专利名称：含有高丽人参的用于使HIV-1具有5’LTR/gag基因缺陷的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有作为有效成分的高丽人参的用于使HIV-1具有 5'LTR和域gag基因缺陷的药物组合物。
背景技术：
HIV-1 (人体免疫缺陷病毒-l)是获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency Syndrome;以下简称为"AIDS")的病因。HIV-1与HIV-2 同属于逆转录病毒科(retroviridae)的慢病毒亚科(lentivirinae),感染性病 毒体具有由两条相同的单链形成的RNA ( + )染色体。fflV-l感染细胞时， 通过上述RNA ( + )编码的逆转录酶，RNA转换为双链DNA，该DNA插 入到宿主细胞的染色体中，形成前病毒。在前病毒状态下，病毒是通过转录 病毒基因生产在复制和装配中所必需的蛋白质的mRNA而增殖的。
HIV-1基因组(9.2kb)由gag、 pol、 env的结构基因(structural gene) 禾口tat、 rev、 nef、 vif、 vpu、 vpr等的附加基因(accessorygene)以及两端的 长末端重复序列(long terminal repeat sequence (LTRs))构成(参照图8)。 gag和pol蛋白质分解形成前驱体蛋白质，env蛋白质变成gpl60前体蛋白 (precursor protein),在装配过程中分解成gpl20和gp41。最初感染HIV时 没有症状，或者表现为象感冒的症状，病毒在CD4T细胞、巨噬细胞、小胶 质细胞等中潜伏感染(latent infection),长期处于潜伏状态。对gpl20的抗 体在感染后第3-20周出现，此后可以诊断有无感染。经过2-10年的潜伏期， 免疫体系中诱导出变化，在出现免疫缺陷症状之前，表现为前驱期症状(艾 滋病相关综合症(ARC)—疲劳、发烧、体重减少、腹泻)。由于HIV感染 使得CD4T细胞的数量降低至200/ul以下，此时表现出免疫缺陷的症状，从而在临床上定义为AIDS。
高卵人参(Panax ginseng C. A. Meyer (Panax schinseng Nees))属五力卩 科(Araliaceae)人参属的多年生宿根草本植物，数千年来在东亚各国用于各 种疾病的辅助治疗。至今为止许多药理实验表明高丽人参具有如下活性降 低胆固醇、抗脂质过氧化、降低血压、增加血流、扩张脑血管、增进心功能、 抗脉律不齐、抗血栓、慢性肾功能衰竭治疗效果、免疫调节作用、增强记忆 力、增进脑代谢、抗压力、抗氧化作用、抗衰老作用、抗溃疡和抑制胃液分 泌、抗糖尿病、解毒、增加肝细胞酶、治疗哮喘、抗炎症、镇痛作用、治疗 贫血、增进生殖能力、降低血醇浓度、抗过敏、抗癌等。
此外，高丽人参以及红参(RedGinseng)是根据加工方法来区分的，所 谓的高丽人参在没有经过加工的情况下，将干燥后的高丽人参称为干参，将 未干燥的高丽人参称为水参。红参是通过将高丽人参蒸制并干燥，使得水分 含量为14%以下，在制备过程中促进茶色化反应，形成显示为深茶褐色的颜 色的硬质的形态，并保持为圆形的高丽人参。因此，高丽人参在含有75%左 右的水分的水参的状态下，难以长期保存，在流通状态中由于微生物污染引 起腐败、或高丽人参自身含有的各种酶使得高丽人参成分发生分解；而红参 具有通过加工干燥后水分减少，可以防止细菌、发霉以及微生物的污染，且 体积和重量减少，容易保存、运送的优点。由于作为高丽人参的代表性的有 效成分的皂苷的定量方法和质量管理的发展，从而可以在加工过程中最大限 度地抑制皂苷的分解。除了皂苷之外，还能进一步生成麦芽醇、人参皂苷 Rh2等的有效成分。g卩，高丽人参的主要成分为皂苷，红参是加工后未改变 功效的高丽人参。
红参尤其对于中枢神经具有镇静作用和兴奋作用，作用于循环系统具有 预防高血压和动脉硬化的效果，另外，能使造血作用和血糖值降低，保护肝， 作用于内分泌系统间接地对性功能和生殖功能有效，具有抗炎以及抗肿瘤作用，有防御放射线的效果、起保护及柔滑皮肤的作用。此外，在红参的效果
中重要的是作为适应素(adaptogen)效果来增加对于来自周围环境的各种有 害作用的溢泪病、各种压力等的防御能力，使得身体更容易地适应的效果。 目前为止，对红参的成分以及药理功效，韩国国内外已经有了很多研究，尤 其是报道了红参具有抗氧化活性(，* > 3 > 7 >《t'、高麗人参学会 誌,24(1)，29國34，2000)。
此外，本发明人之前已经研究了对HIV-1感染患者进行单独的高丽人参 (KRG， Korean red ginseng)治疗(参见参考文献1-4)、 1991年以后的并用 高丽人参与叠氮胸苷(ZDV,zidovudine)的治疗(参见参考文献5)、以及1997 年以后的并用高丽人参与非常强的高效抗逆转录病毒药物的治疗(HAART， highly active antiretroviral drug therapy)(参见参考文献6)。经过临床学应用 期间(参见参考文献l-7)， KRG治疗与获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的 进展速度(progression rate)之间表现出显著的逆向相关关系(参见参考文 献8)。 HIV-1基因的变异率与KRG治疗存在相反关系。而且，KRG治疗能 延缓对叠氮胸苷的抗药性的发展。根据本发明人的研究结果，KRG治疗与 治疗法或患者等的其它的特性无关，可以减缓CD4 T细胞的减少。分析了 KRG与HARRT的组合治疗后发现，没有发生耐药突变，通过该组合治疗能 够进行一贯的病毒调节(参见参考文献7)。
本发明人的研究团体(cohorts)在此说明从长期间疾病未恶化的人 (long-term nonprogressor; LTNPs)或者长期生存者(long-term surviviors; LTSs)可见的获得性免疫缺陷综合症的缓慢进展的原因。最近，本发明人对 持续接受KRG治疗的10个LTS的nef基因的大规模缺陷的比例与KRG摄 取时间之间的关联性作了报道(参见参考文献9)。比较这10个长期生存者 的nef基因中扩增的生成物，结果在gag区域和5'LTR区域扩增的生成物中， 前病毒全长的碱基序列以高比例表现出两个带(band)(野生型以及未縮短的带(band))。
对于LTNP中(参见参考文献10-18)的nef基因大规模缺陷已经进行了 许多研究，但是，至今为止仅在几种场合报道了在gag区域和5，LTR区域中 大规模缺陷的相关性。更具体地说，已经报道了在感染了 HIV亚型C的一 个LTS的gag基因中的三个氨基酸密码子中的一个的缺陷(参见参考文献 19)。在其它的研究中，24个没有治疗经历的人中的两个在5，LTR中表现为 16bp的缺陷和9bp的小缺陷(参见参考文献20)。但是，没有关于维持长期 间未恶化的状态或fflV感染的缓慢进展与5'LTR和gag区域的基因缺陷之 间的可能的联系的报道。
参考文献
1. Cho YK， Kim YK， Lee I, Choi MH， and Shin YO: The effect of Korean red ginseng (KRG)， zidovudine (ZDV)， and the combination of KRG and ZDV on HIV-infected patients. J Korean Soc Microbiol 1996; 31:353-360.
