专利名称：治疗或预防癌症的方法和药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗或预防癌症的方法和药物以及抗癌药物筛选方法。
背景技术：
人转录正辅因子4 (PC4，也称p14、 p15、 Subl的同源类似物等)是一种单链DNA结合蛋白，这种蛋白由127个氨基酸残基组成且靠近N-端有数个丝氨酸富集区。PC4已被克隆并鉴定为一种能通过与许多序列特异性和细胞特异性调节子直接作用来介导许多基因的转录活化的通用正辅因子(参见文献Ge等，Cel1(1994) 78: 513-523; Kretzschmar, M.等，Cell (1994) 78: 525-534)。 PC4直接作用的这些调节子包括许多核激素受体、肿瘤抑制子、癌蛋白、以及肿瘤的发生过程和其他人类疾病的病变过程中所必须的重要因子。
肿瘤抑制蛋白P53直接与PC4蛋白在转录水平发生相互作用，从而控制了PC4的表达。另外，PC4作为P53的唯一激活子可以调节许多参与细胞周期、凋亡、DNA修复和其他细胞应答的基因的转录(参见文献Kishore A.H.等，Biochem.J. (2007) BJ20070390; Banerjee， S.等，Mol. Cell Biol. (2004) 24:2052-2062)。 PC4的活性受到翻译后修饰的进 一 步调节，该翻译后修饰的类型至少包括磷酸化修饰和乙酰化修饰。PC4被磷酸化修饰之后，其与目标激活因子作用的活性被抑制且能反向介导其辅激活因子的功能。质谱分析结果表明体内的PC4超磷酸化修饰主要由酪蛋白激酶II介导且仅发生在N-端丝氨酸富集区(参见文献Ge等，Pro" Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12691-12695)。 PC4的乙酰化修饰由P300介导且受到磷酸化修饰的抑制(Kumor， P.B.R.等，J. Biol.Chem. (2001) 276: 16804-16809)。
到目前为止，大家还不清楚在调节基因中所起的作用是否与癌症或肿瘤的发生有关。
发明内容
发明人采用了包括爪蟾卵母细胞系、人体组织、其他哺乳动物细胞系在内的不同的模式生物体系，惊奇地发现PC4具有癌蛋白的功能且在细胞分化、肿 瘤发育和病变的过程中起重要作用，见图10示出的PC4的多种功能，所有这些功能，尤其是图10中标注下划线的功能，都与癌症发病机理相关或者是癌症发病的基础。特别是，发明人研究发现在很多恶性肿瘤组织中，如在肺癌组织、膀胱癌组织、结肠癌组织、乳腺癌组织、子宫内膜癌组织、甲状腺癌组织、小肠癌组织中，都发现PC4在蛋白水平被活化。相反，在相应的没有经历过快速生长的正常组织中的PC4的蛋白水平没有升高。在癌细胞系和其他转化细胞系中还发现了 PC4 RNA水平的升高，但是在原代细胞系中并没有发现。
例如，发明人测定了非洲爪蟾的变态发育过程中的PC4的表达水平。测定方法如下收集不同发育阶段的非洲爪蟾的整体溶解产物，监测每个溶解产物的蛋白含量，选取50ug每个阶段溶解产物中的总蛋白，上SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，然后将凝胶上的蛋白转到硝酸纤维膜上，最后进行蛋白印迹分析，即采用抗PC4的多克隆抗体来检测被转到硝酸纤维膜上的蛋白。测定结果如图5A、图5B和图5C所示，PC4的表达水平与非洲爪蟾蜍变态发育过程相关，当前变态发育开始时，PC4在56 58这个阶段被显著活化。
发明人通过转染检测实验证明PC4与细胞死亡相关。将人PC4编码区(野生型的或丝氨酸富集区突变型的人PC4编码区)与绿色荧光蛋白(GFP)的编码区融合后，再亚克隆到包含有CMV启动子哺乳动物表达载体(pcDNA3.1)中，再将得到合成载体瞬时转染到HeLa细胞(参见Ge等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1994) 91: 12691-12695)。转染后24小时，在激光共聚焦显微镜下观测样本，能观察到PC4在转染的HeLa细胞中所起的作用。结果如图6A、图6B、图6C所示，图6A是对照组(未转染的HeLa细胞)的荧光检测结果，图6B是转染了野生型PC4的HeLa细胞的荧光检测结果，图6C是转染了 N-端丝氨酸区突变型PC4(PC4-AS，其不能被磷酸化，所以应该是完全活化的)的HeLa细胞的荧光检测结果。三幅图对比可以看出，PC4位于细胞核中且能够导致染色体凝集和细胞凋亡，尤其是从图6C可以判断PC4的过量表达引发了凋亡，这一点与癌蛋白的作用是一致的。
另外，发明人还采用蛋白印迹分析法测定了许多组织中的PC4水平。收集手术后切除的不同的组织(恶性肿瘤组织的记为"T"，正常组织记为"N",由美国国立卫生研究院提供)，并快速冷藏到-80'C环境中直至使用。组织裂解液的制备过程如下向组织溶液中加入裂解缓冲液(裂解缓冲液体积为总体积的1/10)后，用微型高速搅拌器将其分散均匀。离心后收集溶液部分。检测所收集的溶液部分裂解物的蛋白浓度，可以采用Bradfort蛋白检测方法(BioRad蛋白，取50ug正常组织或恶性组织的组织裂解物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将凝胶上的蛋白转到硝酸纤维素膜上，最后进行蛋白印迹分析，即采用抗人PC4的多克隆抗体来检测被转到硝酸纤维膜上的蛋白。结果如图8B所示，该结果表明在很多人体肿瘤组织中，如肺癌组织、膀胱癌组织、结肠癌组织、乳腺癌组织、子宫内膜癌组织、甲状腺癌组织和小肠癌组织，都发现了 PC4，但是在相应的正常人体组织中都没有检测到PC4。
发明人还采用免疫组织化学分析检测了正常肺组织和肺癌组织中PC4蛋白的表达水平。用美国国立卫生研究院提供的正常肺组织或肺癌组织切片的载玻片样本做免疫组织化学分析。免疫组织化学分析过程如下先用二甲苯处理组织切片的载玻片，2次，每次15分钟；然后将其置入浓度依次递减的(从100% 70%)的乙醇中，每次孵育5分钟；在95。C下烘干5分钟后，依次用水和PBS漂洗，然后用3%牛奶封闭液进行封片；加一抗(即抗PC4的抗体)，室温孵育l小时；洗去多余的一抗后，向切片加标记有荧光的二抗，室温孵育30分钟；最后，漂洗载玻片，放置在荧光显微镜下能检测到PC4蛋白。如图9A和图9B所示，正常肺组织中没有检测到PC4蛋白，而在肺癌组织的所有癌细胞中都发现PC4蛋白的凝集。
发明人在所有经检测的转化细胞系(cos、 HeLa、 293)和三个乳腺癌细胞系((MCF7、MD231、MDA468)中都检测到了 PC4的mRNA，但是在原代NIH3T3细胞系和非恶性的大鼠组织(脑组织m-Brain，睾丸组织m-Testis)没有检测到PC4的mRNA。检测方法(Northern印迹分析)如下从上述这些不同细胞系或组织中提取总RNA且通过1%的甲醛-琼脂糖凝胶进行分离，凝胶上的RNA转到硝酸纤维膜上后，再将标记有32P的人PC4 DNA (h-PC4 probe)和人p52DNA(h-p52 probe)作为探针分别与所提取的总RNA杂交(将膜置于探针溶液环境中孵育一段时间)，用溴化乙锭(EtBr)染色法分别检测出各样品总RNA中PC4 mRNA和p52 mRNA的表达水平，即观测染色后的28S和18S核糖体RNA(参见文献Ge等，EMBO J. (1998) 17: 6723-6729)。检测结果如图7A、图7B、图7C所示。所述的p52是另一种在上述的各种细胞系和组织中都存在的转录辅激活因子。
发明人还将PC4在肿瘤组织中的活化与DNA拓扑异构酶I的活化进一步联系起来，如图8A、图8B所示。所述的DNA拓扑异构酶I是一种将DNA进行解旋的酶且为一些抗癌药物如NB-506, J-I09, J-382, DB-67的耙点(参见文献Pilch, B.等，Cancer Res. (2001) 61: 6876-6884; Chen, A.Y.等，Mol. CancerThera, (2005) 4: 317-324)。
