一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物的用途的制作方法

专利名称：一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是从海洋生物中分离有抗癌活性的化合物，具体地说是从面包 海星中提取分离到的一种海星皂苷类化合物及其在制备TO质瘤药物中的应用。
背景技术：
人胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的一种，致残率和死亡率高，5年生存率为20% 30%,在所 有,瘤中占半数的胶质母细胞瘤患者5年生存率不足5%。目前用以治疗胶质瘤的化疗药物主 要有亚裙脲类烷化剂尼莫司汀(ACNU)、卡莫司汀、洛莫司汀以及甲基节肼、甲氨喋呤、环磷酰 胺、替尼泊苷等，但这些药物对恶性胶质瘤的有效率较低，一般小于50%,对生存时间延长不 明显，而且很易造成严重的肝脏损害及骨餘抑制，往往因为药物的毒副反应重而不得不放弃化 疗此外，至少半数以上胶质瘤对常用的化疗药物耐药。因此，与对其他肿瘤的治疗相比，目 莳临床上更缺乏对胶质瘤有效的治疗药物，新型安全高效的化疗药物的开发是治疗该病的迫切需求。
海星(starfish偶棘皮动物门海星纲，现存约1500种，为海生底栖动物，分布广泛。近二十 年来，国外关于海星活性化学成分特别是海星甾体皂苷的研究非常活跃，对海星皂苷的研究已 ^Sl邻余种结构新颖的化合物的发现。这些海星皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、Na+-K+-ATP ,制、抗湊疡、溶血等多种多样的药理活性。海星皂苷(asterosaponins)为海星甾体皂苷中的一 类特定的化合物，其结构特征为具有A""邻,6a-二羟基甾体母核，并在3位硫酸化，6位糖 ^fc。苷元僩链至少有1个位置被氧化，寡糖基一般由5或6个糖基构成，并具有相似的连接 方式和连#@:点(汤海银易杨华，张淑瑜，等.海星皂苷的研究进展.中国海洋药物，2004， 23(6): 48"57和Iorizzi M. De Marino S, Zo!k) F. Steroidal oligogJycosides from the asteroidean. Current Orgnic Chen、 2001， 5(外951)-
我国南海生物资源极为丰富，是世界上海星集中分布的海域之一，特别是面包海星(C"fcito wmHSw^w)的蕴藏量巨大，我们从采自三亚海域的面包海星中分离鉴定了 16种具有生物活性 的海星龟苷，包括1I种新化合物，这是国内外首次对面包海星中的海星皂苷类化合物进行分离 和鉴定。深入的药理研究表明，这些海星皂苷多数具有显著的肿瘤细胞毒性。其中一种新化合 物novaeguinoside II对U87MG等多种胶质瘤细胞具有显著细胞毒性并显示了 一^择性，IC 值与临床常用于恶性脑肿瘤治疗的盐酸尼莫司汀接近，但不影响原代培养的人神经胶貭细胞生 长。该化合物即下述式I所示化合物EHMC。 EHMC的化学结构以及对K-562人白血病细胞和 BEL"7402人肝癌细胞的细胞毒性已由我们报道(T油g HF(汤海峰)，Yi m Ii L， S咖P, Zh油g SQ, Zhao YP. Bioactive asterosaponins from the starfish C"for'/" nc7WK{g ^KW. / jV"/户roJ， 2005, 68(3): 337-341),但其 质瘤活性尚未见有过^报道和专利申请。

发明内容
本发明的目的旨在 —种提取自面包海星的海星皂苷类化合物在制备抗胶质瘤药物方面 的应用。
本发明的目的是这样实现的， 一种从面包海星提取的海星皂皆类化合物，它的分子式为 C57HjoQa(SNa,式1所示化合物
式I
上述结构其化学名称为(2Q/ ， 22^ 235， 24^60^-{^0-吡喃岩藻糖基<1—2)Hi-L-吡喃阿拉 伯糖基"(1—4Hp"D"8lt喃奎诺糖基"(1—2)+1>吡喃奎诺糖基<1~*3)^1>"耽喃葡萄糖基卜22， 23-环氧-2(K羟基-24"甲基-5tt-胆甾-9(ll)"烯-3p"硫酸钠(sodium 22/^ 24S>6a 0-{^l>
fiiotqjyranosyU(l2>a-Lraiabinopyranosyl"(l — 4)"lP4Xjui加vopyranosyl-(1 — 2)]_^-l>quinovO"
