专利名称：一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及培养细胞生产疫苗的方法，特别是涉及一种培养敏感细胞生产 蓝耳病疫苗的方法。
背景技术：
蓝耳病，是猪繁殖与呼p及综合4正病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染所引起的一种接触性传染病。各种日龄的猪只 均可感染，临床上主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸症状。母猪的繁殖障 碍可表现为流产、死产和弱仔，生后仔猪的死淘率增加；哺乳仔猪的呼吸道症 状主要表现为高热、呼吸困难等肺炎的症状。该病目前尚无特效药物疗法，主 要采取疫苗强制免疫的办法。
目前，蓝耳病疫苗的生产主要是通过转瓶培养Marc145细胞并增殖猪繁殖 与呼吸综合征病毒的工艺进行生产。该方法自动化程度低，劳动强度大，并因 为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致细胞和蓝耳病疫苗质量不稳定，产品批 次差异大。
发明内容
为了克服现有蓝耳病疫苗的生产技术所存在的缺陷，实现简便、高效的生 产蓝耳病疫苗，发明人经过研究，提供了一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的 方法。该方法应用^f敬载体培养技术在生物反应器中培养^:感细胞来生产蓝耳病 疫苗。因为微载体提供了更大的表面积，细胞可以生长到更高的细胞密度，而 生物反应器的自动控制培养环境参数，使得细胞生长和病毒繁殖处于较优的环 境，提高了病毒滴度，疫苗质量也更加稳定。
在本发明的一个方面中，提供了一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方 法，其包括以下步骤
1) 用微载体培养敏感细胞；
2) 在微载体培养的所述敏感细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒；3) 继续培养所述敏感细胞；
4) 收获病毒液，生产蓝耳病疫苗。
在本发明的一个实施方式中，步骤l)用微载体培养敏感细胞是按以下过
程进行的将微载体经清洗和高温灭菌之后，接种所述敏感细胞，接着培养细 胞到细胞密度为3 x 106-10 x 106 cells/ml,此时微载体上的细胞形成健康、致 密的单层，有利于蓝耳病病毒的吸附、感染并在细胞上实现增殖。优选的细胞 密度为5 x 106 cells/ml左右，过高的细胞密度容易导致营养不够，过低的细胞 密度则无法实现微载体培养达到高密度的优点，生产成本增加。
优选地，所述培养细胞采用灌注培养方式。细胞灌注培养是指在细胞培养 过程中，往生物反应器中不断地流加新鲜培养基，同时通过细胞截留装置排出 培养上清，而活细胞被继续截留在生物反应器中的一种培养操作方式。培养基 的不断流出，可带走代谢副产物如乳酸、氨等，使其维持在低浓度水平，不会 成为细胞生长的抑制因素，所以细胞可生长在良好培养环境中，能获得很高的 细胞培养密度和产物生产速率。灌注培养具有反应器体积小，回收培养上清体 积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收产品至低温下保存，有利于保持产 品活性等显著特点。
优选地，在本实施方式中，该灌注培养方式可以釆用以下过程进行在生 物反应器中，微载体用PBS冲洗、浸泡几遍，高压灭菌后，往生物反应器中 接种敏感细胞，待细胞生长至l-2xl0乞ells/ml的细胞密度后，进行灌注培养， 每天的灌注速率为0.5-3个培养体积，随着细胞密度的提高，逐步提高灌注速 率，直到反应器中的活细胞密度达到3-10xl06cells/ml。