许多癌基因和肿瘤抑制基因编码的蛋白，例如C-myc、 P53、 DNA拓扑异构酶I，也是大家熟知的能作为转录调节因子的蛋白，发明人经研究发现，PC4能够提高这些蛋白的活性。
以上事实能得出一个结论除了能起到转录辅激活因子的作用，人转录正辅因子4 (PC4)还能作为一种癌蛋白来激活细胞发育、分化、恶性转化和肿瘤侵袭生长。实际上， 一些采用DNA阵列方法的其他研究中，也发现了癌症病变过程中PC4在RNA水平的活化(Das， C.等，Mol. Cell. Biol. (2006) 26:8303-8315; Kleivi， K.等，Mol. Cancer (2007) 6: 1-16)。
基于发现了 PC4作为一种癌蛋白能在不同类型的人肿瘤的形成过程中起到重要作用，发明人以PC4为研究靶点发明了一系列诊断癌症的方法，预防、治疗癌症的方法和药物，以及筛选抗癌药物的方法。
本发明提供了诊断受试者癌症或其他恶性肿瘤的方法，该方法包含以下内容从受试者身上收集合适的组织样或液体样，检测所收集的样本中作为生物标记的PC4的表达水平，若其中的PC4的表达水平比对照样的高，说明样本为癌组织或恶性组织。为进一步的确诊，该方法还可以包含有检测其他相关生物标记的水平的步骤，例如检测DNA拓扑异构酶I的表达水平。
本发明进一步提供了一种检测受试者是否患有癌症或体内是否存在恶性肿瘤细胞的方法，该方法包含以下内容从受试者身上收集合适的样本，检测样本中作为生物标记的DNA拓扑异构酶I的表达水平，若其中的DNA拓扑异构酶I的水平比对照样的高，说明样本为癌组织或恶性组织。
上述的"受试者"包括人、其他可能会患癌症的动物。
本发明提供了一种通过降低细胞内PC4水平或抑制PC4的功能来预防或治疗癌症的药物，该药物中包含了有效剂量的合适的PC4拮抗剂。
相应的，根据本发明的发明构思，本发明还提供了一种治疗癌症的方法，即给患有癌症的受试者使用上述包含了有效剂量的合适的PC4拮抗剂的药物。经发明人研究表明，这类药物或者说相应的治疗方法可以被用来治疗肺癌、膀胱 癌、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、小肠癌和其他恶性肿瘤(参见 图8B)。
上述的包含有合适的PC4拮抗剂的药物不仅可以由于治疗，也可以用于预 防目的，防止人肿瘤的发生。
上述的治疗癌症的方法包括化疗、放疗、免疫疗法以及综合治疗。
上述的预防或治疗癌症的药物可以单独使用、也可以联合其他一种或多种 抗癌药物使用，共同达到预防或治疗癌症的有效剂量。
上述的预防或治疗癌症的药物中可以加入药学上接受的载体。
基于现有的生物学理论和技术，本发明进一步提供了一些合适的PC4拮抗 剂已修饰的或无功能的PC4多肽或蛋白、抗PC4的抗体、合适的反义核苷酸 分子、合适的小分子干扰RNA分子(siRNA)。
已修饰的或无功能的PC4多肽或蛋白
上述的PC4拮抗剂可以选择已修饰的或无功能PC4多肽或蛋白。PC4是大 家所熟知的一种多功能蛋白，已经证明了其绑定DNA以及在绑定DNA的同时 与其他蛋白发生相互作用的能力。目前大家已认识到一种已修饰的或无功能的 PC4突变体或其中的部分片段可能被野生型的或者未修饰的PC4所显性抑制， 或者可能以隐性状态存在于细胞中。或者，已修饰的或无功能的突变体、类似 物或其中的部分片段可能与野生型或未修饰的蛋白竞争，从而有效地削弱野生 型或未修饰的蛋白的功能。例如，由于磷酸化的PC4是失活的(尤其是N-端丝 氨酸富集区被磷酸化修饰后的PC4失活)，它也能够被用来与未磷酸化的PC4 (活性形式)竞争从而达到治疗目的；另外，目前研究表明，其中包含有第77 个位点的苯丙氨酸单个氨基酸突变(F77P)或者与该突变等效的突变的PC4蛋 白或多肽失去了与DNA绑定的活性，因此根据本发明的发明构思，可以推断这 种无功能PC4多肽或蛋白具有抗癌方面的药学用途。有这种类似功能的模拟肽 或模拟肽组合物可能会成为一种急需有待研发的癌症治疗药剂，由于它们能够 防止动物的免疫系统或蛋白代谢机制遭到破坏。
本发明还进一步提供了一些突变型PC4蛋白作为PC4拮抗剂(治疗依赖于PC4的肿瘤的药物)。
之前已经报导过N-端丝氨酸富集区对于PC4蛋白的活性来说是必需的，且 受到酪氨酸激酶II的磷酸化作用的调节，删除N-端区导致PC4蛋白的辅激活 作用完全丧失(Ge等，1994a; 1994b; Kretzschmar等，1994)。发明人通过制 造一系列的单个氨基酸突变，定位了一些对PC4蛋白的活性来说是必不可少的 重要氨基酸。由此，发明人筛选出7种突变型PC4蛋白，如图2所示，mt-l(K231/ K29A)、mt-2(K35I/K41A:)、mt-3(R27A/K28I/K29A)、mt-4( R47N/K35I/K41A)、 mt-5 (F77P)、 mt-6 (K29A)、 mt-7 (K41A)。经实验研究证明，除了已知的第 77个位点发生了单个氨基酸突变(F77P)的PC4丧失了结合DNA的能力和转 录活性，在N-端基本区发生双重突变(K23I/K29A和K35I/K41A)和三重突变 (R27A/K28I/K29A)的PC4蛋白的活性也大大降低了 ，因此PC4突变体F77P、 K23I/K29A、 K35I/K41A 、 R27A/K28I/K29A能用作抗癌药物，通过与内源的 野生型PC4竞争来达到治疗依赖于PC4的恶性肿瘤的效果。
本发明还提供了与PC4的激活结构域的氨基酸序列同源的短多肽作为PC4 拮抗剂。
PC4，作为一个通用的转录辅激活因子，它的活性表现为与其他通用转录因 子、转录激活因子、DNA模板之间的相互作用，因此激活结构域对于PC4实现 其功能是必须的。由此，发明人设计合成了两个多肽，它们的序列分别与两个 PC4激活结构域氨基酸序列一致，这两个多肽能与野生型PC4竞争结合其他激 活子，从而达到抑制PC4活性的作用。这两个多肽序列为PC4的氨基酸序列 中第16-30个氨基酸(DSDSEVDKKLKRKKQ，见SEQ ID NO.3)和第26-40 个氨基酸(KRKKQVAPEKPVKKQ,见SEQ ID NO.1)序列。
本发明还提供了能与PC4结合的模拟激活结构域多肽作为PC4拮抗剂。 由于PC4的致癌活性是通过其作为转录辅激活因子去激活全部或绝大多 数的癌基因、生长因子或其他致癌因子的表达来实现的(PC4与所述癌基因、 生长因子或其他致癌因子的特异性激活子相互作用来激活它们的表达)，因此， 抑制PC4蛋白去结合内源激活子能使PC4蛋白失去其辅激活子活性。发明人经 研究发现了一个有15个氨基酸的两亲性螺旋多肽(amphipathic helix peptide, AH peptide)能够模拟一种激活结构域与PC4发生强相互作用，从而封闭了 PC4的激活子结构域，抑制PC4与内源激活子作用，抑制了PC4的功能，达到治疗 目的。该多肽的序列为ELQELQELQALLQQQ，见SEQ ID N0.5。
作为本发明的进一步改进，PC4拮抗剂还包括连接有迁移结构域的多肽或 蛋白类PC4拮抗剂。
为了促进多肽或蛋白类PC4拮抗剂进入肿瘤细胞，使得其能够靶向核内癌 蛋白PC4，可以通过将迁移结构域(translocation domain, TLD)与重组单克 隆抗体、突变型PC4蛋白、与PC4的激活结构域的氨基酸序列同源的多肽、能 与PC4结合的模拟激活结构域或其他能够抑制PC4活性的蛋白或多肽等融合来 实现。
本发明采用了一种包含有12个氨基酸的短多肽作为迁移结构域，其序列为 PLSSIFSRIGDP，见SEQ ID NO.7，分子量为1288.47，等电点pl=6.27。据报 道，这种多肽对于乙型肝炎病毒的感染和一些其他蛋白的细胞渗透性来说是必 不可少的(Oess and Hildt 2000; Stoeckl et al" 2006)。
抗体
