专利名称：多糖体共轭物及其合成方法
技术领域：
本发明是关于一种多糖体共轭物及其合成方法，具体是关于一种利用
单体氨基酸(monomeric amino acid)结合的金属与多糖体共轭物。该多糖体共 轭物可被用于诱导癌症细胞死亡与癌症治疗。
背景技术：
血管新生的过程与肿瘤的血管密度和渗透性相关。随着对这些过程与 细胞周期调控(cell cycle regulation)以及细胞信号物质(cell signaling agent)越 来越多的了解，各种肿瘤的治疗已进入一个新的时代。虽然在血管新生领 域已有了显著的进展，但是在产生血管新生的癌症、肿瘤以及其它疾病的 药物治疗上仍然存在一些重大的局限。目前这些重大局限中的其中之一是 关于体内细胞毒性药物(cytotoxicdrug)的传输取代细胞抑制药物的传输。
铂(箔)共轭物对抗肿瘤活性的效果已被证实。例如，顺铂(cisplatin) ——一种被广泛使用的抗癌药物，已被单独或是结合其它药剂来用于治疗 乳癌与卵巢癌。顺铂亦被称为顺式二氯二氨铂(cis-diamminedichloroplatinum (n)，CDDP)，其为一铂共轭结合氨(NH3)分子的简单分子。顺铂会将细胞抑 制在S期(S-phase)，而导致增殖细胞的有丝分裂被抑制。顺铂也会降低化疗 过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表现， 因而抑制了血管新生。顺铂对于大多数固态肿瘤的治疗都有效。然而，由 于其严重的毒性肾损害(n印hrotoxidty)、骨髓抑制性(mydosuppression)、抗 药性(drug resistance)、 胃肠道毒性(gastrointestinal toxicity)、 神经毒性 (neurotoxicity)与其它副作用(例如呕吐、颗粒性白血球减少(granulocyt叩enia) 及体重下降)，因此顺铂的临床应用仍然受到限制。此外，顺铂是被配制于体积庞大且水溶性很低的载体内，而降低了其疗效。铂共轭物的化学改质 已被用来增加其亲水性，降低副作用并改进其疗效。然而，这些共轭物仍 然存在一些重大的缺点。
发明内容
在一实施方案中，本发明提供了一种多糖体共轭物。该共轭物具有多 糖体与至少一单体氨基酸，其中该单体氨基酸具有氧基，且该单体氨基酸 共价键结到该多糖体。前述共轭物具有至少一金属，该金属是与该氨基酸 的氧基共轭结合。
所述多糖体可选自胶原蛋白(collagen)、软骨素(chondroitin)、胎盘素 (hyauraniate)、几丁聚糖(chitosan)及几丁质(chitin)中的一种或多种。
所述单体氨基酸可选自天门冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)、丙氨酸(alanine)、天门冬酰胺(asparagines)、谷酰胺(glutamine)及甘氨 酸(glycine)中的一种或多种。
所述金属可选自钼(platinum)、铁(iron)、轧(gadolinium)、铼(rhenium)、 锰(manganese)、钴(cobalt)、铟(indium)、镓(gallium)及铑(rhodium)中的一 种或多种。
根据本发明的一具体实施方案，本发明的共轭物包含重量百分比介于 10%到50%的单体氨基酸。
根据本发明的一具体实施方案，本发明的共轭物包含重量百分比介于 10%到50%的所述金属。
本发明的多糖体共轭物，其进一步还包含包含所述金属的药物。根
据本发明的一具体实施方案，该共轭物可包含重量百分比介于10%到50% 的包含所述金属的药物。
根据本发明的一具体实施方案，本发明的共轭物包含重量百分比介于 15%到30。/。的铂(II)或铂(IV)金属及重量百分比为70%的天门冬氨酸单体氨
5基酸，且该多糖体共轭物具有介于26,000到30,000道尔顿间的分子量。
依据另一实施方案，本发明提供了一种合成多糖体共轭物的方法，其 是共价键结具有氧基的单体氨基酸到多糖体，并且共轭结合金属到该氧基 以形成多糖体共轭物。
本发明提供的合成多糖体共轭物的方法，其包含
将具有氧基的单体氨基酸共价键结到多糖体；及
共轭结合金属到该氧基以形成多糖体共轭物。
本发明提供的合成多糖体共轭物的方法，其进一步包含干燥前述多糖 体共轭物以形成粉末。
依据第三实施方案，本发明是关于一种杀死癌症细胞的方法，其是经 由给予该细胞有效量的多糖体共轭物。该共轭物具有多糖体与至少一单体 氨基酸，其中该单体氨基酸具有氧基，且该单体氨基酸共价键结到该多糖 体。该共轭物还具有至少一金属，该金属是与该氨基酸的氧基共轭结合。
