来自人类血液的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的制作方法

专利名称：来自人类血液的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的制作方法
来自人类血液的CD4+CD25+调节性T细胞
本申请是申请日为2002年3月12日，申请号为02809777.7，发 明名称为"来自人类血液的CD4+CD25+调节性T细胞，，的发明专利申 请的分案申请。
本发明提供了抑制性和/或调节性的人类CD4+CD25+ T细胞，用 于增殖(expanding)该细胞的方法，和抑制性和/或调节性人类 CD4+CD25+T细胞，及相应增殖T细胞作为调节性药剂的用途。
背景技术：
免疫自身耐受性对自身免疫性的预防和免疫内环境稳定的维持是 关键性的。免疫系统识别自身和非自身的能力是由中枢和外周耐受性 机制控制的。中枢耐受性包括在发育早期胸腺中自.身反应T淋巴细胞 的缺失(Rocha, B.和von Boehmer, H., Science 251:1225-1228 (1991); Kisielow,P.等，Nature 333:742-746(1988))。 一些外周耐受性机制已经 被描述过，包括T细胞无反应性和忽视(Rocha, B.和von Boehmer, H., Science 251:1225-1228(1991); Kisielow, P.等，Nature, 333:742-746 (1988); Schwartz, R.H., Science 248:1349-1356(1990); Miller, J.F.A.P.和 Heath, W.R., Immunol. Rev.l33:131-150 (993))。正在进行的、对啮齿 类动物超过十年的研究提供了有力的证据，证实了 "专业的 (professional)"调节/抑制T细胞的独特CD4+CD25+群体的存在，该群 体活跃地并占主导地阻止了脱离其它耐受机制的自身反应性T细胞的 激活及效应器功能(Sakaguchi, S.等，J. Immunol. 155:1151-1164(1995); Takahashi, T.等，Int. Immunol. 10:1969-1980(1998); Itoh, M.等,J. Immunol. 162:5317-5326 (1999))。这些细胞的清除或失活会导致严重 的自身免疫性疾病，并且发现也会增强对同种抗原、甚至肺瘤的免疫 应答(Sakaguchi, S.等,J. Immunol. 155:1151-1164 (1995); Itoh, M.等，J. Immunol. 162:5317-5326(1999); Shimizu， J.等，J.Immunol. 163:5211 -5218 (1999))。最近的研究表明CD4+CD25+调节性T细胞构成一个相 当同源的群体(Thornton, A. M., Shevach, E. M., J. Immunol. 164:183-190 (2000)),来源于胸腺(Itoh, M.等，J. Immunol. 162:5317-5326 (1999)), 对经由TCR的刺激是自然非增殖的(即无反应性的)，但需要通过它
们的TCR激活，才具有抑制性，并抑制CD4+或CD8+T细胞的增殖。 然而， 一旦被激活，它们的调节/抑制功能是完全抗原非特异性的，不 依赖细胞因子，而依赖细胞接触(Thornton, A.M., Shevach, E.M., 丄lmmunol,164:183-190(2000))。抑制的确切机制,特别是涉及T-T相 互作用的细胞表面和/或短距离可溶性分子，仍然需要被表征。新的体 外数据表明CD4+CD25+T细胞是通过抑制它们的IL-2产生，而抑制响 应物增殖的(Thornton, A. M, Shevach， E. M., J. Exp. Med. 〗88:287-296(1998))。最近的体内研究表明CD4+CD25+T细胞的功能 关键性地依赖通过CTLA-4/CD152分子的信号传导，该分子一皮发现在 CD4+CD25+ T 细胞上组成型表达(Read, S.等，丄 Exp. Med. 192:295-302(2000); Salomon, B.等,Immunity 12:431-440 (2000); Takahashi, T.T.等，J. Exp. Med. 192:303-310(2000)))。
