专利名称：：一种蜈蚣的仿生酶解产物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药蜈蚣的仿生酶解产物及其在治疗相应疾病中的应用。属中药领域。
背景技术：
：蜈蚣为节肢动物门唇足纲整形目蜈蚣科动物，是中国药典收载的药材品种，始载于《神农本草经》，具有熄风止痉、解毒散结、通络止痛的作用,主治小儿惊风、破伤风、风癣、疮疡、肿毒、烫伤等，在疾病的预防和治疗中的使用已有2000多年的历史。由于近年来对息风止痉药治疗各种疑难病的不断深入研究，蜈蚣的药用也倍受青睐。蜈蚣作为传统中药，临床应用很广泛，在入药的方式上通常采用原药材粉碎后直接服用，或水提或醇提或水提醇沉后服用，其所采取的提取方法比较传统。在中医临床上用单味蜈蚣或配伍复方，口服给药，疗效确切。然而临床疗效确切的蜈蚣制剂多为干燥药材原粉制成的中成药，或经水煎煮提取制得的粗提物，药材利用率较低，活性物质没有获得充分的利用。人体经口服蜈蚣后，经胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化，以小分子寡肽类成分吸收入血发挥疗效。小分子的寡肽类物质和小肽是很容易被小肠吸收利用，而大分子的蛋白类在小肠里很难被吸收利用。传统的原粉直接服用，原药粉中大分子蛋白，只有少量在体内经过胃肠道的分解，变成小分子的寡肽而被吸收，由于药材粉碎的细度、胃肠道pH的变化及口服其他食物的干扰造成水解的不完全，有效成分被吸收利用的少，造成大量药材的浪费疗效大大降低。水提、水提醇沉或醇提的提取工艺使大分子量的蛋白变性，不溶入水、醇，未被溶出，被滤过除去，造成大量的药材浪费，疗效同样大大降低。应用酶解法水解动物蛋白，获得具有一定生理活性的生物活性肽是目前国内外研究的热点。由于不同的酶水解的部位不一样，得到的酶解产物也大不相同，比如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键，用单一的胃蛋白酶、胰酶或其他蛋白酶来酶解，均不能使蛋白被有效的吸收利用，这样就迫切的需要一种新的酶解方法——在动物或人体生物进化过程中已被证实、疗效确切的、模拟人体的消化过程的仿生酶解方法，将动物药中有效成分更容易吸收，更加安全的利用，同时更加充分利用原药材。
发明内容本发明的第一目的在于提供一种更有效的，安全的蜈蚣仿生酶解产物；本发明的第二目的是提供该提取物在息风止痉及治疗癌症、心脑血管病、肝炎、慢性肾炎、风湿性关节病、坐骨神经病，各种皮肤病瘙痒证药物中的应用。发明人提供一种蜈蚣的酶解产物，该药物采用仿生酶解的方法制备-取蜈蚣，加水匀浆，调节pH至1.03.0，加入胃蛋白酶于3545。C保温酶解0.54小时，再调节pH至7.58.5，加入胰酶或胰蛋白酶于405(TC保温酶解28小时，即得。进一步优化为取蜈蚣，加水匀浆，调节pH至1.52.5，加入蜈蚣量的0.5%5%的胃蛋白酶于3545。C保温酶解l3小时，再调节pH至7.58.5，加入蜈蚣量的0.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于4050。C保温酶解36小时，即得。较优的制备方法为取蜈蚣，加水匀浆，调节pH至2.0，加入蜈蚣量的1%2%的胃蛋白酶于401:保温酶解13小时，再调节pH至8.0，加入蜈蚣量的1%2%的胰酶或胰蛋白酶于50°。保温酶解36小时，即得。发明人经过试验筛选，蜈蚣药材加水匀浆后，可预先加热至80100。C，保温1530分钟，再放冷至酶解所需温度，按以上操作酶解，其效果更强。按本发明技术方案进行酶解，当胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0时，效果较为充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。发明人所用的蜈蚣可以是蜈蚣科动物少棘蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)、多棘蜈蚣(S.mutidensNewport)、黑头蜈蚣(S.negrocapitisZhangetWang)、墨江蜈蚣(S.mojiangicaZhangetChi)、模棘蜈蛇(S.srbspinipesLeach)、哈氏蜈松(S.dehaaniBrandat)、马氏蜈虼(S.mazbiiGravely)的新鲜或干燥全体，鲜体可直接加水匀浆，干体可先粉碎成80100目粉或超微粉，再加水匀浆。按本发明的方法捧作，蜈蚣的止痉、通络、抗菌、促进免疫功能，止痛等活性大大增强，优于以往常用的蜈蚣原粉、水提液、醇提液及水提醇沉液。参考临床效果，蜈蚣现已制成各种剂型口服应用，疗效较好。经现代研究证明，蜈蚣中的肽类成分是有效部位。