在本发明的另一实施方式中，优选地，在步骤2)中，按病毒感染复数 MOI为0.01 - 0.5的量接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒。敏感细胞感染合适 的蓝耳病毒数量，有利于病毒在细胞上的复制和增殖。本发明考虑到工业化生 产所需要的稳定的种子PRRSV病毒来源以及本发明的实践结果，更优选MOI 在0.01-0.2。其中猪繁殖和呼吸综合症病毒PRRSV，无论是欧洲型还是美洲型， 强毒抹还是弱毒株，对Marc145细胞和MA104细胞普遍具有适应性和敏感性， 所以本发明所阐述的方法适用于所有PRRSV毒抹。
在本文中，术语"病毒感染复数MOI (multiplicity of infection)"是指每一个细胞上所感染病毒的数量。MOI =有感染力的病毒量/细胞总量。
在本发明的另一实施方式中，步骤3)中所述继续培养所述敏感细胞采用 流加培养或灌注培养方式，维持pH在6.9-7.3的范围和病毒繁殖所需要的营 养条件。在病毒感染敏感细胞一段时间后，比如6-18hr后，可以采用流加培 养或者灌注培养等方式往生物反应器中添加病毒维持液，维持合适的pH值(比 如6.9-7.3)和营养成份，不断收获上清病毒液。
在本发明的另一实施方式中，步骤4)可以采用各种方法来制备疫苗。比 如，可以将所收获的病毒液^:置于2-8。C中，并保存在-2(TC，冻融l次，过 滤、灭活、乳化后制备疫苗。
在本发明中，所用的敏感细胞可以是任何适宜培养猪繁殖与呼吸综合征病 毒的细胞，优选地，所述敏感细胞选自Marc 145细胞或MA 104细胞，其中 Marc 145是MA 104克隆后的细胞。
优选地，本发明方法是在生物反应器中进行的。在本发明中，所采用的生 物反应器包括但不限于搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、wave生物反 应器和中空纤维反应器等。
在本发明的各种实施方式中，所选用的培养基、微载体等具体构成并不是 关键的，原则上所有能够用于培养所用的敏感细胞和猪繁殖与呼吸综合征病毒 的培养基和微载体都可以使用。很多培养基和微载体都已经是商业化产品，可 以通过商业途径获得。
本发明的前述及其他特征将在下文中更全面进行描述并在权利要求中特 别指出，以下说明书详细阐述本发明的一些示例实施方式，不过，这些实施方 式只是表示本发明的原则可以被使用的几个不同的方式。参见下面优选的实施 方式，本发明的其他优点和特征对于本领域技术人员来说是显而易见的。
图1显示了 50升反应器中微载体培养Marc145细胞的细胞生长曲线。
具体实施例方式
本发明方法的优选实施方式为
在生物反应器中，微载体用PBS冲洗、浸泡几遍，高压灭菌后，往生物 反应器中接种敏感细胞，细胞生长至l-2xl06cdls/ml的细胞密度后进行灌注培养，待活细胞密度达到3-10xl06cells/ml后，加入病毒液，按病毒感染复数 MOI-0.01-0.5 (优选MOI = 0.01 - 0.2 )的量，在微载体培养的敏感细胞上接 种猪繁殖与呼吸综合征病毒，病毒感染6-18hr后，通过流加培养或灌注培养 的方式维持病毒繁殖所需要的营养条件和6.9-7.3的pH值，从第1-3天起收获 病毒液，收获病毒液经-20。C冻融后测定收获液的TCID5。/ml,并用于蓝耳病疫 苗的制备。
培养过程中的温度、溶解氧浓度、搅拌转速、pH值等原则上并不重要， 取决于所选用细胞的种类。优选地，温度、溶解氧浓度、pH值被选择为其 对细胞和病毒的生长和生产率来说是最优的。本领域技术人员知道如何找到这 些最优的条件。通常，最优温度介于36.5 -37。C之间，最优溶解氧浓度介于 20% - 60%饱和空气度，pH值介于6.8 - 7.2之间。
病毒滴度TCID5o的测定按照常规方法进行，比如可以按照文献方法进行 (韩先杰，王宏伟，王金宝猪繁殖与呼吸综合征病毒TCID5o的测定莱阳农学 院学报22(2): 132— 134, 2005)。
实施例1、在50升生物反应器中孩i载体培养Marcl45细胞生产蓝耳病疫
苗
微载体cytodex-l (GE生命科学，Cat No. 17-0485-03) 猪繁殖和呼吸综合症病毒NVDC-JXA1抹。
培养基Marcl45细胞反应器高密度培养基(北京清大天一生物技术有限 公司，CatNo.MD900， Lot No. 080310 )