2. Cho YK, Lee HJ, Kim YB, Oh WI, and Kim YK: Sequence analysis of C2/V3 region of human immunodeficiency virus type 1 gpl20.ancj its correlation with clinical significance; the effect of long-term intake of 'KRG on ewv gene variation. J Korean Soc Microbiol 1997; 32:611-623.
3. Cho YK， Lee HJ, and Desrosiers RC: Complete sequences of HIV-1 in a Korean longterm nonprogressor with HIV画l infection. J Korean Soc Microbiol 1999; 29:107-118.
4. Cho YK， Sung H, Kim TK, Lim J, Jung YS, and Kang SM: KRG significantly slows CD4 T cell depletion over. 10 years in HTV國l infected patients: association with HLA. J Ginseng Res 2004; 28:173-182.
5. Cho YK, Sung H, Ahn SH， Bae Woo JH， Won YH， et al.: High frequency of mutations conferring resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors in human immunodeficiency virus type-1 infected patients in Korea. J Clin Microbiol 2002;40:1319-1325.6. Cho YK, Sung H, Lee HJ， Joo CH, and Cho GJ: Long-term intake of KRG in HIV-1-infected patients: development of resistance mutation to zidovudine is delayed. Int Immunopharmacol 2001; 1:1295-1305.
7. Sung H， Jung YS， Kang MW, Bae Chang HH, Chang MS， et al.: High frequency of drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1-infected Korean patients treated with HAART. (In press), AIDS Res Hum Rstrovirus6s.
8. Sung H, Kang SM， Lee MS， Kim and Cho YK: KRG slows depletion of CD4 T cells in human immunodeficiency virus type 1-infected patients. Clin Diagn Lab Immunol 2005j 12:497-501.
9. Cho YK， Lim JY, Jung YS， Oh SK, Lee HJ， and Sung H: High frequency of grossly deleted we/ genes in HIV-1 infected longterm survivor streated with Korean red ginseng. Curr HIV Res 200《4:457-467.
10. Kirchhoff F, Greenough TC， Brettler DB, Sullivan JL, and Desrosiers RC: Brief report: absence of intact we/ sequences in a long-term survivor with ■progressive HIV-1 infection. N Engl J Med 1995; 332:228-232.
11. Deacon NJ， Tsykin A， Solomon A, Smith K， Ludford画Menting M, Hooker I)J， et al.: Genomic structure of an attenuated quasi species of HIV國l from a blood transfbsion donor and recipients. Science 1995; 270:988-991.
12. Mariani R， Kirchhoff F, Greenough TC， Sullivan JL, Desrosiers RC， and Skowronski J: High frequency of defective we/ alleles in a long-term survivor with nonprogressive human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol 1996; 70:7752-7764.
13. Salvi R， Garbuglia AR, Di Caro A， Pulciani S， Montella F, and Benedetto A: Grossly defective we/ gene sequences in a human immunodeficiency virus type 1-seropositive long-term nonprogressor. J Virol 1998;72:3646-3657.
14. Brambilla A, Turchetto L， Gatti A， Bovolenta C， Veglia F, SantagostinoE， et al.: Defective w< alleles in a cohort of hemophiliacs with progressing and nonprogressing fflV誦l infection. Virology 1999; 259:349-368.
15. Rhodes DI， Ashton L, Solomon A， Carr A， Cooper D, Kaldor J， et al.: Characterization of three w^"defective human immunodeficiency virus type 1 strains associated with long-term nonprogression. Australian Long-Term Nonprogressor Study Group. J Virol 2000: 74:10581-10588.
16. Foster JL， Molina RP, Luo T, Arora VK, Huang Y， Ho OD, et al.: Genetic and fiinctional diversity of human immunodeficiency virus type 1 subtype B Nef primary isolates. J Virol 2001; 75:1672-1680.
17. Casartelli N， Di Matteo Q Argentini C， Cancrini C, Bemardi S, Castelli Q et al.: Structural defects and variations in the HIV誦l w<gene from rapid, slow and nonprogressor children. AIDS 2003; 17:1291-301.
18. Rodes B, Toro C， Paxinos E, Poveda E， Martinez-Padial M， Benito JM， et al.: Differences in disease progression in a cohort of long-term non-progressors after more than 16 years of HIV-1 infection. AIDS 2004; 18:1109-1115.