人体经口服蜈蚣后，经胃蛋白酶及胰酶或胰蛋白酶的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收而发挥疗效。发明人根据人体口服蜈蚣等动物药的过程，创造性的在体外采用人体仿生酶解的方法，先后对原料进行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解，和人体直接口服药材原粉比较，所得被小肠吸收消化的有效物质群相同，但体外酶解选择较优的试验条件，酶解的更充分，进一步口服所得的药效更强，注射或粘膜、皮肤等途径应酶解成寡肽或小分子的活性部位群应用更有效。经过试验筛选，单独以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、-碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解蜈蚣，效果均优于原粉直接口服，但都低于本发明的仿生酶解方法，本发明方法在很大程度上增强了蜈蚣等动物药的疗效，而且由于以小分子寡肽的形式入药，口服、非口服及鼻腔粘膜等途径给药应用时可透膜吸收，发挥疗效迅速，增强疗效；而且由于没有引入异蛋白，减小了注射等剂型的毒副作用，值得推广应用。本领域技术人员可以方便地将本发明酶解产物配合适当的辅料，制备成各种常规制剂，如a、将酶解液直接喷雾干燥，加入适量的常规辅料如淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等制成胶囊剂或片剂。b、将酶解液加热至85'C杀酶后，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，可加入等渗调节剂、pH调节剂、防腐剂等制成小针或输液；也可加入甘露醇、乳糖等冻干制成冻干粉针剂。c、将酶解液滤过，滤液以超滤膜超滤，截留分子量10kD以下的溶液，或滤液直接加卡波姆、壳聚糖等常规药用辅料，制成凝胶剂或喷雾剂。本发明提供的蜈蚣酶解产物可以单独使用，也可以与其他药物成分联合使用，即在药物活性成分中，可以只有该产物，还可以是其与其他药物的混合物，达到配合治疗、辅助治疗的目的。本发明蜈虼酶解产物可以在息风止痉药物中广泛应用，可用于治疗癌症、心脑血管、肝炎、慢性肾炎、风湿性关节病、坐骨神经病，各种皮肤病瘙痒证等疾病。有益效果为进一步验证本发明产物的治疗作用，发明人进行了动物药效学实验，实验中的"仿生酶解组"即为按本发明技术方案制得的蜈蚣酶解产物-一、对大鼠凝血时间及静脉血栓形成的影响1材料1.1动物Wister大鼠50只，雌雄各半，体重200士20g。购自北京大学实验动物科学部。1.2药品未酶解组取蜈蚣药材细粉(80目)40g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取l/4量，微孔滤膜(0.45^)滤过，即得；胃蛋白酶酶解组取l/4匀浆液，加入1%胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40。C士2'C,保温同时搅拌酶解4h，85。C保温20tnin，放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胰蛋白酶酶解组取l/4匀浆液，加入1%胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为5(TC士2。C，保温同时搅拌酶解4h，85'C保温20min,放冷，微孔滤膜(0.45jim)滤过，即得；仿生酶解组取l/4匀浆液，加入1%胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为4(TC土2。C,保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入1%胰蛋白酶，温度为5(TC士2'C,保温同时搅拌酶5解4h，85。C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45nm)滤过，即得；空白对照组即生理盐水组。1.3试剂胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20070914;胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071228;胰酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071130;牛纤维蛋白原，供凝血酶效价测定用，购自中检所，批号140626_200608;凝血酶，购自珠海经济开发区生物化学制药厂，批号20071101。