以下将藉由附图及实施例详细说明本发明的技术特征，但须了解的是， 以下的描述对此领域具有通常知识的人员而言为一广泛的揭示，且其内容 不在于限制本发明。
图1A 图1C显示三种依据本发明的实施方案的金属-多糖体共轭物。 图中，"AA"表示氨基酸，"M"表示金属。在图1A中，只有一个或是少 数个氨基酸基团与共轭结合的金属存在。在图1B中，有中间数量的氨基酸 基团与共轭结合的金属存在。在图1C中，有最多的或是几乎最多可能的氨 基酸基团与共轭结合的金属存在。
图2显示依据本发明的一实施方案合成铂类似物(II)与(IV)-多糖体共轭 物的方法(方法A)。图3显示依据本发明的另一实施方案合成铂类似物(II)与(IV)-多糖体共 轭物的方法(方法B)。
图4显示依据本发明的一实施方案的铂-多糖体共轭物对于抑制抗铂卵 巢癌细胞(2008)在48小时(图片A)与72小时(图片B)的功效。
图5显示依据本发明的一实施方案的铂-多糖体共轭物对于抑制抗铂卵 巢癌细胞(2008-cl3)在48小时(图片A)与72小时(图片B)的功效。
图6A与图6B显示依据本发明的一实施方案的流式细胞技术的结果， 其显示顺铂(CDDP)(图6A)与铂-多糖体共轭物(PC)(图6B)对于抗铂卵巢癌 细胞株2008-cl3在48小时时的凋亡作用。图6A与图6B中，横坐标表示 数量(count)， 纵坐标表示荧光强度(fluoresence intensity)。
图7A与图7B显示依据本发明的一实施方案的利用流式细胞技术所测 得的凋亡细胞的百分比，其是用不同浓度的铂-多糖体共轭物(PC)或顺铂 (CDDP)处理抗铂卵巢癌细胞株(2008-c13)48小时(图7A)或72小时(图7B)。
图8显示依据本发明的一实施方案的利用TUNEL检定法测得的凋亡细 胞的百分比，其是用不同浓度的铂-多糖体共轭物(PC)或顺铂(CDDP)处理抗 铂卵巢癌细胞株(2008-c13)48小时。
图9A与图9B显示依据本发明的一实施方案的铂-多糖体共轭物在活体 内在24小时(图9A)与94小时(图9B)(单一药量，Pt 10mg/kg)对抗乳房肿瘤 生长的功效。标示DY的肿瘤是取自于一仅施用软骨素的动物;标示DP-A-P 的是取自于一施用铂-多糖体共轭物的动物。在图9A中，左边的肿瘤测得 体积为5.2591cm3[(2.08cmX2.58cmX 1.96cm)/2];右边的肿瘤测得体积为 5.2661cm3[(2.20cmX2.37cmX2.02cm)/2]。在图9B中，左边的肿瘤测得体 积为14.3622cm3[(2.99cmX3.29cmX2.92cm)/2];右边的肿瘤测得体积为 0.8782cm3[(l. 1 lcm X 1,84cm X 0.86cm)/2]。
图10A 图10D显示依据本发明的一实施方案的肿瘤H&E染色实验， 其显示在给予铂-多糖体共轭物或单独的软骨素24与94小时后出现坏疽。图10A显示一给予软骨素24小时的乳房肿瘤(13762)。图10B显示一给予 铂-多糖体24小时的乳房肿瘤(13762)。图10C显示一给予软骨素94小时的 乳房肿瘤(13762)。图10D显示一给予铂-多糖体94小时的乳房肿瘤(13762)。
图11显示PARP蛋白质的西方墨点(Westem blot)实验，其是来自于用 铂-多糖体共轭物(PC)或顺铂(CDDP)处理的2008-C13细胞。
图12显示2008-cl3细胞的细胞周期的流式细胞分析，其是用铂-多糖 体共轭物(PC)或顺铂(CDDP)处理48小时。图中每一栏目中的条柱从左向右 分别表示对照、2.5"g/mL、 5ug/mL、 10ug/mL、 20ug/mL。
图13A与图13B显示在2008-C13细胞中的p21转录物的北方墨点 (Northern blot)实验(图13A)与被表现的p21的西方墨点实验(图13B)，其是 用低药量的铂-多糖体共轭物(PC)或顺铂(CDDP)处理。
图14A显示在暴露于顺铂(CDDP)或共轭物(PC或DDAP)48小时后 sub-Gl部分随药量增加而增加的流式细胞分析趋势。在同样的药量下，比 起CDDP对于抗铂2008-cl3细胞，PC实质上诱导了更多的sub-Gl细胞。 图14B显示了暴露于CDDP或PC(DDAP)48小时后，2008-cl3细胞中sub-Gl 的部分的百分比。