54^sulfete),是从面包海星中提取分离的海星皂苷类化^，以下简称其为EHMC,其特征是 所述的式I化合物EHMC可以用于制备治疗胶质瘤的药物。
所述的式I化合物EHMC对C6大鼠源性恶性胶质瘤细胞以及U87MG、 U251MG、 BT325 和SHG44四种人源性^I4胶质瘤细胞有明显的抑制作用，半数有效抑制浓度(IC50值>在1.45 3J2 limol/L之间并且，在高至50 U mol/L浓度时也不影响原代培养的人神经胶质细胞生长， 式I化合物EHMC对MKN-28人胃癌和A-549人肺癌细胞的抑制作用非常弱，表明其对胶， 具有选择性作用。
以新鲜采集的面包海星为原料，原料经剪碎后，按重量^5比加入3 5倍原料重的95%乙 醇，回流提取3次，每次2 4小时；合并提取液，回收溶剂，得乙醇提取物，提取物分散于按 重量^ 比3倍的水中，分别用和水等^m的石油醚萃取10次，萃取后的水相再分别用与水等 体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，浓缩至l/3体积，加等体积的水洗涤l次，以除去 盐、多糖强极性成分，将水洗后的正丁醇相蒸千得到总苷提取物。总苷提取物应用硅胶柱层析， 以体积比为2:I:0 ():6:I的氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合^flI洗脱，得到总海星皂苷。总海星 龟苷应用硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化，分别用体积比为12:1的正丁醇-甲醇 混合溶剂和体积比为2:1的甲醇-水混合溶剂洗脱，合并含式I化合物EHMC的流份，再经高效 液相色谱仪分离纯化，体积比为46:54 47:53的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合 物EHMC的纯品。
所述的从面包海星中提取分离式I化合物EHMC的方法，除应用常规的^^提取、溶剂萃 取和各种色谱分离技术外，在应用硅胶柱层析方法从总苷提取物制备总海星皂苷时，对于包含 有EHMC的总海星皂苷的确定是采用如下手段来检査的以硅胶薄层层析检测，采用体积比为 12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合^"j或柳比为肌1&2的氮仿-甲醇-水混合^M展开，收集&值 在0.1~035处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷。
所述的式I化^EHMC在作为药物使用时，可以是^使用，也可以是与其他成分混合 娜。
在临床应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以《fe用
的各种不同剂型的药物，如注射剂、或散剂、或丸剂、或胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或软胶 囊剂、或膜剂、或裔剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂等。 本发明的特点是-
目前临床上缺乏有效治疗胶质瘤的药物，虽然本发明人从面包海星中分离鉴定的一种海星 龟苷类化合物EHMC同时也可以抑制K-562人白血病细胞和BEL-7402人肝癌细胞生长，但相 比于开发为抗白血病和抗肝痛药物，开发其显著的抗胶质瘤作用并应用于临床治疗胶质瘤更具 有重要的现实意义。而且，该化合物对于MKN-28人胃癌、A-549 AJ肺痛等其他肿瘤细胞的抑 制作用非常弱，表明它对胶质瘤的抑制作用具有一定选择性。
式化合物EHMC的结构为本发明人所发现和报道，但它的抗胶质瘤作用未见任何文献报 道和专利申请，它对多种人和鼠恶性胶质瘤细胞株的显著抑制作用以及不抑制正常神经胶质细 胞生长的作用考明其可以作为新的高效低毒的WJK质瘤药物进行研究开发。
具体实施例方式
以新鲜采集的面包海星为原料，原料经剪碎后，按重量体积比加入3~5倍原料重的95%乙 醇，回流提取，共提取3次，每次2 4小时。合并提取液，回收溶剂，得乙醇提取物，提取物 分散于按重量体积比3倍的水中，分别用和水等体积的石油酵萃取10次，萃取后的水相再分别 用与水等柳的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，浓縮至1/3体积，加等^R的水洗涤