多年来，尽管很明显，在啮齿动物中，CD4+CD25+T细胞群体构 成了一个"专业的"调节性/抑制性T细胞的独特谱系，该谱系对自发 性自身免疫性疾病的预防是至关重要的(Sakaguchi, S.等，J. Immunol, 155:1151-1164 (1995)),然而迄令未知，在人类中，显示类似功能特 性的CD4+4T细胞是否自然发生。小鼠体内这些细胞的清除和/或功能 性损伤，例如通过抗CD25和/或抗CTLA-A4 mAb处理动物，会诱发多 种自发性自身免疫性疾病及肿瘤的排斥。机制是这些细胞的清除/损伤 消除了它们的自身反应性T细胞的负控制，所以这些T细胞变得活跃 起来。如果通过过继性转移将CD4+CD25+ T细胞输回这些动物体内， 调节作用便恢复了，并且自身免疫性/肺瘤排斥也停止了。
如上所述，迄今为止，还完全不知道在人类中，显示类似功能特 性的CD4+T细胞是否天然存在。制备具有调节特性的人类T细胞的方 法在本领域内已为人所知，不过，CD4+CD25+ T细胞并不为人所知。 如Jonuleit, H.等，丄Exp. Med 192:1213-1222(2000)所述的，通过未成熟 树突细胞的反复刺激，从人类原初(naive)T细胞中诱导调节性T细胞。 这项工作的大部分是采用脐血的T细胞进行的，脐血是真正原初T细 胞的最丰富的来源。应当指出，从早期开始，在人类血液中就可组成 性地检测到CD4+CD25+T细胞。Jonuleit等人的研究对象不是天然存在 的群体。De Jong， P.等，Int. Immunol. 6:631-638(1994)描述了 TGF-(31 在原初和记忆CD4+T细胞上的作用。其显示了不同的效应，在初级活
化的CD45 RA+CD4+ T细胞上显示了刺激效应。CD45 RO+ CD4+ T细 胞或次级激活CD45 RO+细胞的增殖被抑制。在CD45 RA+ T细胞的情 况中，TGF-卩导致CD25荧光平均凄史增加。此处描述的效应^又与T纟田月包 的增殖相关。原初的经TGF-卩处理的T细胞的调节能力未显示。
现在，在人类血液，特别是成年健康志愿者的外周血液中令人惊 讶地发现存在有CD4+CD25+,主要是CD45RO+T细胞(平均占CD4+ T细胞的6。/。)，下文筒称为"CD4+CD25+T细胞"。过去多年，具有 该表型的T细胞(即抑制性/调节性CD4+CD25+ T细胞)已经为人们所 了解，但是它们被误认为常规记忆细胞(Kanegane, R等，Int. Immunol., 3:1349-1356(199)；Taka, K.等,Imm腸1.72:5-19 (1990); Jackson, A. L. 等，Clin. Immunol. Innunopathol. 54:126-133 (1990))。与以前的报告相 反，人类CD4+CD25+T细胞不是常规记忆细胞，而是调节性细胞，该 调节性细胞显示的功能特性与它们的啮齿类对应物一致。例如，对 CD4+CD25+T细胞的体内抑制活性必不可少的CTLA-4 (CD152),是 组成型表达的，并且受激后仍维4寺强烈的正调节。这些细胞对于经由 其TCR进行的刺激而言，是非增殖的，但是该无反应性状态被IL-2和 IL-15部分逆转。在经由异源(而非同源)成熟树突细胞或培养板结合 的抗CD3+抗CD28刺激时，CD4+CD25+ T细胞释放IL-10,并且在共 培养试验中抑制CD4+和CD8+ T细胞的活化与增殖。抑制作用证明和 在小鼠体内一样，也不依赖IL-IO，而依赖细胞接触。对于人类耐受性 的研究而言，识别调节性CD4+CD25+T细胞具有重要的含义，特别是 在自身免疫性、移植术及癌症范围内。