本发明提供了一些能够抑制PC4蛋白或抑制PC4蛋白和DNA拓扑异构酶I (这两个蛋白以下也称靶蛋白)的生物学活性的中和抗体。本发明的抗体为基 于现有生物学技术能够得到的抗PC4抗体，优选单克隆抗PC4抗体，也可以选 择包含有所述单克隆抗PC4抗体的多克隆抗体。所述的单克隆抗PC4抗体包括 了 PC4的亚型特异性抗体。
根据本发明的发明构思，上述的单克隆抗PC4抗体为能够特异性结合靶蛋 白的抗体，抗体中的抗原结合片段也称抗原性片段，抗原性片段可以是Fab片 段、F(ab)2片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fd'片段或者Fv片段。 一般的单克隆抗PC4抗体中包含了抗原性片段，当然单克隆抗PC4抗体也可以 选择这些抗原性片段(即单价抗体)。最好选择抗原表位，即当抗体进入体内后 被抗原识别的位点。单克隆抗PC4抗体首选小鼠单克隆抗体或其中的抗原性片 段、抗原表位。除了单价抗体，结构域抗体(dAbs)(参考文献Holt等，Trends in Biotechnology (2003) 21: 484-490)也适用于本发明的抗PC4抗体。
若为治疗人，应该采用人源化抗体，最好是人源化天然抗体。
制造已知抗原的抗体的方法有很多种，这是本领域技术人员所熟知技术(参
12见美国冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)出版的《Antibodies: A Laboratory Manual》，Harlow and Lane, 1988;或参见国际专利第01/25437号)。
可以采用体内免疫法，用源自靶蛋白上的具有免疫原性的组分来免疫人或 其他动物宿主，再从动物宿主中提取抗体；可以通过免疫人或除人以外的动物 来获得上述的抗体，优选哺乳动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、山羊、绵 羊、猪，或者鸟类(如鸡)，进一步优选小鼠。
也可以采用体外免疫的方式从免疫细胞中提取抗体。体外免疫法优选采用 重组表达技术生产抗体，例如用合适的编码抗PC4抗体的DNA来转化、转染、 感染或转导适合的细胞系，得到重组系统能表达生产抗PC4抗体；也可以采用 本领域所熟知的杂交瘤技术来制备抗体；
或采用生物重建的方式，直接将已纯化的重链和轻链构建成抗体；
特别是，还可以选择化学合成的方法获得合适的抗体，或者采用细胞内免 疫的方法(例如胞内抗体技术，在胞内表达抗PC4抗体)。
另外，本发明的抗体还包括了嵌合抗体和杂合抗体。 一些文献中描述了制 备嵌合抗体和杂合抗体的技术(Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， (1984) 81: 6851-6855; Neuberger等，Nature, (1984) 312: 604-608; Takeda 等，Nature ( 1985)， 314: 452-454)。
进一步的，单链抗体也适用于本发明(参见发明人为Huston的两个美国专 禾!j:第5，476，786号和第5,132,405号；Huston等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，
(1988) 85: 5879-5883;发明人为Ladner等人的第4,946,778号美国专利； Bird, Science. ( 1988) 242: 423-426; Ward等，Nature. ( 1989) 334: 544-546)。
所述的单链抗体是一种由单一肽链组成的小分子抗体，合成方法在抗体重链 和轻链可变区(Fv)基因之间，用一段短肽基因将两者连接成ScFv基因，该基因 的表达产物可折叠成具有抗原结合能力的单链多肽。
抗体的给药途径可以采用本领域技术人员所熟知的一些药物输送途径，例 如直接注射可能比较适合将抗体释放到需治疗的位点。也可以采用其膜内包 裹有抗体的脂质体，将脂质体定向输送到靶点，从而使这里的目标基因的表达
或功能被抑制。除了单克隆抗PC4抗体，所述的脂质体中还可以包含一些其他 药剂，例如上述的一些能够被释放到治疗靶点的药剂(参见文献，Wolff等， Biochem. et Biophys. Acta, ( 1984)802: 259)。反义核苷酸分子
在本发明还提供了采用反义寡聚核苷酸分子来抑制PC4基因或者抑制PC4 基因和DNA拓扑异构酶I基因(这两个基因以下简称目标基因)的表达的方法。 本领域公知的，细胞中的反义RNA的表达，特别是组成性表达，能够抑制基因 的表达(可能是通过阻断翻译或防止剪接的方式来抑制基因的表达)。基于这一 点，干扰剪接使得那些保守性较差而产生较强特异性的内含子序列能发挥作用， 从而能抑制一个物种中相应基因产物的表达，但不抑制其他物种中的这种基因 产物的同源物的表达。
术语"反义组分"是指与一个特定的mRNA分子充分互补的RNA或DNA 分子。反义RNA分子是特异的，反义RNA与mRNA发生分子杂交会导致mRNA 的翻译受到抑制。所述的分子杂交能在体内环境下发生。本发明的反义RNA分 子必须具有足够的与目标基因互补的能力，长度大约15 30个核苷酸，这样一 来反义RNA分子能与目标基因(或者mRNA)杂交来抑制目标基因的表达，无 论杂交是发生在剪接水平、转录水平还是翻译水平。本发明的反义RNA分子选 择能够与目标cDNA中的包括编码区序列、3，或5'非编码区序列或其他内含子 序列在内的任意一个部分杂交的RNA分子，或者是能够与目标mRNA杂交的 RNA分子。至于如何设计反义核酸分子，在已知mRNA序列的基础上，根据已 有技术，反义核酸分子序列可以很容易地设计出来。
本发明的反义RNA分子，可以采用转化或转染的方式，由载体运送进入宿 主细胞，所述的载体类型包括逆转录病毒载体和质粒，连接编码反义RNA的 DNA与合适的包含有启动子的调节序列，连接后一同置入所述的载体中，从而 反义RNA能在宿主细胞中表达。在一个实施方案中，包含有编码反义RNA分 子的cDNA片段的载体实现了稳定转染和组成性表达，或者这种表达可能是在 组织特异性或发育特异性的启动子的控制下实现的。也可以使用脂质体将反义 RNA分子运送进入细胞。
针对体内治疗，目前现有的首选方法是直接将反义RNA分子运送到靶点， 而不是通过稳定转染其上构建了编码反义RNA分子的cDNA片段的表达载体。 本发明的反义寡聚核苷酸分子具有15到30个碱基的长度，其序列决定了该反 义寡聚核苷酸分子是否能够与目标cDNA中的包括编码序列、3'或5'非编码区 或其他内含子序列在内的任意一个部分杂交，或者优选的，是否能与目标mRNA杂交。与目标基因杂交的反义寡聚核苷酸分子的序列最好选用那些具有最强的 反义能力的序列。反义寡聚核苷酸序列分子上的反义能力由以下几个因素来决 定反义寡聚核苷酸的长度、绑定亲和性、目标序列的可及性。在体外筛选反 义能力强的反义寡聚核苷酸分子，可以通过体外检测其抑制目标蛋白翻译的能 力和抑制与目标基因相关的显型的能力，例如，抑制培养基中细胞增殖的能力。 一般来说，目标cDNA的大多数区域(5，和3，非编码区，AUG起始区，编码 区，剪接点和内含子序列)都能够利用反义寡聚核苷酸来定位。
本发明的反义寡聚核苷酸分子优选那些稳定的、有强抗核酸酶能力的、具 有合适的药物动力学性能使其能以无毒剂量到达目标组织、且有能力穿过质膜 的寡聚核苷酸分子。
根据现有技术，反义RNA分子的化学修饰主要集中在磷酸二酯骨架、碱基、 糖环，这些修饰可以提高反义RNA分子的稳定性或与目标cDNA或mRNA杂 交的能力。本发明的反义寡聚核苷酸分子优选磷硫酰化反义寡聚核苷酸分子(反 义寡聚核苷酸分子的磷酸二酯键被磷硫酰化修饰后得到磷硫酰化反义寡聚核苷 酸分子)。磷硫酰化反义寡聚核苷酸分子的基本结构也可以被修饰使其反义能力 得到进一步优化。另外，也已经发现了 N3，-P5，氨基磷酸酯键能够使得寡聚核 苷酸分子在核酸酶的存在下稳定且能提高反义寡聚核苷酸分子与RNA之间的绑 定结合力。肽核酸键(PNA)全部取代了核糖和磷酸二酯骨架使其能够在核酸 酶的存在下稳定，不会被RNAH酶切，且提髙了反义寡聚核苷酸分子与目标基 因或mRNA之间的亲和力。关于碱基的修饰，经证明，碱基被一些杂环修饰后， 能增强反义寡聚核苷酸分子的反义能力且使得反义寡聚核苷酸分子不会被RNA H降解，例如，C-5噻唑修饰。最后，也可以考虑糖环的修饰，例如用2，-氧-丙垸基、2，甲氧乙氧基取代核糖使得寡聚核苷酸能在体外细胞培养基中或体内的 环境中保持对核酸酶的稳定性。