19. McCo腿ck GP, Glynn JR， Clewley JP， Crampin AC， Travers SA， Redmond N， et al.: Emergence of a three codon deletion in gag pl7 in HIV type 1 subtype C long-term survivors, and general population spread. AIDS Res Hum Retroviruses 2006; 22:195-201.
20. Copeland KF， Chen Z， Fiebig M, Ni L， Savoy S， Smaill FM, et al.: Identification of mutations in proviral long terminal repeats of HIV type 1-infected subjects naive to drug therapy. AIDS Res Hum Retroviruses 2004; 20:1019-1021.
21. Cho YK, Foley BT， Sung H, Kim YB, and Kim JH: Molecular epidemiologic study of an HIV國l outbreak in hemophiliacs B infected through clotting factor 9 after 1990. Vox Sanguinis. 2007; 42:113-120，
22. Alexander L, ^Veiskopf E， Greenough TC, Gaddis NC, Auerbach MR, Malim M H， et al,: Unusual polymorphisms in human immunodeficiency virustype 1 associated with nonprogressive infection. J Virol 2000; 74:4361-4376.
23. Zhang L， Huang Y， Yuan H, Chen BK, Ip J， and Ho DD: Genotypic and phenotypic characterization of long terminal repeat sequences from long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol 1997;71:5608-5613.
24. Huang Y， Zhang L， and Ho DD: Characterization of g g and po/ sequences from longterm survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. Virology 1998;240:36-49.
25. Calugi Q Montella F， Favalli C， and Benedetto A: Entire genome of a strain of human immunodeficiency virus type 1 with a deletion of that was recovered 20 years after primary infection: large pool of pro viruses with deletions of e"v. J Virol. 2006;80:11892-11896.
26. Blankson JN， Bailey JR， Thayil S,'Yang HC, Lassen K， Lai J， et al.: Isolation and characterization of replication-competent human immunodeficiency virus type 1 from a subset of elite suppressors. J Virol. 2007; 81:2508-18.
27. Jones KA， Kadonaga JT, Luciw PA， and Tjian R: Activation of the AIDS retrovirus promoter by the cellular transcription factor, Spl. Science. 1986; 232:755-59.
28. Keum YS， Han SS, Chun KS, Park KK， Park JH， Lee SK, et al.: Inhibitory effects of the ginsenoside Rg3 on phorbol ester-induced cyclooxygenase-2 expression, NF-kappaB activation and tumor promotion. Mutation Res. 2003;523-524:75-85.
29. Kim K H， Lee YS， Jung IS， Park SY, Chung HY, Lee IR, and Yun YS. Acidic polysaccharide from Panax ginseng, ginsan, induces Thl cell and macrophage cytokines and generates LAK cells in synergy with rIL-2. Planta Med. 1998;64:110-115.
30. Han SK， Song JY, Yun YS， Yi SY. Ginsan improved Thl immune response inhibited by gamma radiation. Arch Pharm Res. 2005;28:343-50.31. Larsen MW， Moser C， Hoiby N， Song Z， Kharazmi A. Ginseng modulates the immune response by induction of interleukin-12 production. APMIS. 2004; 112:369-73.
32. Lee EJ, Ko E, Lee J， Rho S， Ko S, Shin MK, et al. Ginsenoside Rgl enhances CD4(+) T cell activities and modulates Thl/Th2 differentiation. Int Immunopharmacol, 2004;4:235-44.
发明内容
本发明人在研究AE)S的治疗方法时，通过对感染有HIV-1的患者长期 给予红参以确认HIV-1中的5，LTR和gag基因的缺陷，从而完成本发明。