图15A与图15B显示暴露于顺铂(CDDP)与二氨二羧酸铂(PC或 DDAP)48小时后所诱发的凋亡的TUNEL检定法。在图15A中，凋亡的型 态是用棕色颗粒所标示。在图15B中，显示具有凋亡型态的细胞的百分比， 其中栏表示为三组独立的实验；柱为SE。
图16显示在2008-C13细胞中的裂解后的Caspase-3蛋白酶与PARP的 特定裂解的西方墨点分析，其是用顺铂(CDDP)与二氨二羧酸铂(PC或DDAP) 处理。GAPDH :甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)。
图17A显示经顺铂(CDDP)或二氨二羧酸铂(PC或DDAP)处理48小时 后，2008-C13细胞株中细胞周期分布。图中Gl、 G2、 M与S标示细胞周期。图17B显示在2008-cl3细胞中的p21西方墨点分析与细胞周期素表现， 其是用顺铂(CDDP)与二氨二羧酸铂(PC或DDAP)处理。GAPDH:甘油醛-3-憐酸画脱氧酵(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)。
具体实施例方式
在某些实施例中，本发明包含金属-多糖体共轭物、其合成方法与应用， 其包含诱导癌症细胞死亡与治疗癌症。确切地说，该共轭物是包含一多糖 体，其具有至少一结合的单体氨基酸。该氨基酸可再与金属共轭结合。在 较佳的实施例中，该氨基酸是经由氧基(O-group)与金属共轭结合，而非经 由氮基(N-group)与金属共轭结合。在一些实施例中，该金属是过渡金属。 在许多实施例中，该共轭物可结合有多个单体氨基酸，该多个单体氮基酸 可与多个金属基团共轭结合。该共轭物可具有任意尺寸大小，但是在某些 实施例中，该共轭物是被合成为每一分子至少为10,000道尔顿，例如IO，OOO 到50,000道尔顿之间，以限制其经由肾脏被排出的作用。在一较佳的实施 例中，该多糖体共轭物具有20,000至50,000道尔顿的分子量，更佳地为 26,000至30,000道耳顿。
该多糖体是选自于任意一种多糖体，但是与血管摄取有关的多糖体为 更佳。较佳地，黏着分子(adhesive molecule),例如胶原蛋白(collagen)、软 骨素(chondroitin)、胎盘素(hyauraniate)、几丁聚糖(chitosan)与几丁质(chitin)， 同样为适用的多糖体。在一较佳的实施例中，该多糖体为软骨素A。虽然 本发明不限于一特定模态的作用，但是该类多糖体可促进经由血管的摄取 作用与对癌症细胞的传输作用。该作用在发生血管新生的部位(例如大部分 的肿瘤)特别明显。分子量介于20,000至50,000道尔顿之间的最终产物有利 于达到以血管为主的治疗。
该氨基酸是以各种稳定的形式结合到该多糖体，但是在多数的实施例 中，其是共价键结到多糖体。该氨基酸可为单体的形式，以使单独的单体分别结合到多糖体上。该氨基酸具有可与金属共轭结合的氧基，较佳地， 其具有两个可被利用的氧基。该金属是经由一单体氨基酸、或是两个或多 个单体氮基酸而被共轭结合。可被单独使用或是结合使用的示范性的氨基酸单体包含谷氨酸(glutamic acid)、天门冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸结合 丙氨酸(alanine)、谷氨酸结合天门冬酰胺(asparagines)、谷氨酸结合谷酰胺 (glutamine)、谷氨酸结合甘氨酸(glycine)或天门冬氨酸结合甘氨酸(glycine)。 由于两羧酸之间的键长以及较佳的肿瘤摄取专一性，天门冬氨酸为较佳。 这些氨基酸为L型、D型、或L型与D型的消旋混合物。对于最理想的肿 瘤摄取作用，L型氨基酸为较佳。因为一单一的天门冬氨酸单体可自行与一 金属共轭结合，因此可选用天门冬氨酸。此外，天门冬氨酸不是由哺乳动 物的细胞所制造，但却是一必要的营养物，使其可能会快速地被成长中的 肿瘤细胞所摄取。该多糖体共轭物可包含重量百分比介于约10%到约50%的氨基酸。 多糖体上的氨基酸结合点可具有不同的饱和度。例如，如图1A所示， 只有一个氨基酸被结合。其也可达到很低的饱和度，例如小于或等于5%、 小于或等于10%或者小于或等于20%。图1B显示一具有中度饱和度的共轭 物，例如约30%、约40%、约50%或约70%。图1C显示一具有高度饱和 度的共轭物，例如大于或等于80%、大于或等于90%、大于或等于95%或 者实质上完全饱和。