多数病人的肿瘤没有消退的迹象，从而导致临床效果的缺乏而失败。与厌氧芽孢杆菌相似，双歧杆菌能聚集在直径1.5cm或更大的肿瘤内，在直径小于1.5cm的肿瘤中却很难聚集，且双歧杆菌没有抗肿瘤的作用['2]。有研究者将pBLES100载体转化双歧杆菌，发现转化菌也具有亲肿瘤性，而正常组织均没有细菌生长。携带血管内皮抑制素基因的双歧杆菌也能聚集在肿瘤内，亦有抑制肿瘤生长[13]、延长荷瘤小鼠寿命[14]的作用。目前最大的问题是双歧杆菌作为载体，其质粒相对较少，且提取困难，其24个分型中仅有5型发现有质粒存在，在发现的质粒中，大小都在8kb以上，也不适合于作载体的构建[15'16]，成为其应用于基因治疗的瓶颈。与上述2种细菌相比，沙门氏菌具有许多优点沙门氏菌是兼性厌氧细菌，不仅可以在肿瘤坏死区域生长，还可以在活的肿瘤组织中生长；它很容易携带外源性基因；其亲肿瘤性不依赖于肿瘤的大小[17]，并通过多种机制[18]抑制多种肿瘤的生长。然而，沙门氏菌的毒性较3大。沙门氏菌释放的脂多糖会诱导机体TNF-a、IL-1、IFN-Y等细胞因子的表达，诱导败血症休克的发生[19'2()]。可见其临床应用前景不容乐观。细胞因子(cytokine)具有杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞的特性，因而成为肿瘤治疗的另一热点。细胞因子作为恶性肿瘤生长的直接调节剂，己在肿瘤的体外实验[28]、动物实验[29—31]治疗取得了显著效果而被引入临床治疗[31—35]。其作用机制包括(1)直接干扰细胞生长，杀伤肿瘤细胞；(2)通过激活机体免疫系统(如NK细胞、肿瘤特异性细胞毒性T细胞等)杀伤肿瘤细胞；(3)通过抑制肿瘤细胞的转移，控制肿瘤的发展；(4)破坏肿瘤组织血液供应；(5)增加放疗及化疗敏感性、降低其毒性、逆转或抑制肿瘤细胞多药耐药等，维持机体正常功能。目前被认为有应用前景或己经在临床试用的抗癌细胞因子主要有肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素-a(IFN-a)、白细胞介素-2(IL-2)等。TNF-a主要由激活的巨噬细胞和合体滋养细胞产生，主要通过诱导肿瘤细胞凋亡、破坏肿瘤组织血管、介导免疫调节作用、放化疗的增敏作用等，产生抗肿瘤作用，是迄今为止所发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子之一[36]。IFN-a由白系白细胞产生，在临床上对各类肿瘤都有显著作用。主要通过抑制肿瘤细胞增殖和分化(阻止细胞由G0—Gl)，促进部分恶性细胞表型的逆转发挥抗肿瘤作用。IL-2是由激活的T淋巴细胞所产生的一种免疫调节剂。目前，使用高剂量的IL-2治疗肿瘤，已经在多种动物模型上取得成功，并且能使患者体内一些转移性黑色素瘤、肾细胞肉瘤、非霍奇金淋巴瘤均明显消退[37]，有效地恢复机体的免疫功能，减少放疗、化疗的副作用。IL-2抗肿瘤效果明确，主要通过增强机体对肿瘤的免疫反应性实现(1)刺激T细胞进人细胞分裂周期，增强T细胞的杀伤活性和分泌IFN-Y,TNF,CSF等细胞因子，诱导并增强细胞毒性T细胞(Tc)活性，从而产生明显的抗肿瘤效果。(2)促进NK细胞的生长增殖，从而发挥其杀伤肿瘤细胞作用[381。此外，IL-2还能促进NK细胞分泌IFN-Y、IL-2、TNF[39]，增加其表达IL-2R等。(3)促进LAK、TIL细胞的体外存活、扩增及活化淋巴因子激活的杀伤细胞。LAK只识别肿瘤抗原，因而具有杀伤肿瘤细胞的效应，而对宿主正常细胞没有影响。(4)促进B细胞的增殖和表达，增强单核细胞、巨噬细胞的吞噬能力。(5)诱导NO合成。应用细胞因子治疗肿瘤具有疗效缓慢而持久、无简单的剂量-反应关系、延长患者寿命、副作用小而短暂、细胞因子的联合治疗优于单一治疗、局部应用优于全身应用等特点[4()'41]。然而，市售的细胞因子带有杂质，反复多次给肿瘤患者或动物模型注射大剂量细胞因子常引起诸多毒副作用，成为其临床应用的最大障碍。若采取有效的方法将细胞因子应用于肿瘤局部，必将能避免或大大减少其不良反应的发生，加快其临床应用进程。研究表明，细菌作为DNA或基因表达载体，能与表达产物产生协同抗肿瘤效应[42]，细胞因子的联合应用优于单用[41]。为突破细菌抗肿瘤应用的瓶颈，克服细胞因子抗肿瘤治疗的诸多毒副作用，充分发挥细菌本身和细胞因子的双重抗肿瘤作用及两者的协同抗肿瘤效应。另外，肿瘤组织内部特殊的病理生理特点和厌氧菌本身的生物学特性为利用厌氧菌进行肿瘤治疗研究提供了有力的科学依据(1)厌氧菌对肿瘤组织的靶向性较好；(2)厌氧菌在瘤内较难被免疫系统识别清除[3];(3)厌氧菌在瘤内比正常组织具备更好的繁殖条件和能力[4];(4)一些厌氧菌本身就具有溶瘤作用[5'6];(5)厌氧菌具备较好地表达外源基因的能力；(6)厌氧菌比病毒等载体的安全性较高；(7)厌氧菌所致的继发感染可通过使用抗生素得到较好的控制；(8)作为基因转移载体，厌氧菌的细胞组织转移范围比病毒载体更为广泛。厌氧菌作为肿瘤靶向性载体用于治疗肿瘤已曰益受到青睐。