本发明的目的是提供一种含有作为有效成分的高丽人参的用于使HIV-1 具有5'LTR和/或gag基因缺陷的药物组合物。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种含有作为有效成分的高丽人 参的用于使HIV-1具有5'LTR和/或gag基因缺陷的药物组合物。
下面详细说明本发明。
本发明特征在于查明了高丽人参的摄取能使得与病毒成长和AIDS病因 有密切联系的fflV-l中的5，LTRygag基因产生缺陷。
优选情况下，本发明的特征在于所述高丽人参为红参。 在本发明的一个实施例中，为了确定在5'LTR和gag区域的大规模缺陷 (gA)的发生与KRG摄取之间是否存在关联性，本发明人从用KRG (总 共13,364士5，364g)治疗12年以上的10个长期生存者(long-term surviviors; LTSs)和未摄取或少量摄取高丽人参(总共1，436土l，027g)的8个长期生 存者(对照组)中检査了围绕该5，LTR和gag区域的1,125个碱基序列。上 述10个LTS中，在80个外周血单核细胞(PBMC)样品中获得189个PCR 产物，总共80个PBMC中的44个(55%)与189个PCR产物中的71个(37.6 %)表现出大规模缺陷(gA )。在10个LTS中发现55%的PBMC与37.6X的PCR产物，但是，8个对照组LTS的值分别为30.3%和14.8%。这样 的差异具有统计学意义(P<0.05，且P可以为0)。此外，未服用红参的28 个一般对照组患者的缺陷基因比例以PBMC和PCR产物为基准分别为13.3 %和8.3% (参考实施例3，图1至图3)。
因此，通过向个体给予红参可以诱导HIV-1中的5，LTR/gag基因产生缺 陷，从而可以在AIDS的预防以及治疗中起作用。
用作本发明的药物组合物的有效成分的红参可以通过公知的方法制备。 一般情况下，红参是经过在一定的温度条件下对水参(水分约75%)进 行水蒸气蒸制的蒸煮阶段以及对蒸煮后的水参进行干燥的干燥阶段而制得 的。将这样制得的红参进行加热提取，制得红参提取液，将该红参提取液浓 縮，可以制得红参浓縮液。
另外，本发明中，上述红参提取液或浓縮液可以单独使用，也可以加入 一种以上的药学上允许的载体、赋形剂或稀释剂，按照常规的方法进行制剂 化后使用。上述"药学上允许"是指生理学上允许，是指在对人体进行给药 时， 一般不会引起肠胃障碍、头晕等的过敏反应或与此类似的反应。此外， 如上所述的制剂化的本发明的红参可以通过适当的给药途径进行给药。适当 的给药途径可以是口服给药。
优选以粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶 剂、浆剂、悬浊液等的用于口服给药的制剂的形态按照本领域公知的方法进 行制剂化。例如，口服用制剂是通过将活性成分与固体赋形剂混合后，将其 粉碎并添加适当的助剂后，加工成颗粒混合物，从而可以获得片剂或糖衣片 剂。适当的赋形剂例如可以为包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露 醇、木糖醇、赤藓糖醇以及麦芽糖醇等在内的糖类，包括玉米淀粉、小麦淀 粉、米淀粉以及土豆淀粉等在内的淀粉类，包括纤维素、甲基纤维素、羧甲 基纤维素钠以及羟丙基甲基纤维素等在内的纤维素类，包括明胶、聚乙烯吡咯垸酮等在内的填充剂。此外，根据情况也可以添加包括交联聚乙烯吡咯烷
酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠(SodiumAlginate)等在内的崩解剂。另外， 本发明的药物组合物还可以含有抗絮凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂 以及防腐剂等。此外，作为本发明的药物组合物的有效成分的红参可以商购 得到。在本发明的一个实施例中使用了韩国人参公社销售的红参粉末胶囊。
本发明的药物组合物可以用于对哺乳动物，尤其是包括人在内的动物进 行给药。优选以有效量对感染有HIV-1的患者进行给药。上述"有效量"是 指对于在体外或者生物体内使得HIV-l中的nef基因产生缺陷的有效果的量。
本发明的药物组合物的有效量需要考虑给药途径、治疗次数、治疗必要 的个体的年龄、体重、健康状况、性别、疾病的严重度、饮食以及排泄率等 多种因素，本领域技术人员可以根据特定的用途来确定适当的有效给药量。 优选情况下，本发明的含红参的药物组合物的有效量，男性为50-100毫克/ 千克/天，女性为20-70毫克/千克/天。
本发明的药物组合物可以在个体诊断后进行持续给药来延缓AIDS疾病 的发展。
另外，本发明中，上述5'LTR和/或gag基因的缺陷可以定义为具有提 前终止密码子(premature stop codon)、缺少起始密码子(initiation codon)。
在本发明的一个实施例中，从10个LTS生成的扩增产物中观察到如非 蛋氨酸起始密码子、G至A超变异(hypermutation)引起的提前终止密码子、 以及小缺陷的基因缺陷(实施例4)。在各个患者以及10个LTS内，缺陷、 重复或插入的大小不完全相同。即使在8个对照组LTS中，也观察到了提前 终止密码子、非蛋氨酸起始密码子引起的基因缺陷(图4)。
优选情况下，通过本发明的方法产生的缺陷的5'LTR和/或gag基齿可 以表示为如下的序列GenBank登录号为EF 370172， EF 370173， EF 370175， EU 047612， EF 370184， EF 370186， EF 370187， EF 370188， EF 370191，EF 370192， EF 370193， EF 370196， EF 370197， EF 370199， EF 370201， EF 370200， EF 370202， EF 370205， EF 370207， EF 370211， EF 370213， EF 3702115, EF 3702116， EF 3702118， EF 370219， EF 370221， EF 370223， EF 370224， EF 370225， EF 370226， EF 370227， EF 370228， EF 370231, EF 370235， EF 370237， EF 370239， EU 047647， EF 370245, EF 370250， EF 370251， EF 370252， EF 370253， EF 370256， EF 370259, EF 370262， EF370261, EF370265, DQ295196, EF370275, EF370276, EF370277, EF 3702778， EF 370279, EF 370282， EU 047673， EF 370283， EF 370285， EF 370286， EF 370287， EF 370288， EF 370292。
如上所述，本发明的药物组合物通过对HIV感染个体进行给药，可以 诱导HIV-1具有5'LTR和/或gag基因缺陷。因此，本发明可以用于AIDS 的预防和治疗。