本发明的反义寡聚核酸分子的给药途径应选择一些能提供最佳反义效果 (根据上述的标准来测定)的途径。反义寡聚核酸分子的体内和体外测试结果 表明以阳离子脂质体、逆转录病毒载体为载体来输送反义寡聚核酸或者直接给 药的药效较好。另一种可能的给药模式是利用能与靶细胞表面特异性标记结合 的抗体来将反义寡聚核酸分子靶向输送到目的细胞。抗体与靶细胞结合或与其 上受体的结合都能达到靶向输送的目的。
15小分子干扰RNA
在本发明还进一步提供了能够抑制目标基因表达的小分子干扰RNA (small interfering RNAs，简称siRNA,也称RNAi，也称RNA干扰核酸)。小分子干 扰RNA是一种双链RNA分子，典型长度为21个核苷酸(iit)，若其与目标基 因同源，则可以干扰目标基因的表达。
RNAi技术与真核细胞中的序列特异性的转录后基因表达过程有关。 一般来 说，这个过程中涉及到特定序列的mRNA降解，该降解由与这段特定序列同源 的双链RNA (dsRNA)所引发。例如，与特定的单链mRNA (ss mRNA)序列 相对应的长dsRNA的表达会使得遗传信息的传递变得不稳定，从而干扰了相应 基因的表达。引入与任意选定基因mRNA的全部或绝大部分序列相对应的 dsRNA都会抑制该基因的表达。据目前的研究看来，当一段长dsRNA表达时， 它首先被核糖核酸酶III酶切成长度仅为21 22个碱基对的短dsRNA。因此， siRNA会因为这些与之同源的短dsRNA的引入或表达受到直接影响。
哺乳细胞中至少有两条途径受到dsRNA的影响。
在序列特异性途径中，如上所述的，初始dsRNA先被酶切成多个小分子干 扰RNA ( siRNA)。这些siRNA由长度约为21个核苷酸的正义链和反义链组成， 每条链由19个起干扰作用的核苷酸和3'端的两个游离核苷酸组成。小分子干扰 RNA被认为是能够提供了一定的序列信息使得相应特定序列的mRNA被耙向降 解。
相反，而非特异性途径可以由任意序列的dsRNA引发，只要该dsRNA长 度至少大于30个碱基对。非特异途径的引发是由于dsRNA激活了两个酶PKR 酶和2'，5'寡腺苷酸合成酶(2'， 5'-AS)。 PKR酶处于活性状态时，可以通过磷酸 化翻译起始因子elF2来关闭所有蛋白的合成；2'，5'寡腺苷酸合成酶能合成一种 激活核糖核酸酶L (RNase L)的分子，而RNase L是一种能降解所有mRNA 的非特异性酶。非特异性途径通常代表宿主对外界压力和病毒感染的反应，一 般来说，非特异性途径的作用最好是被降到最低水平。很明显，较长的dsRNA 只能诱导非特异性途径，因此，长度不足30个碱基对的dsRNA最好是通过RNA 干扰(RNAi)即序列特异性途径来影响基因的表达(参见Hunter等，J. Biol. Chem. ( 1975) 250: 409-417; Manche等，Mol. Cell. Biol. ( 1992) 12: 5239-5248; Minks等，J. Biol. Chem. ( 1979 ) 254: 10180-10183; Elbashir等，Nature( 2001) 411: 494-498)。经证明，RNA干扰是一种降低基因表达水平的有效手段，且对大多数类型 的细胞都适用，例如HeLa细胞，NIH/3T3细胞，COS细胞，293细胞和BHK-21 细胞。特别是与采用反义核酸相比，siRNA能将目的基因表达降到更低水平， 并且事实上，siRNA经常能使得目的基因完全不表达(参见Bass， Nature ( 2001) 411: 428-429)。另外，对于降低哺乳细胞中目的基因表达水平，同等条件下， siRNA的有效剂量比反义RNA的有效剂量低几个数量级(Elbashir等，Nature (2001) 411: 494-498)。
RNA干扰优选长度小于30个碱基对的双链寡聚核苷酸，进一步优选长度为 25、 24、 23、 22、 21、 20、 19、 18、 17个碱基对的双链RNA。长度为21个碱 基对的siRNA效果较好。包含有游离的3，端siRNA效果较好。典型的游离3， 端有两个游离的核苷酸，这两个核苷酸可以由任何类型的核糖核苷酸残基组成， 优选2'-脱氧核糖核苷酸，在细胞培养基中和转染细胞中，采用2'-脱氧核糖核苷 酸组成的游离3'端不仅降低了 RNA合成成本，并可增强了 siRNA抵抗核酸酶 酶切的能力(参见Elbashi等，Nature (2001) 411: 494-498)。
较长dsRNA分子，例如具有50个、75个、100个甚至是500个或更多的 碱基对的大分子dsRNA ，也可以在本发明的特定的实施方案中得到应用。为达 到RNA干扰效果所采用的dsRNA的标准浓度约为0.05nm、 O.lnm、 0.5nm、 l.Onm、 1.5nm、 25nm或100nm，虽然也可以采用其他浓度，这取决于所处理 的细胞类型、所针对的目标基因以及其他相关因素。
较长dsRNA分子的合成可以从启动子转录合成长链dsRNA，所述的启动 子如本领域熟知的T7RNA聚合酶启动子。抑制单个目标基因的长dsRNA分子 的合成从体外转录本的启动子下游的目标位点起，向两个不同方向同时合成 互补的RNA分子，并随即组装成相应的dsRNA。在设计上述这些dsRNA分子 时，必须考虑到每个RNA分子都应该包含有一部分与目标基因mRNA同源的 核苷酸序列。
siRNA的基本合成方法采用化学方法合成或者构建合适的表达载体在体 外或体内合成。化学方法合成的标准RNA由21个核糖核苷酸组成。合成的 siRNA可以采用凝胶分离方法进行纯化。(Elbashir等，Genes Dev (2001) 15: 188-200)。
在设计siRNA序列时，可以选择与目标基因mRNA的编码序列相邻的任 意一段核苷酸序列作为特异性序列，也就是说，设计本发明的siRNA时可以选择与PC4 mRNA上的编码序列相邻的任意一段核苷酸序列作为特异性序列。另 外，如何从这些核苷酸序列中挑选最佳的特异性序列了？ 一般采用一些现有的 序列设计软件。首先利用这些软件程序预测目标基因mRNA的二级结构，再来 挑选那些很可能出现在折叠mRNA上的裸露单链区的序列。设计合适的siRNA 的所采用的方法和材料，可以参考美国专利第6，251，588号文件中记载的相应内 容。
虽然mRNA通常被认为是线性分子，其核苷酸序列中包含了直接指导蛋白 合成的信息，但实际上，大部分的mRNA都显示出包含有很多二级和三级立体 结构。RNA上的二级结构单元是通过同一 RNA分子中的不同区域之间发生相互 作用而形成，所述的相互作用主要是Watson-Crick类型的相互作用。重要的二 级结构单元包括双链RNA(dsRNA)以及内环区中由分子内形成的双螺旋结构、 发夹结构、以及突环结构。当二级结构单元之间发生相互作用或二级结构单元 与单链区发生作用时所形成的更为复杂的三维结构为三级结构单元。很多研究 者测定大量RNA双链体结构中的结合能量，因而得出了一系列能够用来预测 RNA 二级结构的规则(例如参见Jaeger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1989) 86: 7706; Turner等，Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. ( 1988) 17: 167)。 这些规则能帮助识别mRNA结构单元，特别是对于识别裸露单链区域，这些 mRNA上的裸露单链区域可能会成为siRNA、核酶或反义RNA所靶向的最佳靶 片段。相应的，识别PC4 mRNA上的最佳耙片段能用来设计基于本发明构思的 具有RNA干扰效果的dsRNA寡聚核苷酸、合适的核酶和锤头形核酶组合物。