次，以除去盐、多糖等强极性成分，将水洗后的正丁醇相蒸千得到总苷提取物。总苷提取物应 用硅胶柱层析，以^**1比为2丄0~0:6:1的氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱，硅胶薄层 层析检溯，細柳比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂或体积比为80:18:2的氯仿-甲醇-水 混合^W展开，收集Rr值在0.1 035处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷。总海星皂 苷^ffl硅胶柱层析和Sephadex LH-20 柱层析纯化，分别用体积比为12:1的正丁醇-甲醇混 合溶剂和体积比为2:I的甲醇-水混合溶剂洗脱，合并含式I化合物EHMC的流份，再经高效液 枏色谱仪分离纯化，体积比为46:54 47:53的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物 EHMC的纯品。
下面络合具体实施例来说明本发明的实质。应理解，这些实施例使本发明所说的式I化合 物EHMC的用途得以证实，而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的试验 方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
^jl树l:化会對的提取和分离l
制备实施例化合物的原料为采用潜水和拖网手段采集自海南三亚海域的面包海星，原料重
68公斤，共85个面包海星，经剪碎后，加入210升浓度为95%的乙醇进行回流提取，共提取3 次，每次2小时。合并提取液，减压回收^W(减压回收即本行业通常所采用的袖滤方法，下同)， 得乙醇提取物3.1公斤。提取物分散于10升水中，用石油醚萃取10次，每次10升。萃取后的 水相再用正丁醇萃取3次，每次10升，合并正丁醇萃取液，浓缩至约3升，加3升的水洗涤1 次，将水洗后的正丁酵相蒸干得到总苷提取物145克。将总苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿-水饱和的正丁l^甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为2:1:0(取下层作为洗脱 銜，0:1:0和0:6:1，按500 mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用 体积比为12-15的正丁,乙膝水混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色 剂后于105 r加热显色)，收集Rf值在0.1M)35处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂苷， 共5.9克。总海星皂ffit行硅胶柱层析，用体积比为12:1的正丁醇-甲醇混合溶剂洗脱，按100 毫升为1个流份接收，薄层层析检測，合并含如下式I化合物EHMC的第19 25流份，减压蒸千l^剂后再采用Sephad战LH-20自柱(Phaimacia公司)进行柱层析，用体积比为2:1的甲醇-水混合^^,，按10毫升为一个流份接收，薄层层析检測，合并含如下式I化合物EHMC的 第35 40流份和第41 44流份，分别SlSffi蒸干溶剂后得到0.32克样品C和024克样品D。样 品C经高效液相色谱仪(安捷伦公司份离纯化(高效液相色谱条件为杜邦Zorbax300 SB"C,g色 谱柱250mmX9.4mm， 47%甲醇为流动相，流速13 mL/min，室温，示，光检測器检测), 得到如下式I化合物EHMC的纯品33.0毫克；样品D经高效液相色谱仪(安捷伦公司份离纯化 (高效液相色谱条件为杜邦Zorbax300SB"Cw色谱柱250mmX9.4mm， 46%甲醇为流动相， 自1.9 mL/min，室温，示^F^fe检溯l&检劂)，得到如下式I化合物EHMC的纯品9.1毫克。
<formula>formula see original document page 6</formula>