图1是表示未进行抗逆转录病毒治疗、给予最小量的KRG或不给予 KRG的8个对照组LTS (图lk~r)和接受最大量的KRG给药的10个LTS (图la~j)的CD4 T细胞数的变化的图。给予红参期间利用条(bar)来表 示。三个的PCR反应伴随着一个样品的扩增，5'LTR和gag基因的序列中使 用的样品与表示5，LTR和gag基因大规模缺陷的样品分别在下部以向下箭头 和向上箭头表示。在两个组中，CD4 T细胞数在IO年后减少。由此，除了 KRG给药量，两个组之间没有显著的差别。
图2是表示从最初确诊的3个LTS得到的外周血单核细胞中的5'LTR 和gag的序列分析的图。分离通过1%琼脂糖凝胶的电泳进行扩增的产物。 来自患者87-05、 89-17、 90-05的PCR产物分别以道(lane) 1-10、 11-18、 19-31来表示。患者87-05具有4种野生型(wildtype，道1、 3、 6、 9)、与3个重复带(道2、 7、 10)和两个单条短带(道4、 8)那样的五条短带。患 者89-17表示7个短带(道ll、 12、 13、 14、 16-18)，其中，道14是一条 短带(14%)。患者90-05具有7条短带(道19、 22、 23、 24、 26、 29、 30)， 其中，道22、 24、 26、 29、 30表现为一条短带(71%)。 (M:标记，WT:野生型带(wild type band))
图3是表示比较3组大规模缺陷频率的图。表示大规模缺陷的外周血单 核细胞样品的比例，KRGLTS (55%)不仅比其它的28个患者(13.3%)高， 而且比9个对照组LTS的26.7%高。而且，对大规模缺陷阳性的PCR产物 的比例，给予了 KRG的IO个LTS (37.6%)不仅比其它的28个患者(8.3 %)显著地高，而且比8个对照组LTS的13.9%显著地高。28个患者中还 包括87-05和90-50的妻子。而且，他们的一部分即使在确诊为HIV-1之后 未超过10年，也可能成为LTS。
图4是表示感染了 HIV-1的10个LTS中代表性的部分gag蛋白质的预 想氨基酸序列的图。来自美国的非进展患者的gag蛋白质的共同氨基酸序列 显示在最上列(参见参考文献23)，而且10个LTS的预想序列如下所示。 点(dot)表示序列的相同部分，条(bar)表示除变异部分之外的部分缺陷 或大规模缺陷。另外，问号表示提前终止密码子。氨基酸序列由一个文字编 码表示。各序列的出处由各患者编码(最初两位数字表示HIV确诊年度，连 字符后的两位数字表示在韩国向各个患者分配的固有的号码)进行确认。各 自的GenBank号码对应的样品的日期如图7所示。图7中看不到在gag基因 中不含缺陷的7种碱基序列。
图5是表示感染有HIV-1的18个LTS的临床学特征的表。除了过去的 一年，LTS中的患者91-20的顺应度与90-05同样是最好的，而且他的实际 KRG服用量通过个人购买达到了 22，422g以上。患者91-22和91-23是由于 接受了 91-20提供的血液而被感染HIV-1的。除了 LTS 87-05，所有的患者为感染有HIV-1亚型B的韩国分支(subclade)。
图6是表示18个LTS以及28个非KRG给药患者的5'LTR/gag基因的 大规模缺陷的特征。
图7是表示与nef基因的大规模缺陷相比较，5'LTR/gag基因的大规模 缺陷的频率的表。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作更详细的说明。但是，以下实施例是用于对 本发明进行举例说明的例子，本发明并不受以下实施例的限定，可以进行各 种修改以及改变。
实施例1
实验对象以及KRG治疗
研究组包括摄取最大量KRG的10个长期生存者(LTSs;long-term surviviors)， 8个对照组LTS， 28个未摄取KRG的HIV感染患者。
本研究中，10个LTS已经在本发明人的以前的研究中进行了详细说明 (参见参考文献9)。上述10个LTS均在1987年至1996年3月间被确诊， 在本研究中，餘了一个患者(93-04)之外，对其他患者均未给予任何的抗 逆转录病毒治疗。该患者(93-04)在1993年4月至1997年8月间断地使 用了 ZDV (日剂量200mg或300mg)。
8个对照组LTS由本发明人的研究团体(cohorts)选择。被分到上述对 照组LTS中的患者在1996年之前被诊断为感染有HIV-1，他们在没有进行 强的抗逆转录病毒药物治疗的情况下，使用了最小剂量(1，526士l,183g)的 KRG或者完全不使用KRG (患者89-05完全未使用KRG)。唯一一个患者 91-23从1993年4月至1999年8月使用了 ZDV。患者89-05在1997年去了其它国家，因此从本发明的研究样本中删除。在8个对照组LTS中，包括接 受了长期生存者91-20输血的两个受血者(recipients,患者91-22和91-23)。 患者89-26和92-23抵制摄取KRG。患者卯-01为进行了 83次有偿提供血 浆的血浆提供者。该患者90-01被记作提供者0 (参见参考文献21)。因此， 在对10个高KRG摄取LTS和8个对照组LTS进行比较时，最基本的特征 (baseline characteristics )是相同的。
换言之，10个LTS和8个对照组LTS之间，除了 KRG的摄入量不同之 外，基本的疾病进展速度(progression rate)或CD4 T细胞数没有显著的差 别。
此外还调査了其他28个对照组患者。这28人中也包括87-05和90-50 的妻子。这28个患者中的一部分为长期生存者。但是，他们是在1997年以 后被确诊的，因此，不包括在长期生存者组中。各参加者提供了同意书。
对感染有HIV-1的患者进行KRG治疗是从1991年下半年在韩国的NIH 开始的。实验中使用的KRG为韩国人参公社销售的红参粉末胶囊。对各个 患者的KRG的一日给药量，男性为5.4g (—天服用三次，每次六粒300mg 的胶囊)，女性为1.8g。各患者的KRG给药时间如图1所示。
10个LTS服用的红参的平均剂量为在155±28个月期间为13，364± 5，364g， 8个对照组LTS服用的红参的平均剂量为在132±29个月期间为 1,436土l,027g (图5)。在10个LTS和8个对照组LTS中，KRG的年剂量 各自为l,035g和131g。在KRG摄入水平中，7.9倍具有统计学意义(P〈0.001)。
实施例2
CD4 T细胞数和血浆HIV-1 RNA复制水平(copy level) 间隔3个月至6个月后，对实施例1的各患者进行采血，分别将各样本 中的外周血单核细胞和结合有藻红蛋白(phycoerythrin， PE)以及异硫氰酸荧光素(FITC)的与CD4抗原对应的抗体进行培养(Simultestreagent;Becton Dickinson,San Jose，CA，USA ) 。 CD4 T细胞的水平通过FACScan (Becton-Dickinson)流式细胞仪(flow cytometry)进行测定。血浆的HIV-1 RNA 、浓度通过Amplicor HIV-1 Monitor kit(Roche Diagnostics,Branchburg，NJ) 进行测定(参见参考文献7)。
