专利名称：：一种从茶叶新鲜或干叶中提取纯化egcg的方法
技术领域：
：本发明涉及从植物中分离纯化功能性成分的一种方法，具体是从茶叶的新鲜或干燥叶中提取纯化(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯。
背景技术：
：茶叶的基源为山茶科山茶属植物茶[Camdliasinensis(L.)O.Ktze]的叶。茶叶含有多种化学成分，类型涉及茶多酚类、生物碱类、茶氨基酸类、脂肪类、酶类、核苷酸类、糖类、矿物质元素、挥发性物质(《中华本草》，1999)。茶多酚约占茶叶干重的25%,主要由儿茶素、黄酮(黄酮醇)、花色素和酚酸(縮酚酸)四大类化合物组成。其中儿茶素类是茶多酚的主体组分，约占茶多酚总量的80%左右(茶叶生物化学(第二版)，1998)。茶多酚具有较强的抗氧化作用(赵保路，2002)和广泛的药理功效(刘学铭，1998),特别是其中的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，结构见图l)以其独特的分子结构而在抗氧化、抗突变、抗肿瘤等方面占有重要的地位(陈宗懋，2003)，但由于茶叶中多酚主要由水溶性的縮合鞣质组成，它们化学性质不稳定，分子结构之间差别往往仅是碳构型的差别，分离工作十分困难(史国放，2001)。目前，在分离茶多酚单体-(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的过程中,用葡聚糖凝胶柱层析，常需结合其他方法如重结晶法、逆流分配法、高压液相制备法等才可得到单体(李秉正，1992;周宏志等，2000)。因为在回收水时需较高温度，为使茶多酚不被氧化,通常需要采用冻干回收,所以用该法制备大量单体不经济,而且周期长,生产效率低。采用高压液相法也常因需结合其他方法，成本高,回收困难,不适合工业化生产。高速逆流色谱法可很好地将儿茶素单体分开,但目前只能得到少量儿茶素单体,如果进行工业化生产，还要进一步改进分离技术,而且其设备投资也十分大(戴军，1999;杜琪珍等，1997)。综上所述，在利用植物资源分离纯化(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的过程中，主要的影响因素在于分离过程中普遍存在(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的分离效率低下、回收过程漫长，使得成本升高。因此，有必要寻找一种简便安全经济高效地提取纯化(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的方法。本发明旨在建立一种通过多种现代分离纯化技术相结合的方法，实现简单快速、损失少的分离纯化(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯。
发明内容本发明的目的在于提供一种以茶叶新鲜或者干燥叶为原料，通过采用索氏提取器萃取技术、重结晶技术、硅胶正相分配层析技术以及低温重结晶技术相结合，从而大量、快速获得高纯度(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的工艺方法。本发明的目的是通过以下方案来达到的以茶叶干燥叶为原料，采用索氏提取器萃取技术、重结晶技术、硅胶正相分配层析技术以及低温重结晶技术相结合，得到纯度均达到99%以上的(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯。上述的(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯提取纯化方法，其特征在于，取一定量的干燥茶叶，索氏提取器萃取去杂所用的溶剂为氯仿，体积为固体质量的l倍，连续萃取48h。索氏提取器萃取所用的溶剂为乙酸乙酯，体积为固体质量的l倍，连续萃取48h。浓縮索氏提取器回流萃取的乙酸乙酯到原体积的一半，加3-5倍量氯仿，有(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯粗品析出。所用硅胶为100-150目大孔硅胶，该方法中硅胶正相分配层析步骤采用上含水乙醚硅胶分配柱，保留液面，将索氏提取器回流萃取(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的粗品溶含水乙醚，上样量硅胶质量的1/10-1/20，以流速为每小时68BV，每份1/41/2BV。用高压液相检测洗脱液成分，合并相同部分馏份，HPLC法分析条件色谱柱,ODS柱(4.0x150mm,5um);检测波长280nm;柱温箱40°C;流动相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。馏份再经少量无水硫酸钠干燥过夜，45'C以下回收，得(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯粗品。重结晶所用的溶剂除乙醚外，还包括二氯甲垸、氯仿、石油醚，低温析晶温度为-10。C4。C。提取率为1.0%，纯度为99.0%。实施例2称取新鲜茶叶10kg(干重为2kg)，干燥后用1倍体积氯仿在索氏提取器中连续萃取48h，再用200mL乙酸乙酯回流48h，过滤乙酸乙酯溶液，用无水硫酸钠干燥过夜，浓縮乙酸乙酯到原体积的一半，'加3-5倍量干燥氯仿有白色沉淀析出,用滤纸过滤，用少量千燥氯仿冲洗，干燥得EGCG粗品(约150g)。