上述的具有RNA干扰效果的dsRNA寡聚核苷酸可以连同一个异源的靶基
因一起通过载体试剂转染的方式导入细胞，所述的载体试剂如本领域熟知的脂
质体一例如Life Technologies公司生产的针对贴壁细胞系的脂质体转染试剂
Lipofectamine 2000。靶向内源基因的dsRNA寡聚核苷酸的转染载体可以选用
Life Technologies公司生产的脂质体转染试剂Oligofectamine。转染效率还可以
通过如下方式检测将dsRNA寡聚核苷酸和hGFP-encoding pAD3在哺乳细胞
系共转染表达后，利用荧光显微镜技术检测其转染效率(参见Kehlenback等，
J.Cell.Biol. ( 1998) 141: 863-874)。 dsRNA导入细胞后，其RNA干扰效率可
以采用很多方法来检测。这些方法包括蛋白印迹分析(Western blot analysis)、
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Northern杂交分析(Northern blot analysis),
所述的蛋白印迹分析是指等待内源基因库完成一次周转代谢，新一轮蛋白合成
18被抑制后，采用抗体来识别目标基因产物(PC4)的方法；逆转录聚合酶链反应
和Northern杂交分析可以测定目标基因mRNA ( PC4 mRNA)的水平。
关于RNAi技术所采用的试剂、方法和应用在美国专利第6278039、 5723750
和5244805号中有进一步介绍，列在此处可作参考。
本发明的另一个目的是提供抗癌药物的筛选方法，该方法是基于PC4是一
种癌蛋白且可以作为抗癌药物靶点这一科学发现。
基于启动子的筛选方法
技术领域：
本发明的筛选抗癌药物的方法，该方法包含以下两个依次发生的步骤(1) 提供一种基因构建体，其包含PC4基因的启动子序列以及与该启动子序列有效 连接的报告基因；(2)将候选药物和所述的基因构建体混合置于适合所述的报 告基因表达的环境中，其中，抑制报告基因表达的候选药物为抗癌药物。
PC4基因启动子序列，参见图1A。与该启动子序列有效连接的合适报告基 因，可以选择如荧光素酶基因或绿色荧光蛋白基因。本领域的技术人员应该能 认识到，除了本申请文件中所提供的示范序列以外，还有许多合适的PC4基因 启动子序列或一些PC4基因的其他顺式作用转录因子也能应用到基于本发明构 思的抗癌药物筛选方法。
除了上述的基于启动子的筛选方法，本发明的抗癌药物筛选方法还可以采 用基于蛋白活性的检测方法。
依赖于PC4蛋白的转录活性检测方法
技术领域：
本发明还提供了一种筛选抗癌药物的方法，该方法包含以下两个依次发生 的步骤(1)提供一种检测PC4蛋白的转录水平的试验；(2)向上述的试验中 加入候选药物，其中，降低PC4转录水平的候选药物为一种抗癌药物(参见Ge 和Roeder， Cell (1994) 78: 513-523)。
基于蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用的检测方法
技术领域：
本发明还提供了另一种筛选抗癌药物的方法，该方法包含以下两个依次发 生的步骤(1)提供检测PC4与蛋白之间相互作用或PC4与DNA之间相互作 用的试验；(2)向上述的试验中加入候选药物，其中，降低PC4与蛋白之间相 互作用或PC4与DNA之间相互作用的候选化合物为抗癌药物(参见Ge， NucleicAcids Res. (2000) 28， e3)。
优选高通量系统(HTS)筛选抑制PC4蛋白活性的化合物。 在高通量筛选检测中，通常应用荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer, FRET)来对分子动力学(例如蛋白-蛋白相互作用、 蛋白-DNA相互作用、蛋白构象转化等)进行定量。基于荧光共振能量转移技术 的高通量筛选检测系统一般采用96孔板或384孔板标准。
筛选本发明的抑制PC4蛋白活性的化合物用标记有荧光的两亲性螺旋 (AH)结构域多肽作为能量供体，标记荧光的PC4蛋白作为能量受体。 一旦 PC4和两亲性螺旋结构域多肽形成复合体，即由于两个分子之间的相互作用力 使得供体和受体之间距离很近(距离约l 10nm),此时观测到的主要是PC4 的发射光，因为分子间的荧光共振能量从两亲性螺旋结构域多肽转移到PC4蛋 白。两亲性螺旋结构域多肽的激发光和PC4的发射光受到荧光密度读板仪的监 测。任何化合物的抑制PC4蛋白活性的作用都能通过监测所读取的荧光密度、的 变化来测定。 一般筛选两类化合物1)小分子合成物；2)天然化合物。当然， 这些化合物还需得到进一步证实，证明其能够成为一种有潜力的治疗依赖于 PC4的恶性肿瘤的候选抗癌药。
本发明的诊断癌症或筛选抗癌药物的方法是基于蛋白质或基于核酸的检测 方法，这些方法都是本领域技术人员所熟知的常规方法。抗PC4抗体和抗拓扑 异构酶I抗体都是一些熟知的且能在市场上买到的抗体。例如，与纳米金粒子 共价交联的抗体，可以从BioassayWorks公司买到(Ijamsville， Maryland),这 种抗体能够用来快速地定量地监测PC4蛋白的水平或拓扑异构酶I的水平。同 样的，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)能够在RNA水平监测PC4和拓扑异构 酶I的活化水平。
综上所述，发明人发现了 PC4与癌症相关，开拓了抗癌研究新领域，且由 此发明了一系列的癌症诊断方法与试剂(基于检测PC4的表达水平)，以及治疗 和预防癌症的方法与药物(基于抑制PC4的功能与表达)、筛选抗癌药物的方法 等。
图1A、图1B、图1C提供了人PC4基因的序列信息；其中，图1A提供了 人PC4 cDNA序列以及启动子区域，启动子区域标注了下划线(参见GenBank 序列号NM—006713);图1B提供了人PC4编码区的DNA序列；图1C提供了 人PC4蛋白(127个氨基酸)的氨基酸序列，第77个氨基酸(F:苯丙氨酸， 被标注了下划线)位点若发生单个氨基酸突变，会使得PC4丧失与单链DNA结 合的能力；
图2示出了 PC4 N-端区突变分析图谱，所述N-端区包含基本区和第77个 氨基酸；其中，WT表示野生型，mt表示突变型，mt-l 7分别代表了本发明 的7个不同的突变型PC4蛋白；
图3A、图3B、图3C示出了 PC4突变体(mt-l 7)的功能分析图谱；其 中，图3A示出了各种纯化的重组PC4蛋白的检测标准化；图3B示出了图3A 所检测的各种蛋白的电泳迁移率变动分析(EMSA)实验结果，即检测各蛋白与 dsRNA的结合活性)，图中的PC4+DNA是指PC4与dsDNA的复合体；图3C 示出了图3A所检测的各种蛋白的体外转录检测实验结果，其中pG5HM是依赖 于PC4的转录模板，pMLA53是不依赖于PC4的转录模板；
图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F示出了野生型PC4蛋白和各 种突变型PC4蛋白的蛋白阵列分析结果；其中图谱左侧的5和40代表了两个不 同的蛋白浓度(单位pmol)，图4C示出了各蛋白与转录因子TFIIA (p55)之 间的相互作用结果；图4E示出了各蛋白与转录因子Spl之间的相互作用结果； 图4F示出了各蛋白与ssDNA之间的相互作用结果；图4A示出了丽春红 (Ponceau S)染色结果，该实验是检测各蛋白是否巳成功转到硝酸纤维膜上； 图4B示出了抗-PC4抗体(anti-PC4)与各蛋白之间的相互作用结果，该实验是 为了检测转到膜上的各蛋白的量是否一致；图4D是空白对照结果，检测各蛋白 与Gal4 (1-94)之间是否有非特异性结合；