虽然在图1A、图1B、图1C中，每一氨基酸具有一共 轭结合的金属，在许多实际的范例中，可与金属共轭结合的氨基酸可具有 各种程度的饱和度，例如小于5%、 10%或20%、约30%、约40%、约50% 或约70%;大于80%、卯％、 95%，或是实质上完全饱和。该金属可为任意一种金属原子、金属离子或含有一金属的化合物，其 是与该氨基酸的氧基共轭结合。在特定的实施例中，该金属可为一过渡金 属，例如钼(platinum)、铁(iron)、轧(gadolinium)、铼(rhenium)、锰(manganese)、 钴(cobalt)、铟(indium)、镓(gallium)或铑(rhodium)。该金属可为一治疗的金属，其可为一大分子(例如药)的一部分。该金属可经由氨基酸单体的氧基共 轭结合到多糖体-氨基酸的主链。在一实施例中，该金属相对于多糖体共轭物的重量百分比为15%到约 30%。在一实施例中，该共轭物包含共价键结到天门冬氨酸单体的软骨素 A(chondroitin A)，其中该天门冬氨酸单体在一含铂的化合物中与铂共轭结 合。在一变化态(variation)中该铂可为铂(II);在另一变化态中该铂可为铂 (IV)。该共轭物可为水溶性。例如，其可具有一至少约20mg(金属当量)/ml 水的溶解度。该共轭物可被用于各种形式，例如一水溶液或是一粉体。该 共轭物与其配方可被消毒过，例如，其可为一消毒过的粉体。依据本发明的一实施例，可利用分别共价键结一个或多个氨基酸单体 到一多糖体合成该共轭物，然后一金属可利用氨基酸单体以进行共轭结合。 依据本发明的另一实施例，该金属可共轭结合到该氨基酸单体，然后一个 或多个该氨基酸单体可共价键结到该多糖体。本发明的共轭物可用于杀死癌症或肿瘤细胞，因此可用于治疗癌症或 肿瘤。S卩，本发明还提供了所述的共轭物在制备治疗癌症或肿瘤的药物中 的用途。该共轭物可标的肿瘤，特别是固态肿瘤。这种功效可被证实，举 例来说，利用该化合物的放射性标定的变化态(radiolabeledvariation),如一 多糖体-氨基酸主链共轭结合至99mTc，其可使用Gamma射线显影(gamma imaging)。细胞毒性齐U(cytotoxic agent)与一金属成分可共轭结合到该多糖体 -氨基酸的主链以降低其毒性，例如，该细胞毒性剂可从多糖体被逐渐释放， 以降低剧烈的系统毒性。此外，可共轭结合具有低水溶性或低肿瘤标的能 力的药物与该多糖体-高分子主链来增加这些药物的治疗指数(thempeutic index,毒性/疗效)。在特定的实施例中，含铂共轭物在低于顺铂的剂量时可抑制癌症细胞生长。此外，含钼共轭物也可抑制抗顺铂癌症细胞的生长，特别是卵巢癌 细胞。任何一种癌症或肿瘤细胞可被本发明选用的共轭物杀死或是抑制生 长。然而，这些共轭物对固态肿瘤可能产生最好效果。会被本发明某些共轭物影响的示例性的癌症包含卵巢癌(ovarian cancer)、抗顺铂卵巢癌 (cisplatin-resistant ovarian cancer)、月夷脏癌(pancreatic cancer)、 乳癌(breast cancer)、 肉瘤(sarcoma)、 子宫癌(uterine cancer)与淋巴癌(lymphoma)。除了癌症之外，本发明的某些共轭物可标示及抑制与以下疾病的发展 与增长有关的细胞艾滋病(HIV)、自我免疫疾病(autoimmune diseases)(例 如脑脊髓炎(encephalomyelitis)、白斑(vitiligo)、硬皮病(scleroderma)、甲 状腺炎(thyroiditis)与穿通性胶原病(perforating collagenosis))、遗传性疾病(例 如着色性干皮症(xeroderma pigmentosum)与葡萄糖六磷酸盐脱氢酶缺乏症 (glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency))、代谢性疾病(例如糖尿病 (diabetes mellitus))、 心血管疾病、神经精神疾病(neuro/psychiatric diseases) 与其它症状(例如血糖过少(hypoglycemia)与肝硬化(hepatic cirrhosis))。实施例下列包含于本文中的实施例是用来说明本发明的具体实施方案。任何 熟悉此项技艺的人员应能领会揭露于下列实施例当中的技术，且其是依据 发明人发现的代表性技术来进行，其是在本发明的实施当中运作良好。