100g(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯粗品溶于2000mL含水乙醚，上2000g含水乙醚硅胶分配柱(内径20cm，高150cm)，流速每小时IOL，500mL—个馏份，合并前2.5L馏份。馏份经少量无水硫酸钠干燥过夜，45"以下回收得样品再溶于含水乙醚，上2000g含水乙醚硅胶分配柱(内径20cm,高150cm)，流速每小时IOL，500mL—个馏份，合并前2.5L馏份。馏份再经少量无水硫酸钠干燥过夜，45'C以下回收，得若干瓶白色粉末状物质，共约10g。每个馏份用高压液相检测，合并相同部分。HPLC法分析条件取其1mg溶于1mL蒸馏水，过微孔滤膜(0.45Pm)，超声溶解，进样量20uL;日本岛津色谱柱,ODS柱(4.0x150mm,5ym);检测波长280nm;柱温箱40。C;流动相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。白色粉末状物质在乙醚中在4'C结晶，获得(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯单体析出。提取率为0.985%，纯度为98.5%。本试验中所用到的标准品购自Sigma公司。结果定量检测分析采用下表条件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>图1是(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯分子式图。权利要求1.一种从茶叶中提取纯化(-)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)的方法，其主要特征在于茶叶经采用索氏提取器萃取技术、重结晶技术、硅胶正相分配层析技术以及低温重结晶技术相结合，得(-)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸纯度大于99％的纯品。2.按照权利要求1所述的茶叶，其特征在于茶叶主要来源于各品种茶叶植株的新鲜或者干燥叶。3.按照权利要求l所述的索氏提取器萃取技术，其特征在于索氏提取器萃取去杂所用的溶剂为氯仿，体积为固体质量的l倍，连续萃取48h。采用索氏提取器氯仿回流萃取时，可以高效去除叶绿素等脂溶性杂质，同时节省溶剂。索氏提取器萃取所用的溶剂为乙酸乙酯，体积为固体质量的1倍，连续回流萃取48h。采用索氏提取器乙酸乙酯回流萃取时，可以高效萃取(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯等茶多酚，同时节省溶剂。4.按照权利要求l所述的重结晶技术，其特征在于浓縮索氏提取器回流萃取的乙酸乙酯到原体积的一半，加3-5倍量氯仿，有(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯粗品析出。5.按照权利要求1所述的硅胶正相分配层析技术，其特征在于所用硅胶为100-150目大孔硅胶，该方法中硅胶正相分配层析步骤采用上含水乙醚硅胶正相分配柱，保留液面，将索氏提取器回流萃取(-)表没食子儿茶素-3-0-没食子酸酯的粗品溶含水乙醚，上样量为硅胶质量的1/10-1/20，以流速为每小时68BV，每份1/41/2BV。用高压液相检测洗脱液成分，合并相同部分馏份，HPLC法分析条件色谱柱，ODS柱(4.0x150mm，5um);检测波长280nm;柱温箱40°C;流动相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。馏份再经少量无水硫酸钠干燥过夜，45。C以下回收，得(-)表没食子儿条素-3-0-没食子酸酯粗品。6.按照权利要求1所述的低温析晶和重结晶技术，其特征在于重结晶所用的溶剂除乙醚外，还包括二氯甲垸、四氯甲烷、氯仿、石油醚，低温析晶温度为-10"C4'C。全文摘要本发明涉及一种中草药功能性成分的提取纯化方法，目的是要提供一种简便安全经济高效地从茶叶中提取纯化得到单体化合物(-)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)的方法，所采取的技术方案是以茶叶干燥叶为原料，采用索氏提取器萃取技术、重结晶技术、硅胶正相分配层析技术以及低温重结晶技术相结合，得到纯度均达到99％以上的(-)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，其提取率为1％以上。本发明所用原料为在农业生产中大都被废弃的新鲜或者干燥茶叶，既不破坏植物生态平衡、不影响农业生产，又能得到高纯度的茶叶功能性成分。而且该方法经提取、初步除杂及再纯化，简单易行，目标化合物损失少。适用于工业应用，对产业化生产具有重要意义。文档编号A61K36/185GK101391990SQ20081013707公开日2009年3月25日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者付玉杰,姜守刚,宇张,张宝友,李庆勇,琢汪,祖元刚,马瑞萍申请人:东北林业大学;祖元刚