i^结构其化学名称为(20/ ， 22/ ， 235， 24SV6a"-^D"吡喃岩藻糖基^1—2> 丄-吡喃阿拉 伯糖基"(l ,4)"[P"D"吡喃奎诺糖基^1 —2)1+1>吡喃奎诺糖基<1 —3)>^>吡喃葡萄糖基卜22, 23-环氧-20"径基-24^甲基-5et-胆甾-9(Il)-烯-3^琉酸钠(sodium (20凡22/^ 24S>6okHP"l> fijcopyranosyl"< 1 — 2^a-L-arabinopyranosyH 1 ~* 4HP"D-quinovopyranosyH 1 — 2)]~p-I>quinovO" pymnosj^Kl ~* 3)"p"D"glucopyranosyl)-22^"epoxy-2(Miydroxy-24"咖thyl-5a-cholest"9(IJI)"en-3P" yl^ulfiite),是从面包海星中提取分离的海星龟苷类化合物，简称其为EHMC。
ifeK例2:化^Rl的提取和分离2
M潜水和拖网手段采集自海南三亚海域的面包海星作为原料，原料重100公斤，共129 个面包海星，经剪碎后，加入400升浓度为95%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次4小 时》合并提取液，减压回收i^剂，得乙醇提取物4.8公斤。提取物分散于15升水中，用石油醚 10次，每次15升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次15升，合并正丁醇萃取液， ifc缩至约5升，加5升的水t5fe涤l次，将水汰后的正丁醇相蒸干得到总苷提取物220克，将总 苷提取物迸行M柱层析，以氯仿-水饱和的正丁醇-甲醇混合溶剂进行梯度皿， 液的柳 比分别为2:1:0(取下层作为洗脱液)，0:1:0和0:6:1，按750 mL为一个流份接收，并用硅胶 薄层层析检测(薄层展开^M^ffl体积比为幼:8:2的氯仿-甲醇-水混合齢W，显色剂为体积比为 l:4的琉酸-甲醇溶液，喷显色剂后于I05 r加热显色)，收集Rf值在(U 035处显示紫红顿 点的流份，即为总海星皇苷，共9.1克-总海星龟苷迸行硅胶柱层析，用体积比为12:1的正丁 醇-甲醇混合溶审欣脱，按I50毫升为I个流份接收，薄层层析检测，合并含实施例1式I化合 物EHMC的第20 26流份，减压蒸千溶剂后再采用Sephadex LH-20 TO掛Phan鹏cia公司)进 行柱层析，用体积比为2:I的甲醇-水混合^M,，按I5毫升为一个流份接收，薄层层析检湖， 合并含实施例1式I化合物EHMC的第35~41流份和第42 45流份，分别减压蒸干溶剂后得 到O.邻克样品C和0.37克样品D。样品C经商效液相色谱仪(安捷伦公司)分离纯化(高效液相 色谱条件为杜邦Zorbax300SB《!8色谱柱250mniX9.4mm， 47%甲醇为流动相，流速1.7
niL/miii,室温，示差折光检測器检獮)，得到实施例1式I化合物EHMC的纯品50.2毫克； 样品D经高效液相色谱仪(安捷伦公司份离纯化(高效液相色谱条件为杜邦Zorbax300 SB^CJ8 色谱柱250 mmX9.4 mm， 46%甲醉为流动相，流速2.0 mL/min，室温，示差，检测器检 獮)，得到实施例1式I化合物EHMC的纯品14.1毫克。 化合物的结构鉴定
实施例1式I化合物EHMC为白色结晶性粉末,分子式为C57Hw03gSNa,熔点为215~216 °C,ajj +3° (c 0.132 MeOH),, Liebermann-Burehatd和Mofoh反应均为阳性。
对化合物进行酸水解和糖衍生物的分析，具体方法为取1.0 mg样品，溶于2 mol/L CF3COOHltnL，置2mL安瓿中，充氮气，封管，于烘箱中120 t:加热反应2h, 40 1c减压蒸 干，反复加MeOH (1 mLX3)后减压抽干以除去CFjCOOH,残渣以CHaClj/HsO (5 mL/5 mL)分 配，水层以5 mLCHjOj洗涤1次，蒸干，0.8 mL无水吡啶溶解至10 mL反应瓶中，加入2 mg NHiOH.Ha, 90 1c水浴振荡反应30min,冷却至室温后加入醋酐0.8 mL,再于90 r振摇反应 lh,减压蒸干，反复加CH2Cl2(lmLX3)后减压蒸干，溶于CHCl3 0.3mL,取ljiL进行GC/MS 分析。单糖对照品U5f拉伯糖，1>岩藻糖、D^奎诺糖、D"葡萄糖各10mg,分别溶于lmL无水 吡接，按相同衍生方法制备糖腈乙酸酯，作为GC分析时的对照。GC/MS分析采用Fitmigan AfeyagerGC/MS联用仪，配D&5石英毛细管色谱柱(30mX0.25 m取(L25 nm)。柱温150 tc, 保持2min;升温至300 "(15 tVnrin),保持10min。汽化温度250 进样量1 ^L。载气(流 量)N2(l luL/min)，分流比30:1,延迟2 mia。 MS检測器El电离源，电离电压70eV, 源温200 t:。 MS标准库NBS， MST库。GC/MS对比分析表明实施例1式I化合物EHMC 含有4种糖基IX葡萄糖ttt- 8.010 minX D"岩藻糖(Ir^.351 minX L"阿拉伯糖(1r^6.260 minX 1> 奎娜(^=6_251 min),组成比约为1:1:1:2。