发明概述 本发明提供了
(1 )抑制性和/或调节性人类CD4+CD25+ T细胞；
(2) —种增殖如上文(1 )中所定义的CD4+CD25+T细胞的方 法，该方法包括以T细胞刺激物，或是抗原呈递细胞，于间接体内(ex vivo)和体内(in vivo)刺激纟田月包；
(3) 增殖的人类CD4+CD25+T细胞，可通过如上文(2)中所 定义的方法获得，优选的是通过如上文(2)中定义的间接体内方法。
(4) 一种含有如上文(l)或(3)所定义的人类CD4+CD25+T 细胞的药物组合物；
(5 ) 如上文(1 )或(3 )所定义的CD4+CD25+ T细胞在制备 调节性药物上的用途；
(6) —种于间接体内或体内识别、监控和/或将CD4+CD25+ T 细胞从人类血液及其它组织中清除的方法，该方法包括
(i) 利用可与T细胞上的CD4、和/或CD25、和/或CTL-A4 (CD154)实体(entities)特异性结合的药剂/配体，优选的是抗CD4和/
或抗CD25、和/或抗CTL-A4抗体，和/或
(ii) 利用免疫吸附方法；和/或
(iii) 利用如上文(2)所定义的刺激物或抗原呈递细胞；
(7) 如上文(2)所定义的T细^^刺激物或抗原呈递细胞在制 备一种可体内诱导调节性CD4+CD25+ T细胞的药剂上的用途，优选的 是用于制备治疗患者自身免疫性疾病的药剂；
(8 )如上文(1 )或(3 )所定义的CD4+CD25+ T细胞的以下
用途
(a) 用于识别其它生长和/或功能性修饰(抑制/增强)/凋亡或抗凋 亡因子的分析上
(b) 用于识别通过CD4+CD25+T细胞表达的分子上，包括识别在 该细胞上的新分子，或者识别被认为具有药物活性的呈递分子，或者
(c) 用于识别调节性CD4+CD25+ T细胞的前体细胞或后代；
(9) 上文(1 )中富集的CD4+CD25+ T细胞或上文(3)中增 殖的T细胞在制备用于过继性转移治疗的药剂；用于治疗与免疫性增 强相关、包括但不仅限于自身免疫性疾病的药剂；或者用于预防/治疗 移才直反应，如移4直物抗宿主疾病和移4直排斥的药剂上的用途，
(10) 用于过继性转移治疗的方法，包括将如上文0)或(3) 所定义的富集/增殖的自身或非自身调节性CD4+CD25+ T细胞注射/输 回患者体内，以预防或治疗任何过强和/或致病的免疫反应，或者预防/ 治疗移植反应，如移植物抗宿主疾病和移一直排斥；
(11) 一种制备具有特定要求的抗原特异性T细胞受体的 CD4+CD25+T细l包的方法，包括
(i) 采用抗原呈递细胞活化/刺激/增殖上文(1 )的CD4+CD25+ T细胞，优选的是未成熟或成熟树突细胞(DC)，在体外(in vitro)或体 内呈递该抗原；或者
(ii) 利用 一种在CD4+CD25+调节T细胞(的亚型)上表达的 特定T细胞受体的配体/抗体，或者一种与CD4+CD25+T细胞(的亚型) 上的特定T细胞受体结合的MHC-肽复合物；
(12) 通过如上文(11 )所定义的方法，或者通过将具有希望的 抗原特异性的T细胞受体转染进间接体内分离或增殖的T细胞的方法 获得的CD4+CD25+ T细胞；
(13) 包括上文(12)的T细胞的药物组合物，优选的药物组合 物适用于治疗与免疫性增强相关的疾病，包括但不仅限于自身免疫性 疾病，移植物抗宿主疾病和移植排斥；及
(14 )特异性地结合到T细胞上的CD4和/或CD25和/或CTL-A4 (CD154)实体上的药剂，包括但不仅限于配体/抗体，如抗CD25和/ 或抗CTL-A4 mAb;或者是与CD4+CD25+ T细胞(的亚型)上的T细 胞受体结合的抗体或MHC -肽复合物或其它配体，在制备一种用于体 内CD4+CD25+T细胞的清除或功能性损伤的药物上的用途，用以增强 免疫反应，包括通过体内CD4+CD25+T细胞的阻抑调节，例如增强肿 瘤免疫性。
附图简述


图1显示CD4+CD25+T细胞表现出与CD4+CD25-T细胞明显不同 的表型。
图2显示对异源和多克隆刺激，CD4+CD25+T细胞均无增殖/无反 应性，通过添加IL-2和/或IL-15可部分逆转这一情况，但通过中和抗 IL-10抗体则不可以。