每6个月目测摄入了红参的10个LTS和8个对照组LTS的CD4 T细胞 数，结果与图l所示相同。
接受最大红参治疗给药量的10个LTS的CD4 T细胞数从最初测得的 555±208/ul显著地减少到168±29个月后测定的245±160/ul (—年减少22/ul， 图la至图lj)。此外，8个对照组LTS的CD4 T细胞数从最初测得的 574±222/ul减少到132±29个月后测定的353±297/ul (—年减少20/ul，图lk 至图lr)。
可以确认在两个组中CD4T细胞数在IO年中均以类似的方式减少。 实施例3
部分5'LTR区域(region)和gag基因的扩增
前病毒DNA从实施例2中得到的未培养的PBMCs中提取。通过利用 了第一轮弓l物(first round primer) CE23 (5'陽tgtggatctaccacacacaaggctactt-3'; 46至73;序列号l)、 514 (5'國tccagaatgctggtagggtatac-3'; 1,617至1,640;序 列号2)、第二轮引物CE1 (5'-cgagagctgcatccggagtacta-3'; 297至319;序列 号3)、 512 (5'誦ctgcagcttcctcattgatggtc國3'; 1,398至1,420;序列号4)、第三轮 引物501 (5'-gtgtggcctgggcgggactg-3'; 380至399;序列号5)以及510 (5'-gatgtaccatttgcccctgga-3'; 1，202至1，222;序列号6)的双重(极少的三 重)巢式聚合酶链反应(nested PCR)，从297号至1,421号(在此以及以下， 编号来源于HIV NL4-3的序列)的1,125bp的PCR产物由各样品扩增(上述从297号至1,421号的位置为代表部分的5，LTR部分和gag基因的部分)。
含阴性对照组的各样本一次进行的最大PCR反应为4个，而为了扩增 nef基因，含阴性对照组的各样本一次进行的最大PCR反应为5个。精制PCR 产物，直接排序。PCR有无污染通过PCR产物的物理分离来进行监控，PCR 产物的物理分离通过BLAST检索、由人工排列(manual alignment)进行的 氨基酸密码子比较以及系统分析的各手续来进行。
实验结果用平均值土标准偏差来表示。统计学意义用SPSS package version 12.0进行双尾t检验(Student's two-tailed West)以及卡方检验 (Chi國square test)来确认。
实验结果，由在不同的时间点从10个LTS获得的80个PMBC样品扩 增成189个PCR产物(图la至图lj)。在大多数时间点，所有的10个LTS 在5'LTR/gag基因区域表现出gA (图1)。 80个样本中的44个(55%)观察 到缺陷(图2)。 189个PCR产物中，71个(37.6%)表现出gA5'LTR/gag。 其中，23个(32.4%)的扩增仅表现为一条短带(short band),没有野生型 基因。71个的gA5'LTR/gag的特征在图7中进行了概括。
5个PCR产物(2007年1月从患者87-05、 2001年7月从患者89-17、 1993年10月从患者90-05、以及2006年2月和2004年5月从患者92-13获 得)和2个PCR产物(1993年10从患者90-05获得的A 86bp和2006年从 患者90-50获得的A420bp)仅在5'LTR区域内或gag基因内分别含有gA(表 3)。剩余的PCR产物中的缺陷位于5'LTR的两侧末端的部分(至少含有753 位置；A37bp)和gag基因的起始部分(在HIV-1NL43中的818号位置的A 29bp)。换言之，缺陷在gag基因的起始密码子的附近为66bp以上。
因此，在5'LTR区域的gA的比例为36.5X (69/189)，基于gag基因的 gA的比例为34.9% (66/189)。这说明了 KRG给药对5'LTR的影响大于对 gag基因的影响。除去任何样品都没有用的患者91-20和93-60之外，在KRG摄取开始 后5'LTR和gag区域的gA的最初观察早于nef基因缺陷的最初观察。从KRG 的摄取开始至最初gA观察的中间时间为26个月(19个月至101个月)。这 比nef基因缺陷观察所要求的时间更短。
患者87-05同时感染了来自在国外产生的污染的血液凝固因子9的 HIV-1亚型B以及HCV。该患者在1994年6月开始进行KRG给药。虽然 在所有的扩增物中有9bp的小缺陷，但是在10个LTS中，只有该患者不表 现gAnef (参见参考文献9)。令人惊讶的是，本发明人在1997年4月得到 的最初有用的样品中观察到了 gA，从12个样品中的4个得到的36个PCR 产物中观察到了总共7个gA (图la至图lj，图5)。该患者从2007年4月 开始未表现出任何的与获得性免疫缺陷综合症相关的症状，这是韩国首例未 经过任何的抗逆转录病毒治疗而生存20年以上的患者。
患者89-17在1991年12月开始进行KRG给药。但是对于给药的顺应 度不是始终如一的。1993年7月报告的一个gA是一个例外。原因为A 917bp 被pol基因(在相反方向NL4-3的4,296号至4,037号)的474bp以及gag 基因(2，029bp至1,838bp)的终止部分替换。该患者在2002年2月幵始进 行HARRT治疗，CD4T细胞数在2007年4月为513/ul。
患者90-05在1990年2月确诊为HIV-1感染，在1991年12月开始摄 取KRG。该患者在本研究中对于KRG治疗表现出最好的顺应度。除了供给 的21，522g的KRG，该患者还摄取了自己持有的KRG。在95%的顺应度下 KRG的日剂量为6.0g (—天两次，每次10粒300mg的胶囊)。gA的最初观 察相比在2001年1月(KRG给药开始后第111个月，共摄取KRG12,012g) 的gAnef最初观察要早87个月(图6a、 6b、 6c)。 gA的例子和剩余7个LTS 的详细情况如图1以及图6所示。
此外，将从追加的8个对照组LTS得到的33个PBMC样品的88个PCR产物进行了扩增。13个gA (扩增后的PCR产物中的14.8%)存在于10个 PBMC样品中(总共的30.3%)。在PBMC样品和PCR产品上，10个LTS 相比8个对照组LTS，含有显著高的比例的gA(前者P<0.05，后者PO.0001)
(图3)。
此外，将在临床学阶段无关地从未给予KRG的28个患者中得到的30 个PBMC样品的60个PCR产物进行扩增。5个gA (扩增后的PCR产物中 的8.3%)存在于4个PBMC中(总共的13.3%)。
实施例4
遗传缺陷和小缺陷