对化合物进行甲基化、酸水解和糖基分析，具体方法为取真空干燥4h的样品(2.2mg)加 入lmLDMSO中，快速加入刚磨好的NaOH粉40mg,充氮气后加盖密封，并在超声波作用下 溶解20mia,再加入(h3mLCHj1,避光室温放置30miii后，加入4mL水中止反应，以CHCl3 5祖L萃取，CHCb层用H20洗銜3mlXJ),减压蒸干，溶于2 mol/LCF}COOH0.75 mL中，充 氮气，1c水解2h。水解液加入CHa3/H20(2miy2mL份配，水层用1.5mLCHCl3洗 涤后JftE蒸干，残渣反复加入HjQ (0.7 mLX2辦MeOH (1 mL)后减压蒸干以除去CF3COOH。 然后加入0.5 mol/L氨水0.5 mL和HaBH^ 4 mg, 25 1c反应4 h，滴加1 mol/L酸酸至无气泡产 生，60 "以下鹏蒸干，再反复加入O.P/o盐酸甲醇《2mLX3辨甲斷2mL)后舰蒸干，以除 J^fll酸根离子。残渣于105 1c加热20miii以除尽水分，加入醋酐0.5mL和吡啶0.5mL,封管， 100 t:加热45 乙酰化。乙酰化物以CHCiyHjQ(1.5 ml71.5 inL份配，CHCl3层相继以HaQ 1 mL,饱和NaHCQj溶液1 mL, HsO 1 mL洗涤，然后减压浓缩至干，加0.3 mL CHC13溶解后取 1 pL进行GC/MS分析。GC/MS分析条件与检測前述糖衍生物的条件相同。可以检測到5种部 分甲基化糖酵乙,，分别对应于实施例1式I化合物EHMC的寡糖链中的不同连接位置的糖 基Mkked glucme (l"-tri"0-acetyl-2,4，6"tri-0"nK^hylglucito1^ V=7.430 233， l粉，161，
129， 117,101， 87， 43X 24inked araWnose (l，2，5"tri O"acctyl-3，4"di-0-methylarabinitot V= 6.976 aiin^
l粉，129， 117， 101， 87, 43)> 2，44kiked quimwose (1，2，4,5-tetra-Oacetyl-3-0-methylquinovitoL V=6J18 mii^ 203,189， 143, 129， 117， 101， 87,43X terminal fiicose (l,5"di"0-acetyl-2，3,4^tri"0-nK^Mot tR=5.743 nri^ 175， 161， 131， 117， 115， 101， 89， 72， 43)^ terminal qutaovose (1,5-d^O-acetyl-2，3，4otiiCMnetl^k]ninDvitoL V=5.484 min^ wfc 175， 161， 131,117,115,101， 89,72， 43)。
通过离分辨质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱的综合解析，确定了该化合物的结构。 其波谱数据如下
ESI-MS (正离子模式)1304 [M+Na+Hf, 1303 [M+Na+， 755 px 146+132+162+ Naf，
663 [1/2M+Naf, 609 [2XI46+I32+I62+NaI+， 463 [132+146+ 162+Na+; MS/MS (iwfe 1303) w*fc
1303 [M+NaJ*, 1183 [M+Na^NaHSCM4, 1038 [1183-147r，卿[1183-2XI46["， 725 [I胁FuoAra-
QiriH-2XI6r， 593 px 146+132+NaI+, 442XI46"32+Nar。 ESI-MS (负离子模式)wfc 1257; 1157 [M-Na-IOOr (cleavage of Ca^), 1111 [M