2方法与结果2.1试验方法取Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重200士20g，随机分为5组，每组IO只未酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组、仿生酶解样品组、空白对照组，灌胃给药每天l次，给药剂量分别为10ml/kg，空白对照组灌胃给予同体积生理盐水，连续7天。末次给药后lh，各组动物腹腔注射3.5%戊巴比妥钠麻醉，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下穿一丝线结扎下腔静脉管，造成淤血，关闭腹腔。6h后，用内径为lmm的玻璃毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细管血柱达5mm，每隔30s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝，计算毛细管采血到出现血凝丝时间，即为凝血时间。再次打开腹腔，于结扎下方2cm处夹闭血管，纵行剖开，取出血栓，记录血栓有无并称重。2.2试验结果结果见下表。表l对大鼠凝血时间及静脉血栓形成的影响(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>与空白对照组比较(t检验)，卞〈0.05，**p〈o.oi，nxo.ooi。试验结果表明仿生酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组均可明显延长凝血时间，且仿生酶解样品组优于其余两组，与空白对照组比较具有显著性差异，较未酶解样品组效果好。二、止痛作用1材料1.1动物昆明种小鼠,雌雄各半，体重(20士2)g,购自北京大学实验动物科学部。1.2药品未酶解样品组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组供试品溶液的制备方法同上；空白对照组即生理盐水组。1.3试剂胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20070914;胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071228;胰酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071130;消炎痛，河北国金药业有限责任公司，批号20070405;冰醋酸，北京巴特尼化工有限公司。2方法与结果2.1试验方法镇痛作用取健康小鼠72只，体重(20土2)g,雌雄各半，随机分6组。未酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组、仿生酶解样品组、空白对照组，灌胃l次/d，70mg/kg，消炎痛组20mg/kg，正常饮食。各组灌胃给药2d，末次给药lh后，腹腔注射1%冰醋酸0.lml/10g,观察给药15min内小鼠扭体次数，计算镇痛率。数据以又±s表示，各组间均数比较采用t检验。对照组扭体次数一给药组扭体次数镇痛率=-------------:-------------------------X100%对照组扭体次数2.2试验结果表2蜈蚣酶解提取物胶囊对冰醋酸引起小鼠扭体反映的影响(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与对照组比较，***P〈0.001;n=12试验结果表明仿生酶解组对冰醋酸引起的小鼠腹腔疼痛有明显的镇痛作用(P〈0.001)，与对照组比较，蜈蚣仿生酶解组的镇痛率为93.9%;阳性对照组消炎痛的镇痛率为91.0%。此实验结果表明蜈蚣仿生酵解物的镇痛效果与消炎痛相似(P〈0.05)。三、抗戊四氮惊厥作用1材料1.1动物昆明种小白鼠,体重2022g，雌雄各半，动物购自沈阳医学院实验动物中心,动物合格证号辽实动质字2000。1.2药品未酶解样品组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组供试品溶液的制备方法同上；空白对照组即生理盐水组。1.3试剂胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20070914;胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071228;胰酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071130;戊四氮注射液(上海新亚制药厂)；注射用生理盐水规格250ml，批号02110504,沈阳志鹰制药厂生产。