除了大规模缺陷之外，本发明人观察到了如下的基因缺陷，例如，非蛋 氨酸起始密码子、G至A超变异(hypermutation)引起的提前终止密码子以 及小缺陷。在IO个LTS中，患者87-05在4个序列(EU047601、 EU047605、 EU047607、 EU047609)中显示出提前终止密码子，患者89-17也含有作为 提前终止密码子和起始密码子(GenBankEF370193)的异亮氨酸。患者90-18 在gag基因中具有6bp的插入，患者92-13具有102bp (GenBankEF370252) 的两个重复(duplications)、在5'LTR区域的159bp的缺陷、以及G至A超 变异(Genbank EF370256)，另外该患者在327和328区域(GenBank EF370258)具有6bp的插入(图4)。
在8个对照组LTS中，患者91-22在提前终止密码子或3个序列 (GenBankEF370314、 EU047654、 EU047655)中具有作为起始密码子的异 亮氨酸。患者89-26在一个序列(EU047635)中具有两个提前终止密码子。
实施例5
随着CD4 T细胞数而不同的大规模缺陷的频率本发明人分析了随着CD4T细胞数而不同的大规模缺陷的频率。其中， 最好将IO个LTS的PCR扩增产物按照CD4 T细胞数200/ul以下、200-400/ul、 400/ul以上进行分组。在给予了 KRG的10个LTS中大规模缺陷的频率为 47.4% (9/19)、 51.8% (14/27)以及61.8% (21/34),这表明对CD4 T细胞 数的若干依赖性。但是，在8个对照组LTS中，大规模缺陷比例为44.4%(4/9)、 20% (4/20)、 50% (2/4),此外未给予KRG的28个HIV-1阳性患者为18.2% (2/11)、 14.3% (1/7)、 8.3% (1/12)。
讨论
本发明人在韩国长期关注LTS或LTNP的健康，其结果即使不存在像 CCR5中的32bp缺陷这样的有益的寄主因子(host factor)或韩国人的 HLA-B57,本发明人可以对从1993年12月31日开始确诊的323个HIV-1 感染者中的多数LTS进行观察。
更具体地说，9个fflV-l感染患者在1987年在韩国被确诊，其中三个患 者仍然存活，该三人均使用单独的KRG治疗或与HARRT并用。长期生存 者87-05作为这些患者中的一个，在1996年6月以后开始摄取KRG(图la)。 这些患者中的其他的两人从1998年至1999年同时接受HARRT和KRG治 疗，他们的CD4 T细胞数从1998年的231/ul、 1999年的6/ul增加至2004 年12月的l,052/ul、 2006年的l,127/ul。
此外，22个fflV-l患者在1988年被确诊，仅有进行KRG治疗的两个 患者(9%)仍然存活。患者的HIV-1亚型为CRP02—AG,因此该患者不包 括在本发明的研究中，但是，该患者被分到CD4 T细胞数为500/ul以上的 LTNP中。1997年以后确诊的多数患者同时进行KRG治疗和HARRT治疗， 他们不存在耐药突变(drug resistance mutations),这些患者对该并行治疗法 表现出良好的反应。本发明人通过以前的研究，己经报道了 fflV-l感染患者的KRG治疗与 nef基因大规模缺陷(参见参考文献9)的高频率之间有关联，KRG治疗能 减缓疾病的发展(参见参考文献18)。
本发明中，对来自各样品的三个PCR产物进行扩增，尽管这比由nef 基因扩增的四个PCR产物少(参见参考文献9)，但是本发明人在相同的IO 个LTS中观察到，与nef缺陷(样品的34.3%和PCR产物的18.8%)(参见 参考文献9)相比较，大规模缺陷(样品的55X和PCR产物的37.6X)的 频率更高(PO.OOOl)。 5'LTR/gag的缺陷频率比在nef基因缺陷中确认的频 率高1.6倍/2.0倍。在总共80个样品中，61个之前适用于nef基因的扩增。 上述61个样品中的13个(21.3%)在两个基因中均有大规模缺陷。尤其是 患者87-05、 89-17、 90-05、 90-50、 96-51在5'LTR/gag基因中比在nef基因 中显示出显著高的大规模缺陷的频率(P<0.05)(图5)。此外，显示出大规 模缺陷的样品的比例在接受KRG治疗的IO个LTS中确认为37.6%，这比8 个对照组LTS (14.8%)和28个fflV-l感染患者(8.3%)明显要高。而且， 本发明中，可以确认8个对照组LTS或其他的28个患者的任何的组中大规 模缺陷频率与CD4T细胞数之间不存在任何联系(实施例5),根据该发现， 可以证明大规模缺陷和KRG摄取之间的关系。
上述发现表现出与在IO个LTS中的相对于CD4T细胞数的适当的依赖 性(modest dependency)的良好的比较。接受KRG治疗的10个LTS中一直 坚持的患者87-05、 90-05、 92-13、 96-51维持了 CD4 T细胞数(图la、 lc、 lg、 lj)，但是相反最近.1-2年间未坚持的患者90-50、 91-20、 93-60的CD4T 细胞数很快减少(图le、 lf、 li)。如上所述，由态度引起的CD4 T细胞数 减少已经在患者89-17和90-18中出现(图lb、 ld)。在超过10年的长时间 下没有任何的AIDS相关症状，因此，多数患者有不注意他们的健康状况或 无视KRG的摄取的倾向。最近的几篇论文公开了 LTNP中的全长病毒序列的遗传特征。Alexander 等(参见参考文献22)除了在nef基因中之外没有在其它的基因中发现缺陷， 而发现了提前终止密码子、无规缺陷(out-of frame deletions)以及整体缺陷。 不常见的多形性(polymorphism)和nef基因大规模缺陷在8个LTNP中被 发现。此外，Huang等(参见参考文献23、 24)报告了 8个LTS中5'LTR 和gag基因的遗传性缺陷。在该研究中得到了全长病毒序列，仅在一个患者 的5'LTR和gag基因中发现G至A超变异(hypermutations)。最近，Calugi 等在eiw基因(与nef基因相邻的基因)中确认了大规模缺陷(参见参考文 献25)。 Blankson等(参见参考文献26)在比50copies/mL少的血浆RNA 的病毒负荷量(viral loads)下没有在抑制因子(supressor)的HIV-l全长的 碱基序列中发现任何的大规模缺陷。
HIV-1基因表达通过在含有TATAbox、转录因子NF-kB以及Spl (参见 参考文献27)的结合区域的LTR中的几个高保存的顺式作用调节元件 (cis-acting regulatory elements)进行调节。人参的某些成分抑制了人体细胞 株中的NF-kB和Ap-l转录因子活动(参见参考文献28)。相比HIV-1的其 它部分，LTR部分更有可能受KRG摄取的影响。