-N"46r, 979 IM-Ma-1格132L 9M"Nar2 X H6]-， 81157-2X146]"， 83M-Na-2X
l格132]-， 68M-Na-3 X 146>132]"， 52M-Na-3 X l格132-162]'， 507 [525- Hjpr。 HRES1-MS (正
离子模式)iwfc 1304.5416 [M+他+Hr (计算值C57HM02sSNa2:1304.5438X 1303.5353 [M+Nal* (计
算值C^HMOasSNaz: 1303.5369)。 IR (KBr) cm": 3441(OHX 1641(C=CX 1242, 1213(sulfete),
1063(00)。其^和UC核磁共振数据以及重要的HMBC相关信号见表1 。
表1实施例1式I化合物EHMC的和UC核磁共振数据a以及重要的HMBC相关信号(測试
__j^剂氘代吡啶) _
T5S! SHinuit6 Sc鹏lT No- SH咖lt11 ^ HMBC
=1.24 vp=1.50m
4.74 m
P=1.55m 1.37 m 3.67
p=2.57bni(n.6) 1.92 m
5.11m tt-l邻叫
p=2.16dd (15.6,3.9) 1.03 m
a=l-70叫p=2.01 in
0Fl.47叫p-1.01m
1.53 m
0.87 s
O.抑s
1.29 s 2.72 tas 2.81 hrd (8.2)
1.57 m 0.82 d (6.8) 0.75 d (6.2)
0.74 d (63)
36.01 GkT 29.51 1
77.7 d 2 30-81 3
49.4 d 4 幼,9d 5 41.61 6
35.3 d QuiT 145.7 s 1 38.3 s 2
116.6d 3 4231 4
41.8 s 5 53.7 d 6
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41.9 d 2 31.7 d 3 20.4 q 4
19.2 q 5
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1
2
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4.32叫4.15 m
4,773 d (8.0) 3.92 m
3.94 m 3,44t(8J0)
3.67 m 1.50 d (5.7)
105.4 C-6
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69.7 77.5 62.3
103.9 GlcC-3
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75.2 QuiI02
84.7 QuilC-3，AraCM
71.8 QuiI(M
18.3 Qua CM,-5
4.761 d (7.3) 102.6 QuilC4
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4.13 m 73.5
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(12.3)
5.11 d (7.1) 3.91 m
3.93 m 3.52 tn 1.61 d (5.9)
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QidIC-2 Quill C-l
AraC-2 Fuc<M，-3
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1234 567 89s =s 22s5eE:ssss加？s8 is :l加"認
力2 7 4 SO力
o 7 7 7 丁 1
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o 7 7 7 7- 1"核磁数据经由tH-lH COSY, TOCSY， HSQC和HMBC谱的分析得以确定。b括号内为偶合常数 (他)。e多重性由DEPT谱确定^在HMBC谱中可以检测到frfl和Gh;C-l的相关信号。幼<::葡 萄糖，Ara:阿拉伯糖，Qui:奎诺糖(其中，Qui I连接于Gfc的3位，Qui II连接于QuU的2位), Fuc:岩藻糖.