2方法与结果2.1试验方法选取活泼无受孕的小白鼠50只，雌雄均可，体重1822g。随机分成5组，每组10只，分别ip未酶解组供试品、胃蛋白酶酶解组供试品、胰蛋白酶酶解组供试品、仿生酶解组供试品和生理盐水(N.S)O.25ml/10g,15min后ip0.5°/。戊四氮0.2ml/10g,观察惊厥发生的时间及生存时间，采用t检验法统计处理。2.2试验结果结果见表3:表3对小鼠抗惊厥作用的影响(X士S，n=10)组别平均惊厥发生时间(min)平均生存时间(min)空白对照组1.07±0.2111.04±4.71未酶解组1.37±0.3212.53±5.30胃蛋白酶酶解组1.50±0.3412.90±5.43胰蛋白酶酶解组1.89±0.42*13.96±6.22*仿生酶解组2.68±0.85**18.76±6.53**注与空白对照组比较，*P<0.05，林P〈0.01。试验结果表明仿生酶解组的抗惊厥效果明显优于其他组，且平均生存时间明显延长，与未酶解组比较仿生酶解组明显增强了小鼠的抗惊厥作用。四、对荷瘤小鼠的影响1材料1.1动物Sw。肿瘤腹水传代小鼠，购自吉林省肿瘤研究所；昆明种小鼠，SPF级，安徽省实验动物中心提供。1.2药品仿生酶解样品组、未酶解样品组的制备方法同上；环磷酰胺组取环磷酰胺2g，以水混悬至100ml。81.3试剂胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20070914;胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071228;胰酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号F20071130;注射用生理盐水规格250ml，批号02110504，沈阳志鹰制药厂生产。2方法与结果2.1试验方法取昆明种小鼠，随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组、环磷酰胺组、仿生酶解样品组、未酶解样品组。选取移植肿瘤7天，肿瘤生长良好，腹部膨隆明显的腹水传代小鼠，腹部皮肤消毒，用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水放入无菌烧杯中以生理盐水稀释成1:3的癌细胞混悬液，于各组每只试验昆明种小鼠的右腋下接种0.2ml。各组小鼠于接种肿瘤次日开始每天灌胃给予相应供试品0.25ml/10g，空白对照组灌胃给予等体积生理盐水，连续给药30天。给药结束次日，将各组试验小鼠称重后处死，剥离出皮下肿块称重，比较各组肿瘤生长情况。2.2试验结果具体实验结果见下表。表4对小鼠(接种S则)肿瘤生长的影响(又士S，n=10)组别剂量(ml/10g)动物体重(g)肿瘤重(g)抑瘤率(%)给药前给药后对照组一20.4±1.2924.8±1.651.69±0.72_环磷酰胺组0.2520.2±1.4122.6±1.470.72±0.51**57.4仿生酶解组0.2519.3±1.2625.4±1.720.73±0.89**56.8未酶解组0.2520.7±1.3124.6±1.521.28±0.73*24.3注与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。试验结果表明仿生酶解样品组具有明显的抗肿瘤作用，对Sw。小鼠移植性肿瘤的抑瘤率较高；而未酶解样品组与对照组相比仍具有一定的显著性差异(P<0.05)，可见本发明制得的仿生酶解样品具有明显的抗肿瘤作用。具体实施例方式下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明实施例l取蜈蚣500g，加10倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入蜈蚣量的1%的胃蛋白酶于40"保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入蜈蚣量的1^的胰酶或胰蛋白酶于5(TC保温酶解4小时，喷雾干燥，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊。实施例29取蜈蚣500g，力口8倍量水匀浆，调节pH至2.6,加入蜈蚣量的2M的胃蛋白酶于37'C保温酶解3小时，调节pH至7.5，加入蜈蚣量的2X的胰酶或胰蛋白酶于4(TC保温酶解6小时，喷雾干燥，加入适量的微晶纤维素，制粒，干燥，整粒，压制成片。实施例3取蜈蚣500g，加15倍量水匀浆，调节pH至3.0，加入蜈蚣量的5X的胃蛋白酶于40'C保温酶解2小时，调节pH至8.5，加入蜈蚣量的5X的胰酶或胰蛋白酶于45'C保温酶解5小时，加热至85。