在50升生物反应器中，将cytodex-l用PBS冲洗、浸泡几遍，高压灭菌 后，往生物反应器中接种Marcl45细胞，细胞生长至2xl06cells/ml的细胞密 度后进行灌注培养，待活细胞密度达到6xl(^cells/ml后，更换病毒液，按病毒 感染复数MOI-0.015接种猪繁殖与呼吸综合征病毒。接着，通过灌注培养的 方式维持病毒繁殖所需要的营养条件和6.9-7.3的pH值，从第1-3天起收获病 毒液，收获的病毒液经-20。C冻融后，测定其TCID5。/ml。将所收获的病毒液放 置于2-8。C中，并保存在-20。C，冻融l次，过滤、灭活、乳化后制备疫苗。
图l表示细胞生长过程的细胞生长曲线。培养2-4天时间后，收获阶段收 集的病毒液的病毒滴度与转瓶培养工艺相比，提高了 0.3-1个TCIDso/ml(即病毒滴度是转瓶培养工艺的10^"倍)。
在以上教导的指导下，可以进行关于本发明的各种改进和变化。因此，可 以理解的是，在后附的权利要求的范围内，可以以除了本文具体描述的方式之 外的其他方式实施本发明。
权利要求
1.一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方法，其包括以下步骤1)用微载体培养敏感细胞；2)在微载体培养的所述敏感细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒；3)继续培养所述敏感细胞；4)收获病毒液，生产蓝耳病疫苗。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)用微载体培养敏 感细胞是按以下过程进4亍的将微载体经清洗和高温灭菌之后，接种所述敏感 细胞，接着培养细胞到细胞密度为3 x 106-10 x 106 cells/ml。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养细胞采用流加或 灌注i昏养方式。
4. 根据权利要求1-3中任何一项所述的方法，其特征在于步骤2)中， 按病毒感染复数MOI为0.01 - 0.5的量接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述病毒感染复数MOI 为0.01-0.2。
6. 根据权利要求1 - 3中任何一项所述的方法，其特征在于步骤3)中 所述继续培养所述敏感细胞是采用流加培养或灌注培养方式，维持pH在6.9 - 7.3的范围和病毒繁殖所需要的营养条件。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤3)中所述继续培养 所述敏感细胞采用流加培养或灌注培养方式，维持pH在6.9-7.3的范围和病 毒繁殖所需要的营养条件。
8. 根据权利要求1-3中任何一项所述的方法，其特征在于所述敏感细 胞选自Marcl45细胞或MA104细胞。
9. 根据权利要求1 - 3中任何一项所述的方法，其特征在于所述方法是 在生物反应器中进行的。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述生物反应器包括搅拌 式生物反应器、气升式生物反应器、wave生物反应器和中空纤维反应器。
全文摘要
本发明提供了一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方法，其包括以下步骤1)在生物反应器中用微载体培养敏感细胞；2)在微载体培养的所述敏感细胞上接种猪繁殖与呼吸综合征病毒；3)继续培养所述敏感细胞；4)收获病毒液，生产蓝耳病疫苗。该方法应用微载体培养技术在生物反应器中培养敏感细胞来生产蓝耳病疫苗。因为微载体提供了更大的表面积，细胞可以生长到更高的细胞密度，而生物反应器的自动控制培养环境参数，使得细胞生长和病毒繁殖处于较优的环境，提高了病毒滴度，疫苗质量也更加稳定。
文档编号A61K39/12GK101612395SQ200810115478
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者刘俊生, 王建超, 陈文庆 申请人:北京天和瑞生物科技有限公司