化^体mftJR5US作用的研究
对实施例1式I化合物EHMC进行了体外 质瘤#，试验所采用的细胞株分别为C6 大鼠源性恶性胶质瘤细胞以及U87MG、 U251MG、 BT325和SHG44等4种人恶性胶质瘤细胞。 为獮it实施例I式I化合物EHMC对胶质瘤的选择性以及对正常神经细胞的毒性，另取MKN-28 人胃痛和A-549 AfJf痛细胞株以及原代培养的人神经胶质细胞同时测定实施例I式I化合物 EHMC的细胞毒性。采用常规的MTT法潲试。
具体方法为根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以4000个细flS/孔接种于邻孔 培养板，貼壁生长24小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发 明化合物的溶液200!iL，每个浓度设3个复孔，并设盐酸尼莫司 丁(ACNU)阳性对照、生理盐水 对照和无细胞调零孔。细胞在37t;、 5%CQ!-95%02条件下培养48小时，然后加入PBS溶解 的浓度为10mg/mL的MTT(Sigma公司)20nL,在同样条件下孵育4小时。最后，每孔加入200 (iL的二甲基亚砜，混匀'将96孔板置酶标仪上测定各孔在4邻鹏处的吸光度(OD难。按下式 计算被潲物对细胞生长的抑制率
细胞抑制率-(l 一治疗组OD值/对照组OD值)X 100%
半数有效抑制浓度IC5o值采用LogH法计算。试验结果见表2。 表2实施例I式I化合物EHMC对5种恶性胶质瘤细胞、2种其他肿瘤细胞以及原代培养的人
神经胶质细胞的抑制作用(IC5Q值，funol/L)
C^7MGSHG44神经胶威细胞
EHMC183:1:0.863-2" 0.741,45 ±010>邻
0.42 ±0观未湖未糖>邻
可见，实施例1式I化合物EHMC对4种人恶性胶质瘤细胞和1种大鼠源性恶性胶质瘤细 胞均有显著抑制作用，ICso值与临床常用于恶性脑肿瘤治疗的盐酸尼莫司汀接近，但对其他2 种肿瘤细胞的抑制作用非常弱，表明其对胶质癍具有选择性作用。实施例I式I化合物EHMC 不影响原代培养的人神经胶质细胞生长(1C50值::50 jimol/L)，具体试验中发现，既使在实施例1 式I化^fe EHMC为50 pmol/L浓度时，对神经胶质细胞的抑制率也只有9.0% (ZM).05)，但阳 性对照盐酸尼莫司汀在50| 110^浓度时的抑制率可达26.8%(户<0.05),可见，实施例1式I化 合物EHMC对正常神经胶质细胞基本无毒性，可用于制备治疗胶质瘤的药物。
，的制备
注射剂配方2mgEHMC, 50 mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0，总体积1 mL。制法取实施 例I式[化合物EHMC 10 mg,加50 mrad/L磷酸缓冲液(pH 7.0) 5 mL,在无菌条件下完全溶解， 分别经过G3和G6玻砂过滤器过滤，灌封于1 mL安瓿中,100 T灭菌30分钟，得5支。
口服制审版方5毫克EHMC, 50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。制法取实施例1 式I化合物EHMC 5毫克，加50毫克甘露醇和100毫克可溶性淀粉，充分混匀后制粒，所制颗 粒包装即得颗粒剂；所制颗粒装于空胶囊壳中，即得胶囊剂所制颗粒直接压片，包薄膜农， 即得片剂。
权利要求
1.一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物，化学结构式如下上述式I结构的化学名称为(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃岩藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-环氧-20-羟基-24-甲基-5α-胆甾-9(11)-烯-3β-硫酸钠(sodium(20R，22R，23S，24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovo-pyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，以下简称其为EHMC，其特征在于它在制备抗胶质瘤药物中的应用。