本发明中，在包括患者87-05 (未表现出nef基因大规模缺陷)的10个 LTS中观察到5'LTR的大规模缺陷。而且，观察到的各个大规模缺陷的尺寸 较大，但是仅位于基因内的单一位置。本发明人在得到HIV-1全长碱基序列 时确认了6个LTS (患者卯-05、 90-18、 90-50、 91-20、 92-13以及96-51) 的env基因大规模缺陷OlOOObp)(数据未图示)。
因此，不考虑KRG摄取和基因缺陷之间的关系，尽管本发明的观察仅 是在本发明的研究中获得的各种有益的因素中的一个发现，但是本发明的结 果提供了初步数据，该初步数据是指在5'LTR部分和gag部分的大规模缺陷 与HIV疾病的进展率有显著联系(参见参考文献1-9)。关于病毒基因缺陷怎样影响LTS或LNTP的可能的机理，本发明人推断基因缺陷是KRG的摄 取引起的间接的免疫调节(immune modulation)的结果。众所周知，高丽人 参以通过Thl细胞因子(cytokines)的细胞介质性免疫反应(cell mediated immune response)为媒介(参见参考文献29-32)，在HIV-1感染中抑制一般 的免疫活性状态(generalized immune activation state)。然而，不给予KRG 的LTS相比感染HIV的其它的28个患者仍旧具有更高的5'LTR/gag缺陷， 因此KRG摄取可能不是唯一的要素。该发现证明了在LTS或LNTP的生命 延长中由KRG摄取引起的基因缺陷的重要性。 <碱基序列的结果(SequenceDATA) >
总共的336个碱基序列中的178个已经提交给GenBank，并给出了 GenBank登录号EF370172至EF370349、EU047600至EU047667、EU047670 至EU047676、以及EU047681至EU047693。
工业实用性
具体地说，本发明的药物组合物可以通过向HIV感染个体给药而诱导 HIV-l具有5，LTR和/或gag基因缺陷。因此，本发明提供的药物组合物可以 用于AIDS的预防以及治疗。序列表
<110> (株)韩国人参公社
蔚山大学校产学协力团
<120>含有高丽人参的用于使HIV-1具有5'LTR/gag基因缺陷的药物组合物
<150> KR10-2008-0037555
<151> 2008-04-23
<160> 6
< 170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一轮引物CE23
<400> 1
tgtggatcta ccacacacaa ggctactt
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一轮引物514
<400〉 2
tccagaatgc tggtagggta tac
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220>
<223> 第二轮引物CE1
<400〉 3
cgagagctgc atccggagta cta<210> 4
<211〉 23
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223> 第二轮引物512
<400〉 4 ctgcagcttc ctcattgatg gtc
<210〉 5
<211> 20
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉 第三轮引物501
<400〉 5 卿ggcctg ggcgggactg
<210> 6
<211〉 21
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>第三轮引物510
<400〉 6 gatgtaccat ttgcccctgg a
权利要求
1、一种用于使HIV-1具有5’LTR和/或gag基因缺陷的药物组合物，其特征在于，该组合物含有作为有效成分的高丽人参。
2、 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述高丽人参为红参。
3、 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，该组合物用于对 感染有HIV-1的患者进行给药。
4、 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，以50-100毫克/千克/ 天的给药量对男性进行给药，以20-70毫克/千克/天的给药量对女性进行给 药。
5、 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述5'LTR和/或 gag基因缺陷选自具有提前终止密码子、缺少起始密码子。
6、 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述5'LTR和/或gag 基因缺陷表示为具有以下GenBank登录号的序列EF 370172， EF 370173，EF 370175，EU 047612，EF 370184，EF 370186，EF 370187，EF 370188，EF 370191，EF 370192，EF 370193,EF 370196，EF 370197，EF 370199，EF 370201，EF 370200，EF 370202，EF 370205，EF 370207，EF 370211，EF 370213，EF 3702115，EF 3702116， EF 3702118， EF 370219， EF 370221，EF 370223，EF 370224，EF 370225，EF 370226，EF 370227，EF 370228，EF 370231,EF 370235，EF 370237，EF 370239，EU 047647，EF 370245，EF 370250，EF 370251，EF 370252,EF 370253，EF 370256，EF 370259，EF 370262，EF 370261，EF 370265，DQ 295196，EF 370275，EF 370276，EF 370277， EF 3702778， EF 370279， EF 370282， EU 047673， EF 370283， EF 370285， EF 370286， EF 370287， EF 370288， EF 370292。
全文摘要
本发明涉及以高丽人参作为有效成分的用于使HIV-1具有5’LTR和/或gag基因缺陷的药物组合物。本发明的药物组合物通过对HIV感染个体进行给药，可以诱导HIV-1中的5’LTR和/或gag基因的缺陷。因此，本发明可以用于AIDS的预防以及治疗。
文档编号A61K36/185GK101564408SQ20081014440
公开日2009年10月28日 申请日期2008年7月29日 优先权日2008年4月23日
发明者赵泳杰, 郑有善 申请人:(株)韩国人参公社;蔚山大学校产学协力团