图5A、图5B、图5C的结果说明了 PC4的表达水平与非洲爪蟾变态发育的 关系；每列凝胶条带代表不同的变态发育阶段；其中，图5A和图5B分别示出 了 2 58和56 64各阶段的PC4的表达水平，图5A中"O"代表了卵母细胞 (oocytes), "E"代表了胚胎(embryos), PC4-P表示磷酸化的PC4蛋白(失 活的)；图5C示出了 PC4活化与非洲爪蟾分化发育的关系，其中示出了甲状腺 激素(T3和T4)的表达水平曲线和甲状腺激素受体(TRaaiidTRp)的表达水 平曲线与PC4表达水平曲线作为对照；图6A是对照组(未转染的HeLa细胞)荧光检测结果；图6B是转染了野 生型PC4的HeLa细胞的荧光检测结果，图6C是转染了丝氨酸区突变型PC4 (PC4-AS)的荧光检测结果，阐明了当PC4被转染到Hela细胞中时，PC4位 于细胞核中且能导致染色体凝集和细胞死亡。
图7示出了 PC4mRNA的检测结果；所选择的检测样品如下转化细胞系 (cos, HeLa and 293)、三个孚L腺癌细胞系((MCF7， MD231 and MDA468)、原 代细胞系(NIH3T3 )、大鼠正常组织(脑m-brain和睾丸组织m-Testis );图7A 表示各样品中总RNA的丰度测量结果；图7B示出了 p52 mRNA的表达水平(即 p52的表达谱)作为对照；图7C示出了 PC4 mRNA的表达水平；
图8A和图8B分别示出了各种肿瘤组织以及相应的正常组织中DNA拓扑 异构酶I和PC4的蛋白印迹分析结果，其中，Kidn(肾组织)、Lung(肺组织)、 Bladd (膀胱组织)、Colon (结肠组织)、Prost (前列腺组织)、Breast (乳腺组 织)、Pancrs (胰腺组织)、Eiidomt (子宫内膜组织)、Thyro (甲状腺组织)、 S-Bow(小肠组织)，N表示正常组织，T表示恶性组织(肿瘤)，PC4a表示具 有活性的野生型，PC4b表示具有活性的亚野生型；
图9A和图9B分别示出了检测人体正常肺组织和肺癌组织中PC4表达水平 的免疫组织化学分析结果；
图IO示出了 PC4的多种功能；所有的这些功能尤其是标注下划线的与癌症 相关或者与癌症的发病机理相关，因此PC4可能会成为很多抗癌药物的治疗耙 点。
具体实施方式
以下结合实施例和附图来进一步阐述本发明。
实施例1
突变型PC4蛋白
发明人通过制造一系列的单个氨基酸突变，定位了一些对PC4蛋白的活性 来说是必不可少的重要氨基酸。由此，发明人筛选出可以作为PC4拮抗剂的7 种突变型PC4蛋白，如图2所示图谱，mt-l(K231/ K29A)、 mt-2 ( K35I/K41A )、 mt誦3( R27A/K28I/K29A)、 mt誦4( R47N/K35I/K41A)、 mt-5( F77P)、 m"6( K29A)、 mt-7 (K41A)。发明人还将上述7种突变型PC4蛋白进行了重组构建、表达、纯化、鉴定， 具体如下。
突变体的重组构建方法将细菌表达载体中的PC4野生型区置换成包含有
特定点突变的双链寡聚核苷酸从而产生各种不同的突变构建体(包含有特定点 突变的双链寡聚核苷酸可以商业合成得到)。
每个突变构建体都要进行测序分析且在E coli中表达后才能被确认。在E coli中的表达PC4蛋白(包括野生型和突变型)可以通过如下的2步纯化法得
到第一步Pll磷酸纤维素离子交换层析；第二步肝素亲和层析。纯化后
蛋白的浓度可以通过Bradford方法测定，纯度可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)测定。纯化后的PC4蛋白(WT， mt-l 7)上SDS-PAGE，电 泳结果如图3A所示。
采用以下方法检测纯化后PC4蛋白的活性l)电泳迁移率变动分析实验(结 果见图3B); 2)体外转录检测实验(结果见图3C); 3)蛋白阵列分析(结果见 图4)，这三种方法具体操作如下
1) 采用电泳迁移率变动分析法(Electrophoresis mobility shift assay ， EMS A )检测PC4蛋白绑定dsDNA的能力
EMSA的操作如下配置20ul反应体系(其中包含有10ng己纯化的各种 PC4蛋白样品)和标记有32P的长度为64bp的dsDNA探针(来源于腺病毒主 要晚期启动子区)，将两者混合后所得的反应混合物置于4'C温育1小时后，上 8。/。聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过放射自显影可以检测到移动的PC4-dsDNA复合 体。如图3B所示，mt-l、 mt-2、 mt-3、 mt-5都丧失了与dsDNA绑定的能力。
2) 体外转录检测实验
利用从HeLa细胞或从一个重组体系中纯化的通用转录因子，如TFIIA， TFIIB， TFIID， TFIIF， TFIIH， RNA聚合酶II等来在体外重建转录检测实验。 这个体外转录体系的激活依赖于PC4和其他激活子(参见Ge等，1996)。除了 上述的这些通用转录因子，该转录体系还包含一个响应激活子的模板(pG5HM 是依赖于PC4的转录模板)、 一个不依赖于激活子的基本模板(pMLA53是不 依赖于PC4的转录模板)和"P-CTP。该转录体系中3(TC温育1小时后，萃取 新合成的RNAs，将其进行SDS-PAGE分析，再放射自显影。结果如图3C所示， mt-l、 mt-2、 mt-3、 mt-5基本丧失了 PC4蛋白作为转录辅激活子的功能。
3) 蛋白阵列分析实验
23蛋白阵列分析实验是基于"通用蛋白阵列"(也称UPA)的方法(参见文献 Ge 2000)。将大量已纯化的蛋白在按一定排列规律固定在硝酸纤维膜上，形成 密集的点阵列，每点直径约lmm，包含有10 100ng的蛋白(取决于蛋白的大 小)。与点阵列上的PC4蛋白发生相互作用的靶蛋白能够利用特异抗体(例如抗 转录因子TFIIA、 Gal4、 Spl的抗体)检测出来，结果图4C、图4D、图4E。
若检测蛋白与DNA的相互作用，利用放射自显影技术监测标记有32P-dCTP 的探针DNA和已被绑定的DNA。结果如图4F所示。
由图4可以看出，第77位点的苯丙氨酸对于PC4结合ssDNA来说是必不 可少的。另外，F77P突变型PC4与转录因子TFIIA和Spl的相互作用显著增 强。
综上所述，除了第77个位点发生了单个氨基酸突变(F77P)的PC4丧失 了结合DNA的能力和转录活性，上述结果证明在N-端基本区发生双重突变 (K23I/K29A和K35I/K41A)和三重突变(R27A/K28I/K29A)的PC4蛋白的 活性也大大降低了，因此PC4突变体F77P、 K23I/K29A、 K35I/K41A 、 R27A/K28I/K29A能用作抗癌药物，通过与内源的野生型PC4竞争来达到治疗 依赖于PC4的癌症的效果。
实施例2
与PC4的激活结构域的氨基酸序列同源的短多肽
发明人设计合成了两种多肽，它们的序列分别与两个PC4激活结构域氨基 酸序列一致，经发明人通过上述的蛋白阵列分析(蛋白-蛋白之间相互作用检测 实验)和体外转录检测实验证明了这两种多肽能与野生型PC4竞争结合其他激 活子，从而达到抑制PC4活性的作用。
PC4-AD15，序列KRKKQVAPEKPVKKQ,见SEQ ID No.l;
以及相应的连接有迁移结构域的短多肽，如TLD-AD15 ，序列 PLSSIFSRIGDPKRKKOVAPEKPVKKO，见SEQ ID No.2;
PC4-S15,序列DSDSEVDKKLKRKKQ，见SEQ ID No.3;
以及相应的连接有迁移结构域的短多肽，如TLD-S15 ,序列 PLSSIFSRIGDPDSDSEVDKKLKRKKO ，见SEQ ID No.4。
实施例3与PC4结合的模拟激活结构域多肽
两亲性螺旋多肽(序列为ELQELQELQALLQQQ,见SEQ ID No.5)能 够模拟一种激活结构域与PC4发生强相互作用，封闭了 PC4的激活结构域，抑 制PC4与内源激活子相互作用，从而抑制PC4活性；