2. —种从面包海星中提取分离海星皂苷类化合物EHMC的方法，其特征在于以新鲜采集 的面包海星为原料，原料经剪碎后，按重量体积比加入3~5倍原料重的95%乙醇，回流提取3 次，每次2 4小时合并提取液，回收溶剂，得乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比3倍 的水中，分别用和水等体积的石油醚萃取IO次，萃取后的水相再分别用与水等体枳的正丁醇萃 取3次，合并正丁醇萃取液，浓缩至l/3柳，加等^^的水洗涤1次，以除去盐、多糖强极性 成分，将水洗后的正丁醇相蒸千得到总苷提取物总苷提取物应用硅胶柱层析，以体积比为 2:1:0 0众1的氯仿-水饱和的正丁l甲醇混合溶剂洗脱，得到总海星皂苷；总海星皂苷应用硅 胶柱层析和Sephadex LH-20 ^^f柱层析纯化，分别用体积比为12:1的正丁,甲醇混合溶剂和 体积比为2:I的甲醇-水潘合溶剂洗脱，合并含式I化合物EHMC的流份，再经高效液相色谱仪 分离纯化，体积比为46:54 47:53的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物EHMC的纯品。
3. 根据权利要求2所述的一种从面包海星中提取分离海星皂苷类化合物EHMC的方法，其 特征在于除应用常规的溶剂提取、^^萃取和各种色谱分离技术外，在应用硅胶柱层析方法 从总苷提取物制备总海星皂苷时，对包含有EHMC的总海星皂苷的确定是采用如下手段来检査 的以硅胶薄层层析检澜，細柳比为12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶剂或^!R比为抑:18:2 的氯仿-甲 "水混合溶剂展开，收集Rf值在0.1 035处显示紫红色斑点的流份，即为总海星皂 苷》
4. 根据权利要求1所述的一种从面包海星提取的海星皂苷类化合物EHMC在制S^t胶质瘤 药物中的应用，其特征在于所述的从面包海星提取的海星皂苷类化合物可以单独使用或与其 他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，如注射剂、或散剂、或丸剂、或 胶囊剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或奢剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。
全文摘要
本发明提供了一种海星皂苷类化合物，分子式为C₅₇H₉₃O₂₈SNa，化学名称为(20R，22R 23S，24S)-6α-O-{β-D-吡喃岩藻糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→4)-[β-D-吡喃奎诺糖基-(1→2)]-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基}-22，23-环氧-20-羟基-24-甲基-5α-胆甾-9(11)-烯-3β-硫酸钠(sodium(20R，22R，23S 24S)-6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-[β-D-quinovopyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovo-pyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl}-22，23-epoxy-20-hydroxy-24-methyl-5α-cholest-9(11)-en-3β-yl-sulfate)，以下简称其为EHMC，它是从海洋生物面包海星中提取得到的抗肿瘤化合物单体，其特征在于它在制备抗胶质瘤药物中的应用。体外抗肿瘤试验表明，该化合物对C6大鼠恶性胶质瘤细胞以及U87MG、U251MG、BT325和SHG44四种人恶性胶质瘤细胞有明显的抑制作用，而不影响原代培养的人神经胶质细胞生长。该化合物可望用于制备治疗胶质瘤的药物。
文档编号A61K31/7028GK101348514SQ20081015084
公开日2009年1月21日 申请日期2008年9月8日 优先权日2008年9月8日
发明者文爱东, 易杨华, 杨志福, 汤海峰, 光 程, 军 贠 申请人:中国人民解放军第四军医大学