发明内容本发明的目的在于提供大肠杆菌及其基因工程菌的新用途，即在制备抗肝癌实体瘤药中的应用。大肠杆菌或其基因菌工程的用途，它是将大肠杆菌或其基因工程菌或是大肠杆菌和其基因工程菌混合制成针剂，定向接种在肝癌实体瘤的瘤组织内，以治疗肝癌。其注射剂量每个实体瘤为0.05ml0.lml。本发明将大肠杆菌或其基因工程菌用于制备抗肝癌实体瘤药的方法是采用RT-PCR分别扩增人或动物的IL-2、IFN-a、TNF-a等细胞因子或免疫因子的cDNA，克隆到pMD18-T载体中，经限制性酶切分析、测序证实扩增基因序列的IH确性。再将上述基因片段分别克隆到表达载体pGEX-4T-l中，并转化到非致病性大肠杆菌中，分别建立人或动物IL-2、IFN-a、TNF-a等细胞因子或免疫因子的基因大肠杆菌，并将上述大肠杆菌及其基因工程菌制成1.0xl03~1.0xlO'Q/ml的悬液，将不同数量的上述细菌或基因工程菌分别或按一定比例混合后，制成针剂抗肝癌实体瘤的药物，定向接种肝癌实体瘤的瘤组织内。经在SD大鼠动物肝癌模型上试验应用，结果表明注射l-3w后，解剖可见癌肿消失或减少，说明大肠杆菌及其基因工程菌制剂是一种理想的抗肝癌实体瘤药物。所述的大肠杆菌与基因工程菌的混合，其混合比例为大肠杆菌基因工程菌=1:1本发明的优点在于应用大肠杆菌及其基因工程菌制备抗肝癌实体瘤药物以治疗肝癌实体瘤，有利于充分发挥细菌和细胞因子的双重抗肿瘤作用及其协同抗肿瘤效应。上述细菌及其基因工程菌的局部应用，有利于减少或避免细菌与细胞因子全身应用的不良反应。该方法具有简单而易行等特点，是一种较理想的抗肝癌等实体瘤治疗的药物，可在临床上应用。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步说明本发明。1.1、大肠杆菌或基因工程菌抗实体瘤药物的制备进行大肠杆菌培养，采用RT-PCR分别扩增人或动物的IL-2、IFN-a、TNF-a等细胞因子或免疫因子的cDNA，再将上述基因片段分别克隆到表达载体中，并转化到大肠杆菌中，分别建立人或动物IL-2、IFN-a、TNF-a等细胞因子或免疫因子的基因工程菌。将上述细菌、工程菌制成1.0xl0Ll.0xl(^/ml的悬液。将不同数量的上述细菌或基因工程菌分别和/或按一定比例混合后，定向接种于肝癌等实体瘤模型动物的瘤组织内，每只动物实体瘤内注射0.05ml~0.1'ml;1.2、动物肝癌模型建立和分组试验将Walker256细胞接种于SD大鼠皮下，待实体瘤形成后，无菌操作将Walker256实体瘤取出，切成约1.5mmxl.5mm大小的瘤块备用。取受试SD大鼠40只(80100g，雌雄各半)，用戊巴比妥钠麻醉后，消毒大鼠胸腹部，无菌打开腹腔，暴露肝左叶，用手术大片做一切口，将上述瘤块植入肝内，止血，关闭腹腔；同时，将大鼠分为生理盐水组、大肠杆菌(權4)高、中、低剂量组(分别接种细菌数为I.OXIO8、1.0XI()6和1.0X103个)。于SD大鼠肝癌模型制作后的第6天，麻醉模型大鼠，行无菌操作，打丌腹腔，将大肠杆菌药物定向接种于肝癌组织内，关闭腹腔；1.3、结果细菌接种后的第12天，处死动物，取出瘤组织，称重。结果表明，大肠杆菌具有剂量依赖性的抗肝癌作用(见表l):表l大肠;汗菌44104对SD大鼠Walker256肝癌的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>P<0.05"P〈0.01，与生理盐水组比。权利要求1、大肠杆菌及其基因工程菌在制备抗肝癌实体瘤药物中的应用。2、根据权利要求l所述的应用，是将大肠杆菌或其基因工程菌或其混合物制成针剂。全文摘要本发明公开了大肠杆菌及其基因工程菌的新用途，即在制备抗肝癌实体瘤药物中的应用，它是将大肠杆菌或其基因工程菌或大肠杆菌及其基因工程菌的混合物制成针剂，定向接种在肝癌实体瘤的瘤组织内，以治疗肝癌实体瘤。本发明的优点是有利于充分发挥细菌和细胞因子的双重抗肿瘤作用及其协同抗肿瘤效应。同时，有利于减少或避免细菌与细胞因子全身应用的不良反应，且该方法简单、易行，是一种较理想的抗肝癌实体瘤的药物。文档编号A61K35/66GK101444538SQ20081007389公开日2009年6月3日申请日期2008年11月8日优先权日2008年11月8日发明者周巧林,庆徐,徐亚娟,戴支凯,李利亚,梁荣感申请人:桂林医学院