C保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成注射液。实施例4取蜈蚣500g，加15倍量水匀浆，调节pH至1.5,加入蜈蚣量的0.5%的胃蛋白酶于40匸保温酶解1小时，调节pH至8.0，加入蜈蚣量的1.5^的胰酶或胰蛋白酶于5(TC保温酶解3小时，加热至95'C保温30分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，加入甘露醇，冷冻干燥，制成冻干粉针剂。实施例5取蜈蚣250g、全蝎250g，加15倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入蜈蚣量的l%的胃蛋白酶于4(TC保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入蜈蚣量的1%的胰酶或胰蛋白酶于50°0保温酶解4小时，加热至85'C保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量10kD以下的溶液，加卡波姆，润胀12小时，混匀，制成凝胶剂。实施例6取实施例2所制片剂治疗慢性乙型肝炎患者60例，其中男38例，女22例；年龄1860岁，平均36.5岁，患者HBeAg、HBVDNA均为阳性，ALT异常60例150400u/L,TBIL异常32例(3670uml/L)，以乏力(25例)、纳差(29例)、肝区不适(46例)、尿黄(27例)为主要症状。治疗方案每次2片，每天3次，连续进行9周。疗效判断标准显效为临床症状消失，体征改善，肝功能恢复正常，HBeAg及HBVDNA转阴；有效为症状及体征改善，肝功能接近正常；无效为临床症状无明显改变。结果疗程结束后，显效19例，有效30例，无效11例，总有效率81.7%。10权利要求1、一种蜈蚣的仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的取蜈蚣，加水匀浆，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即得。2、根据权利要求1所述的蜈蚣酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的取蜈蚣，加水匀浆，调节pH至1.03.0，加入蜈蚣量的0.5%5%的胃蛋白酶于3545'C保温酶解13小时，再调节pH至7.58.5，加入蜈蚣量的0.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于405(TC保温酶解36小时，即得。3、根据权利要求2所述的蜈蚣酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的取蜈蚣，加水匀浆，调节pH至2.0,加入蜈蚣量的1%2%的胃蛋白酶于40。C保温酶解13小时，再调节pH至8.0，加入蜈蚣量的1%2%的胰酶或胰蛋白酶于50°〇保温酶解36小时，即得。4、根据权利要求1至3中任一所述的蜈蚣酶解产物，其特征在于将蜈蚣加水匀桨后先加热至8010(TC并保温1530分钟后，再放冷至所需温度进行酶解。5、根据权利要求1至3中任一所述的蜈蚣酶解产物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0。6、权利要求1至5中任一所述的蜈蚣酶解产物的制备方法。7、权利要求1至5中任一所述的蜈蚣酶解产物在制备用于息风止痉的药物中的应用。8、权利要求1至5中任一所述的蜈蚣酶解产物在制备用于治疗心脑血管疾病的药物中的应用。9、权利要求1至5中任一所述的蜈蚣酶解产物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。10、权利要求1至5中任一所述的蜈蚣酶解产物在制备用于治疗肝炎的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种蜈蚣的酶解产物及其用途，属中药领域。其技术方案是采用仿生酶解的方法，取蜈蚣，加水匀浆后，在适当的条件下，先以胃蛋白酶保温酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解，所得的酶解物按不同的制剂要求制成制剂。本发明产物在治疗癌症、心脑血管病、肝炎、慢性肾炎、风湿性关节病、坐骨神经病及各种皮肤病瘙痒证方面具有良好效果。文档编号A61K35/64GK101647823SQ20081011815公开日2010年2月17日申请日期2008年8月13日优先权日2008年8月13日发明者张加余,李钦青申请人:北京凯瑞创新医药科技有限公司