以及相应的连接有迁移结构域的短多肽，如TLD-AH15 ，序列 PLSSIFSRIGDPELOELOELOALLOOO，见SEQ ID No.6。
实施例4
利用基于荧光共振能量转移技术的高通量筛选检测系统筛选抑制PC4蛋白 活性的化合物。
筛选本发明的抑制PC4蛋白活性的化合物用标记有荧光的两亲性螺旋 (AH)结构域多肽作为能量供体，标记荧光的PC4蛋白作为能量受体。 一旦 PC4和两亲性螺旋结构域多肽形成复合体，即由于两个分子之间的相互作用力 使得供体和受体之间距离很近(距离约1 10nm)，此时观测到的主要是PC4 的发射光，因为分子间的荧光共振能量从两亲性螺旋结构域多肽转移到PC4蛋 白。两亲性螺旋结构域多肽的激发光和PC4的发射光受到荧光密度读板仪的监 测。任何化合物的抑制PC4蛋白活性的作用都能通过监测所读取的荧光密度的 变化来测定。 一般筛选两类化合物1)小分子合成物；2)天然化合物。当然， 这些化合物还需得到进一步证实，证明其能够成为一种有潜力的治疗依赖于 PC4的恶性肿瘤的候选抗癌药。
小分子合成物包括商业上可合成得到的和一些科研机构内部研发出来的。 将入选的化合物保存在96孔板或384孔板中，并建立一个它们的详细数据库。 反应板上的每个孔都有10 50nl包含浓度为lmM的待检测化合物(384孔板用 10ul， 96孔板用50ul)反应混合物，且反应混合物中还包含了标记有荧光的PC4 蛋白和两亲性螺旋结构域多肽。每个板上都有4个阳性对照孔(用浓度为10mM 未标记的两亲性螺旋结构域多肽替代标记了荧光的)和4个阴性对照(用水来 替代荧光标记的作为能量供体的两亲性螺旋结构域多肽)。用荧光密度读板仪 (Molecular Dynamics公司生产的)读取OD535的光密度值。筛选出来的阳性 分子的抗癌效果需采用不同的检测方法来进一步证实，所述的不同的检测方法 包括体外蛋白-蛋白相互作用检测、转录检测以及临床试验前采用细胞模型和动 物模型进行的药效检测。大部分的处方药都是天然化合物，市面上可以买到的 50%以上的抗癌药和抗感染药都源于天然产物。为鉴定天然化合物能否抑制PC4蛋白的活性，可以选取一些来源于土壤微 生物、海洋微生物、植物或其他自然界物质的化合物，利用基于荧光共振能量 转移技术的高通量系统对它们筛选检测。筛选出来的原材料可以再进一步纯化、 鉴定、且在一些上述的不同的检测系统中再进一步确认。
上述的发明内容和实施例只为阐明本发明的发明构思和要点，不能以此来 限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实施例以及结合本发明的精神实质所 作的等效变化或修饰，这些都是本领域技术人员能够想到的，都应涵盖在本发 明的保护范围内。再者，这里所有引用的教材或其他文献出版物等都已在文中 相应位置标注。
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<170>Patentln version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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28Gin Val Ala Pro Glu Lys Pro Val Lys Lys Gin 20 25
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Asp Ser Asp Ser Glu Val Asp Lys Lys Leu Lys Arg Lys Lys Gin 1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Pro Leu Ser Ser lie Phe Ser Arg lie Gly Asp Pro Asp Ser Asp Ser 15 10 15
Glu Val Asp Lys Lys Leu Lys Arg Lys Lys Gin 20 25<210> 5
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Leu Gin Glu Leu Gin Ala Leu Leu Gin Gin Gin 20 25
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Pro Leu Ser Ser lie Phe Ser Arg lie Gly Asp Pro 1 5 10
权利要求
1、一种治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的药物包含了有效剂量的PC4拮抗剂。
2、 根据权利要求1所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的PC4拮抗剂选自抗PC4的抗体、抑制PC4基因表达的反义核苷酸分子、抑制PC4基因表达的siRNA分子、已修饰或无功能PC4多肽或蛋白中的一种或几种。
3、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的抗PC4的抗体为单克隆抗PC4抗体或含有所述单克隆抗PC4抗体的多克隆抗体。
4、 根据权利要求3所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的单克隆抗PC4抗体为PC4的亚型特异性抗体。
5、 根据权利要求3所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的单克隆抗PC4抗体为小鼠单克隆抗PC4抗体。
6、 根据权利要求3、 4、 5任意一项所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的单克隆抗PC4抗体为抗原性片段、结构域抗体、单链抗体、嵌合抗体、杂合抗体中的一种。
7、 根据权利要求6所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的抗原性片段为Fab片段、F(ab)2片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fd'片段或者Fv片段。
8、 根据权利要求6所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于抗原性片段为抗原表位。
9、 根据权利要求3所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的单克隆抗PC4抗体为人源化抗体。
10、 根据权利要求9所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的人源化抗体为人源化天然抗体。
11、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的抗PC4的抗体的给药方式为直接注射或以脂质体为载体靶向输送的方式。
12、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的反义核苷酸分子能与PC4 cDNA的编码区序列、3'或5'非编码区序列或其他内含子序列杂交，或者能与PC4 mRNA杂交，其长度为15 30个核苷酸。
13、 根据权利要求12所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的反义核苷酸分子包括被化学修饰后形成的衍生物。
14、 根据权利要求13所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的化学修饰位于反义核苷酸分子的磷酸二酯骨架、碱基、糖环上。