然 而，根据本揭露，任何熟悉此项技艺的人员应能领会在不悖离本发明的精 神及范围内，对己揭露的具体实施方案作许多改变，其仍可获得同样或类 似的结果。实施例h铂类似物(n)与av)-多糖体共轭物的合成滩力顺-l,2-环己二胺-硫酸钼(II) [cis-l，2-Diaminocyclohexane sulfatoplatinum(n)，(顺-l,2-DACH-Pt.S04)]是经由两阶段合成。在第一阶段中，藉由将一于 120ml去离子水中的K2PtCl4(5.00g, 12mmol)的经过滤的溶液与Kl(20.00g溶 于12ml水中，120mmol)混合，并将其搅拌5分钟来合成出顺-l，2-DACH-Ptl2 错合物。将一当量的顺-l，2-DACH(1.37g, 1.487ml， 12mmol)加到此溶液中。 将该反应混合物在室温下搅拌30分钟。所得的黄色固体被过滤分离出来， 然后用少量的去离子水清洗。最终产物在真空下干燥，可得顺 -1,2-DACH-Ptl2(6.48g，96%)。在第二阶段中，将顺-l,2-DACH-Ptl2(来自第一 步骤没有经过进一步纯化，6.48g， 11.5mol)以固体的形式加到一 Ag2S04(3.45g， llmmol)的水溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌至隔夜。 利用过滤移除Agl，并将滤液在真空下冷冻干燥，得到黄色顺 -l,2-DACH-Pt(II)S04(4.83g，99%)。元素分析显示Pt: 44.6%(w/w)。
将N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)(241.6mg, 1.12mmol)与3-乙基碳 二亚胺-l-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(3-ethylcarbodiimide l-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide画HCl, EDC) (218.8mg, 1.15mmol) (Pierce Chemical Company, Rockford， IL)加入至一在水(5ml)中的 软骨素(lg， MW. 30，000-35，000)的搅拌溶液中。然后加入L天门冬氨酸钠盐 (356.8mg, 1.65mmo1)。将该混合物在室温下搅拌24小时。接着利用一具有 10,000分子量截留(cut-off)的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc., Huston, TX)将该混合物透析48小时。透析之后，将该产物过 滤并使用冻干器(Labconco, Kansas City， MO)冷冻干燥。该产物天门冬氨-软 骨素(多糖体)为一盐的形式，其重量为1.29g。类似的技术可被用于制备具 有谷氨酸与丙氨酸、谷氨酸与天门冬酰胺、谷氨酸与谷酰胺、谷氨酸与甘 氨酸、以及谷氨酸与一与丙氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺或甘氨酸共轭结合 的天门冬氨酸的软骨素。
将顺-l，2-DACH-Pt(II)SO4(500mg, 1.18mmol)溶于10ml去离子水，再加 入一天门冬氨-软骨素溶液(1.00g溶于15ml去离子水)。将该溶液在室温下搅拌24小时。经过透析(MW: 10,000)与冷冻干燥后，所得的顺 -l,2-DACH-Pt(II)-多糖体为1.1462g。柏-多糖体共轭物，顺-l，2-DACH-二氯-Pt(IV)-天门冬氨-软骨素(PC)是由 以下步骤合成将上述溶液(上述经搅拌24小时的顺-l，2-DACH-Pt(II)S04 与天门冬氨-软骨素的溶液)逐滴加入2.5ml的30M过氧化氢水溶液。24小 时后，将HC1(0.02N, 75ml)加入并在室温下搅拌24小时，再利用去离子水 透析(MW: 10，000)隔夜并在真空下冷冻干燥。所得的最终产物为1.15g。元 素分析显示Pt: 21.87%(w/w)。其合成流程图显示于图2。滩丑将顺-1,2-DACH-Pt(II)S04或顺1 ，2画DACH-二氯-Pt(IV)(500mg， 1.18mmo1) 溶于10ml去离子水中，再加入一天门冬氨酸(67mg，0.5mmol)溶于2ml去离 子水的溶液。将该溶液在室温下搅拌24小时。