图3显示如果通过TCR刺激，CD4+CD25+T细胞将以细胞接触和 剂量依赖方式抑制CD4+和CD8+T细胞的活化。
图4显示CD4+CD25+和CD4+CD25— T细胞的细胞因子特征不同。
图5显示活化的和固定的CD4+CD25+细胞仍然显示调节能力。
发明详述
下文将更详细地描述本发明的实施方案(1 ) ~ ( 14):
(A) 现在，人类CD4+CD25+T细胞的表型特征使得可以于间接体 内(下文有时表示为"体外，，)或体内，从人类血液和其它组织中识别、 监控(如通过FACS)、分离和清除这些细胞。可于间接体内采用合适 的药剂接触人类血液或其它组织实现这种分离或清除。抗CD4、抗 CD25、抗CTL-A4 (CD154)抗体等是尤其合适的药剂。
(B) 可通过合适的T细胞剌激物或抗原呈递细胞(下文简称为 "APCs")的刺激，间接体外增殖CD4+CD25+T细胞。适用于上文(2)
和(6)方法的合适的T细胞刺激物包括，但不仅限于含有下列物质的 组合物
(a)抗CD3和/或抗CD28配体/单克隆抗体(mAb ),包括超激动 抗体；(b) CD4+CD25+ T细胞表面的T细胞受体的配体/抗体，或者 是T细胞受体组分的配体/抗体；或(c)与调节性T细胞表面表达的T 细胞受体结合的MHC-肽复合物；或(d) PMA (及其它佛波醇酯)+ 离子霉素(或其它钙离子载体)。
本发明的"配体，，涉及所有种类的、可结合到特定分子上的化合 物(包括多聚核苷酸和多肽，如细月包受体，CD25， CTL-A4等)。优选 的配体是单克隆抗体或其片断。术语"配体"和"抗体"在整篇申请 中可互换使用。
合适的APCs包括自身或非自身或人工抗原呈递细胞(如树突细 胞(树突细胞的制备方法见例如WO 93/20185、 WO 97/29182和EP-A-0 922 758 )等)。该T细胞刺激物和抗原呈递细胞可连同IL-2或IL-15 或其二者的组合一起应用。除了 IL-2/IL-15,也可采用其它的细胞因子， 这些细胞因子利用若干细胞因子受体共有的Y链(包括，但不仅限于， IL-7和IL-9)。此外，已知可促进其它调节细胞产生的IFNcc和IL-10 (Groux, H.等，Nature 389:737-742 (1997); Roncarolo, M.G., J. Exp.Med, 193:F5-F9 (2001))也可促进这些细胞的产生/增殖。最后，其它用于多 克隆或寡克隆(如通过超抗原)T细胞刺激的方法也是可以应用的(抗 CD3和/或抗CD28配体/抗原包括超激动抗体；PMA+离子霉素等)。
熟知。
(C) CD4+CD25+ T细胞的识别使得可以体内监控和增殖 CD4+CD25+ T细胞(如通过对患者施用上文定义的T细胞刺激物，如 IL-2+IL-15或IL-10+IFNa，同时加入或不加入杉十突细月包/抗原呈递细胞)， 以诱导调节性T细胞，如抵抗自身免疫性疾病。
(D) 上文(1 )或(3 )的CD4+CD25+ T细胞或增殖的CD4+CD25+ T细胞可被用于识別其它生长和/或功能性修饰(抑制/增强)/ (凋亡或 抗凋亡)因子，这些因子可被用于体外或体内(如刺激或清除或功能 性地干扰CD4+CD25+ T细胞)。这些T细胞也适合通过如下方法识别 CD4+CD25+T细胞表达的分子，这些方法例如但不局限于mAb生成、 蛋白质组学(proteomics)、 DNA芯片分析、扣除杂交(尤其是(a)"新 物质"，即迄今未知的物质、分子的识别，或(b)如这些分子具有合 适的药物耙结构，便可用其开发新的刺激性、抑制性或凋亡诱导性药 物，用于体外和体内CD4+CD25+T细胞的"打开"或"关闭")，这 些T细胞也适用于识别调节性CD4+CD25+ T细胞的前体细胞或后代。