15、 根据权利要求14所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的反义核苷酸分子为磷酸二酯键被磷硫酰化修饰后得到的磷硫酰化反义核苷酸分子。
16、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的反义核苷酸分子的给药方式为直接给药方式、载体输送方式、利用能与靶细胞或靶细胞上的特异性受体结合的抗体来靶向输送反义核苷酸分子。
17、 根据权利要求16所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的载体输送方式包括以阳离子脂质体为载体将所述反义核苷酸分子输送到靶点、以逆转录病毒载体或质粒为载体使得反义核苷酸分子在靶宿主细胞中得到表达。
18、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的siRNA分子与PC4 mRNA上的特异性序列同源。
19、 根据权利要求18所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的特异性序列为与PC4 mRNA的编码序列相邻的任意一段核苷酸序列。
20、 根据权利要求18或19所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的特异性序列为PC4 mRNA上的裸露单链区的序列。
21、 根据权利要求18所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的siRNA分子的长度小于30个碱基对。
22、 根据权利要求21所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的siRNA分子的长度选自25、 24、 23、 22、 21、 20、 19、 18 、 17个碱基对。
23、 根据权利要求22所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的siRNA分子的长度为21个碱基对。
24、 根据权利要求18、 19、 21、 22、 23中任意 一 项所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于siRNA分子包含有两个游离的3，端。
25、 根据权利要求24所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的游离的3'端有两个游离的核苷酸。
26、 根据权利要求25所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的 游离的核苷酸为2'-脱氧核糖核苷酸。
27、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的siRNA分子的合成方法为化学合成法或采用合适的表达载体在体外或体内合成。
28、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的siRNA分子的给药方式采用载体转染的方式将siRNA导入靶细胞。
29、 根据权利要求28所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的载体为脂质体。
30、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的已修饰或无功能PC4蛋白为突变型PC4蛋白。
31、 根据权利要求30所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的突变型PC4蛋白为F77P、 K23I/K29A、 K35I/K41A 、 R27A/K28I/K29A突变型PC4蛋白。
32、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的已修饰或无功能PC4多肽为与PC4激活结构域的氨基酸序列同源的短多肽。
33、 根据权利要求32所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的短多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.l或SEQ ID No.3所示。
34、 根据权利要求2所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的已修饰或无功能PC4多肽为能与PC4结合的模拟激活结构域多肽。
35、 根据权利要求34所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的模拟激活结构域多肽为一种两亲性螺旋多肽，其氨基酸序列见SEQIDNo.5。
36、 根据权利要求1、 2、 3、 30、 31、 32、 33、 34、 35中任意一项所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的PC4拮抗剂为连接有迁移结构域多肽的多肽或蛋白类PC4拮抗剂。
37、 根据权利要求36所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的迁移结构域多肽序列如SEQ ID No.7所示。
38、 根据权利要求37所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的多肽类PC4拮抗剂的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。
39、 根据权利要求2、 30、 31中任意一项所述的治疗或预防癌症的药物，其特征在于所述的已修饰或无功能PC4蛋白为磷酸化的PC4蛋白。
40、 权利要求1所述的药物应用于治疗或预防依赖于PC4的癌症。
41、 根据权利要求40所述的药物应用，其特征在于所述的依赖于PC4的癌症为肺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、小肠癌。
42、 一种筛选权利要求1所述的药物的方法，该方法包含以下两个依次发生的步骤(1)提供一种基因构建体，其包含PC4基因的启动子序列以及与该 启动子序列有效连接的报告基因；(2)将候选药物和所述的基因构建体混合置 于适合所述的报告基因表达的环境中，其中，抑制报告基因表达的候选药物为 治疗或预防癌症的药物。
43、 一种筛选权利要求1所述的药物的方法，该方法包含以下两个依次发 生的步骤(1)提供一种检测PC4蛋白的转录水平的试验；(2)向上述的试验 中加入候选药物，其中，降低PC4转录水平的候选药物为治疗或预防癌症的药 物。
44、 一种筛选权利要求1所述的药物的方法，该方法包含以下两个依次发 生的步骤(1)提供检测PC4与蛋白之间相互作用或PC4与DNA之间相互作 用的试验；(2)向上述的试验中加入候选药物，其中，降低PC4与蛋白之间相 互作用或PC4与DNA之间相互作用的候选药物为治疗或预防癌症的药物。
45、 根据权利要求44所述的筛选治疗或预防癌症的药物的方法，其特征在 于步骤(1)中所述的试验为基于荧光共振能量转移技术的高通量筛选检测试 验，其中，采用标记有荧光的两亲性螺旋结构域多肽作为能量供体，标记荧光 的PC4蛋白作为能量受体。
全文摘要
本发明涉及治疗或预防癌症的方法和药物。该方法和药物是通过抑制人转录正辅因子4(PC4)的表达水平或功能来达到治疗或预防癌症的目的。本发明还涉及筛选基于抑制PC4表达或功能的抗癌药物的方法。
文档编号A61K39/395GK101664550SQ20081016089
公开日2010年3月10日 申请日期2008年9月7日 优先权日2008年9月7日
发明者辉 葛 申请人:苏州爱生基因有限公司