经过透析与冷冻干燥后，将 顺-l,2-DACH-Pt-天门冬氨与于水(5ml)中的软骨素(lg, MW. 30,000-35,000)、 sulfo隱NHS(241.6mg, 1.12mmol)及EDC(218.8mg， 1.15mmol)(Pierce Chemical Company, Rockford，IL)反应。其合成流程图显示于图3。实施例2:活体外细胞培养检定法为了评估顺铂与用如上所述的方法A所制备的铂(II)-多糖体共轭物(PC) 对于乳房肿瘤细胞的细胞毒性，所以选用两种人类肿瘤细胞株2008细胞 株与其抗铂细胞亚株2008-C13对其进行评估。所有的细胞都在37C下培养 于含有5%C02的潮湿大气中、补充有10。/。胎牛血清与谷酰胺(2mM)的RPMI 1640培养基中。将2008细胞或2008-cl3细胞植入96孔培养盘中(4，000细 胞/孔)，并在RPMI 1640培养基中培养24小时。接下来，用浓度为2.5、 5、 10、 20、 25与50 u g/mL的PC或CDDP处理细胞48及72小时。对照组则 用二甲基亚砜(DMSO)或PBS处理。细胞经过处理之后，将细胞用20 uL 四唑(tetmzolium)基质在37'C下培养1~2小时以测量细胞的生长及存活能力。利用96孑L Synergy HT-微量盘判读仪(miro) (Biotek， Winooski， Vermont) 来测量在450nm的吸光値。细胞生长抑制率可以表示为如下的百分比值o/0=画—(OD 对照组一OD实验组)/OD对照组o 将实验分别重复三次。利用亚甲基四唑(methylene tetrazolium， MTT)染色检定法测量存活细胞的数量。利用 Lowry检定法测量细胞蛋白质含量。然后决定出可抑制50n/。细胞生长(IC-50) 的药物浓度。以与对照组比较所得的百分比差距(经处理细胞的OD/未经处 理细胞的OD)来表示实验数据。图4与图5显示一示范的细胞生长抑制曲 线。该结果显示，在抗铂卵巢癌细胞株中，暴露于铂-多糖体共轭物(PC)的 IC-50下的细胞的感光度大于暴露于顺钼(CDDP)的IC-50下的细胞的感光度 的5.7倍(图4)，而这种状况没有出现在铂敏感性(platinum-sensitive)卵巢细 胞株中(2008)(图5)。特别是，在48小时的实验中，与顺铂(CDDP)(图4中 的图片A)比较，2.5与5 tx g/mL浓度的铂-多糖体共轭物(PC)分别增加了 5.9 与4.6倍的肿瘤细胞的死亡；在72小时的实验中，其与顺铂(CDDP)(图4 中的图片B)比较分别增加了 9.3与1.5倍。该数据显示低药量的铂-多糖体 共轭物(PC)大大抑制了抗铂卵巢癌细胞的细胞生长。为了测量铂-多糖体共轭物(PC)对抗抗铂卵巢癌细胞的效果，用铂-多糖 体共轭物(PC)处理2008-C13细胞(0.5xl(T6)。将该细胞经胰蛋白酶消化作用 (trypsinized)后，再于2500rpm下离心分离5分钟。用lxPBS清洗两次之后， 将细胞用70%乙醇固定隔夜，再用lxPBS清洗两次，然后重新悬浮于lmL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)溶液(lxl()6细胞/mL)中。接着加入RNase溶 液(20 u g/mL)后，再加入lmL碘化丙啶溶液(PI, 50 u g/mL溶于PBS)。将样 品在37。C下培养15分钟，接着用EPISXL分析仪分析PI荧光。相较于顺 铂(CDDP)，钼(IV)-多糖体共轭物在低浓度(2.5与5 y g/mL)时大大促进了抗 铂卵巢癌细胞的凋亡作用(图6A、图6B与图7A、图7B)。这些结果被TUNEL检定法(TUNEL assay)所证实，经过48小时处理后，其显示暴露于两种药物的细胞的死亡率随药量增加而增加。然而，在比较
每一药剂量吋，经铂-多糖体共轭物(PC)处理的实验组有较多的凋亡的细胞 (PO.05)(图8)。
实施例3:利用带有乳房肿瘤的大鼠模型来评估抗癌效果
将乳癌细胞(13762NF， 106细胞汰鼠，皮下注射于后大腿内)接种于雌性 Fischer 344大鼠(125-175g)。在15-20天后并且肿瘤体积为lcm3时，将铂-软骨素(钻-多糖体)共轭物(PC)或是软骨素分别以10mg Pt/kg(铂(IV)-多糖体) 或是45mg/kg(软骨素)的剂量施用于带有乳房肿瘤的大鼠。每日纪录肿瘤体 积与体重持续60天。肿瘤的体积以[长(l)x宽(w)x厚度(h)]/2的方式来测量。 15%的体重减少被视为是化学药物导致毒性的影响。该结果显示铂-多糖体 共轭物(PC)可以在活体内有效地对抗乳房肿瘤的生长(图9A、图9B)。经过 铂-多糖体共轭物处理后，切开肿瘤组织并浸泡于福尔马林中。将该肿瘤组 织固定在石蜡膜(pamffm)中，并用苏木紫与伊红染色以进行组织检查。在给 予铂-多糖体共轭物后94小时观察到大规模的坏疽，但是单独给予多糖体的 组别没有发生这种现象(图10A 图IOD)。
实施例.4:肿瘤细胞死亡或是抑制的方法
用铂-多糖体共轭物处理2008-cl3乳房肿瘤细胞以分析实施例1的钼-多糖体共轭物对于肿瘤细胞的影响，然后利用西方墨点法(Westem blot)(图 ll)分析对于细胞蛋白质的影响。在用铂-多糖体共轭物(PC)处理的细胞中， 裂解后的PARP(Poly ADP-ribose polymerase, 二磷酸腺苷核糖多聚酶)被大 大地增加。相较于顺铂(CDDP)，可以看出铂-多糖体共轭物经由加强依赖 Caspase-3蛋白酶的凋亡作用的途径而抑制了 2008-cl3细胞的生长。
在给药48小时与72小时后，这种效果利用2008-C13细胞株中的流式 细胞技术(flow cytometry)来测试。流式细胞分析显示经由PC与CDDP处理 后，在sub-Gl部分的细胞的数量随药量增加而增加，其代表了亚二倍体细胞(hypodiploidcdl)并显示了凋亡作用的诱发。然而，相较于CDDP， PC的 使用导致了在同样的药量下sub-Gl部分更明显地增加(图14A、图14B)。
利用TUNEL检定法在三组独立的实验中进一步测量凋亡的典型的 DNA分裂。在给予以上两种药物后，可测得凋亡细胞的数量随药量增加而 明显增加的趋势。然而，当比较每一药量时，经PC处理的细胞显示较高程 度的凋亡(P〈0.05)(图15A、图15B)。
为了测试凋亡是否经由一依赖Caspase-3蛋白酶的途径，接着发生 PARP裂解所诱导，所以藉由西方墨点法来测定裂解后的Caspase-3蛋白酶 及PARP的量(其是在Caspase-3蛋白酶活化之后形成)。PARP为一 113-kDa 的核蛋白，其已被显示在依赖Caspase-3蛋白酶的凋亡过程中被特定地裂解 成一85-kDa片段。将细胞暴露于CDDP或PC48小时后，在每一药量都出 现了裂解后的PARP。在用CDDP处理的细胞中，裂解后的PARP的表现 从2.5 U g/mL到20 U g/mL为增加的趋势，裂解后的Caspase-3蛋白酶表现 为与PARP的模式类似。在用PC处理的细胞中，除了在5yg/mL的PC被 观察到较低的表现之外，裂解后的Caspase-3蛋白酶的表现相当于用CDDP 处理的细胞中的裂解后的Caspase-3蛋白酶的表现。虽然被高药量 (20 ii g/mL)PC所诱导的裂解后的PARP的表现低于被低药量PC所诱导的 表现，但是在其上游的裂解后的Caspase-3蛋白酶的表现则没有侦测到这种 差别(图16)。
在对活体外2008-cl3乳癌细胞进一步的测试中，流式细胞分析显示在 暴露于铂-多糖体共轭物(PC)48小时后，细胞明显地停留在S期(图12)。最 高程度的S期的阻断发生在2.5与5 " g/mL的低药量(90.3%与90.1%)。当 与顺钼(CDDP)比较时，钼-多糖体共轭物(PC)将细胞阻滞在S期的作用则明 显不同。
确切地说，在用PC或CDDP处理2008-cl3细胞48小时后，用流式 细胞技术分析DNA含量。在5ug/mL药量下，暴露于CDDP诱使细胞阻滞于S期，并且增加了 sub-Gl的部分，但这种状况没有发生在最低的药 量(2.5 y g/mL)时。阻滞在S期的细胞的数量与sub-Gl的部分会随CDDP药 量的增加而逐渐增加，最大的S期阻滞(84.8o/。)发生在20ixg/mL。将细胞暴 露于PC48小时后，最高度的S期阻断发生在较低药量(2.5ug/mL[90.3。/。] 与5ug/mL[90.1%])。在较高的药量(IO与20ug/mL)， S期阻滞的程度随 sub-Gl部分的增加而逐步减少。这可以被解释为在高药量PC的强烈抑制 下，在细胞被阻滞于S期之前，其快速地且直接地发生凋亡(图17A、图17B)。
为了阐明在2008-cl3细胞中由CDDP与PC所引起的S期阻滞的机制， p21与细胞周期素A(cyclin A)的表现(对于S期中的细胞周期控制很重要)是 在给药48小时后在2008-C13细胞中被检测。经过CDDP处理之后，p21或 细胞周期素A的表现与S期阻滞的程度无关。然而经过PC处理之后，p21 或细胞周期素A的表现直接与S期阻滞的程度相关在用低药量PC处理 后，p21被向上调节而达到最大的S期阻滞，但是在高药量处理后却不会发 生这种现象；在用高药量PC处理后，细胞周期素A被向上调节，而用低 药量PC处理后则保持在一个低的水平(图17B)。
当与用顺铂(CDDP)处理的细胞比较时，用铂-多糖体共轭物(PC)处理过 的2008-cl3乳房癌细胞在转录表现(图13A)与蛋白质表现(图13B)的程度上 都显示出增加的p21表现。
其它实施方案
虽然上文中仅具体描述本发明的示范性实施方案，但应能领会这些实 施例的润饰与更动仍可能没有悖离本发明的精神及范围。
权利要求
1、一种多糖体共轭物，其包含多糖体；至少一单体氨基酸，其具有氧基，且该单体氨基酸共价键结到该多糖体；及至少一金属，该金属是与该氨基酸的氧基共轭结合。
2、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，该多糖体共轭物具有介于 20,000到50,000道尔顿间的分子量。
3、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，其中所述多糖体选自胶原蛋 白、软骨素、胎盘素、几丁聚糖及几丁质中的一种或多种。
4、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，其中所述多糖体包含软骨素。
5、 根据权利要求l所述的多糖体共轭物，其中所述单体氨基酸选自天 门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺及甘氨酸中的一种或多 种。
6、 根据权利要求l所述的多糖体共轭物，其中所述单体氨基酸包含天 门冬氨酸。
7、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，该共轭物包含重量百分比介 于10%到50%的单体氨基酸。
8、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，其进一步包含包含所述金 属的药物。
9、 根据权利要求l所述的多糖体共轭物，其中所述金属为治疗金属。
10、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，其中所述金属选自铂、铁、 钆、铼、锰、钴、铟、镓及铑中的一种或多种。
11、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，其中所述金属包含铂(II)。
12、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，其中所述金属包含铂(IV)。
13、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，该共轭物包含重量百分比 介于10%到50%的所述金属。
14、 根据权利要求8所述的多糖体共轭物，该共轭物包含重量百分比 介于10%到50%的包含所述金属的药物。
15、 根据权利要求1所述的多糖体共轭物，该共轭物包含重量百分比 介于15%到30。/。的铂(II)或铂(IV)金属及重量百分比为70%的天门冬氨酸单 体氨基酸，且该多糖体共轭物具有介于26,000到30,000道尔顿间的分子量。
16、 一种合成多糖体共轭物的方法，其包含 将具有氧基的单体氨基酸共价键结到多糖体；及 共轭结合金属到该氧基以形成多糖体共轭物。
17、 根据权利要求16所述的方法，其进一步包含干燥前述多糖体共轭 物以形成粉末。
全文摘要
本发明是关于一种多糖体共轭物及其合成方法。依据一实施方案，本发明提供了一种多糖体共轭物，该共轭物具有多糖体与至少一具有氧基的单体氨基酸，其中该单体氨基酸共价键结到该多糖体。该共轭物还具有至少一金属，该金属是与该氨基酸的氧基共轭结合。依据另一实施方案，本发明提供了一种合成多糖体共轭物的方法，其是共价键结具有氧基的单体氨基酸到多糖体，并且共轭结合金属到该氧基以形成多糖体共轭物。依据第三实施方案，本发明是关于一种杀死癌症细胞的方法，其是经由给予该细胞有效量的所述多糖体共轭物。
文档编号A61P35/00GK101318022SQ20081010936
公开日2008年12月10日 申请日期2008年6月2日 优先权日2007年6月4日
发明者于东防, 杨敬文, 魏一健 申请人:聚和国际股份有限公司