(E) 上文(1 )或(3 )中的CD4+CD25+ T细胞或增殖的CD4+CD25+ T细胞可应用于过继性转移治疗，即将富集的/增殖的自身的或非自身 的调节性T细胞注射/输回患者体内，以预防或治疗任何过强和/或致病 的免疫反应，即治疗最广泛意义的自身免疫性(包括但不仅限于典型 自身免疫性疾病，如红斑狼疮、风湿性关节炎、多发性硬化症、寻常 型天疱疮或甲状腺炎，及发病机理中至少有一些自身免疫性特征的疾 病，如白癫风、遗传过敏性皮炎、牛皮癣等)。也预防/治疗移植反应， 如GVHD (移植物抗宿主疾病)和移植排斥。
(F) 为了在体外或体内活化/刺激/增殖CD4+CD25+ T细胞，而产 生/增殖具有特定所需抗原特异性TCR ( T细胞受体)的CD4+CD25+ T 细胞，上文(1 )或(3 )中的CD4+CD25+T细胞或增殖的CD4+CD25+ T细胞(以及上文(2)中定义的增殖方法，(4)中的药物组合物，及
(5 )和(7) ~ (9)中的应用)可与未成熟或成熟树突细胞(DC)(或
或不采用组织或任何其它抗原(限定的或未限定的)进行脉冲/加载/补 料(pulsed/loaded/fed )接触。限定抗原的实例是自身抗原(如寻常型
天疱疮中的桥粒芯糖蛋白3、白瘕风中的melanA或酪氨酸酶、甲状腺 炎中的曱状腺球蛋白)或外源抗原(如来源于病原体的抗原如丙肝等) 或同种抗原/移植抗原。未限定抗原的实例是来源于组织或细胞的抗原 (如以坏死或凋亡细胞、或来源于组织的RNA、或目的细胞与树突细 胞/抗原呈递细胞杂交的形式，或以其它将未限定抗原导入树突细胞或 其它抗原呈递细胞的形式)或来源于病原体的抗原。可以采用自身或 非自身CD4+CD25+T细胞和/或树突细胞。
(G) 如上文(14 )定义的、特异性地与T细胞上的CD4和/或CD25 和/或CTL-A4 (CD154)实体结合的药剂，可被用于在体内清除和监控 CD4+CD25+ T细胞的清除，如通过抗CD25和/或抗CTL-A4 mAb (未 修饰的或修饰的，如与毒素结合)或通过免疫吸附(血液是流经色语 柱的，且CD4+CD25+ T细胞是通过针对CD4+CD25+ T细胞表面表达分 子的固相结合抗体，如抗CD25，而得以清除)以增强免疫反应，如通 过体内CD4+CD25+T细胞的阻抑调节，例如，增强肺瘤免疫性。
(H) 在本发明的另一个优选实施方案中，上文(3)增殖的(即活 化的)CD4+CD25+ T细胞(以及上文(1 )和(12 )中的T细胞)可以 被固定。可通过采用合适的固定剂，包括但不仅限于多聚甲趑等，于 间接体内处理(增殖的)T细胞，以获得这种固定的T细胞。优选的固 定方式是通过将细胞悬浮于0.5 5。/。(w/w)多聚曱醛水溶液来完成，最优 选的是在大约2%(w/w)多聚曱醛〉容液中，15min 3h，最优选的是lh, 继而是适当洗涤步骤。
(I) 上文(5)的药物、(9)和(14)的药剂、或(10)的方法 中所采用的CD4+CD25+ T细胞可以是自身或非自身调节性T细胞。在 非自身调节性T细胞的情况中，优选的是T细胞以上文(H )提到的方 法被固定。
(J)上文(4)和(13)的药物组合物、(5)的药物、(7)、 (9) 和(14)的药剂，以及(6) 、 (8)和(10)的方法中利用的T细胞 可进一步含有为本领域的技术人员所熟知的成分，诸如药用/诊断用载 体、溶剂、稀释剂和添加剂。这些成分的浓度由本领域的技术人员根 据相应的用途采用。
在过去几年中，对啮齿动物中 一些调节细胞类型的更好描述已经 更新了抑制物或免疫调节性T细胞的概念，它们之间的相互关系还未
被最终定义。所谓的Trl和Th3细胞介导旁立抑制-无需直接细胞接触-通过IL-10和TGF-P分别高水平分泌(Groux, H.等，Nature 389:737-742 (1997); Fukaura, H.等，J. Clin. Invest. 98:70-77 (1996))。迄今为止，已 识别的，被最好地表征，并且显然最为重要的调节性T细胞群体是 CD4+CD25+ T细胞。它们天然存在于啮齿动物中(在淋巴器官中代表 大约10%的CD4+细胞)，以CD25 (IL-2R-a)的组成型表达为特征， 且在维持耐受性和预防体内自身免疫性疾病方面，无疑具有十分重要 的作用。令人惊讶的是，至今在人类体内尚未发现一种显示相同特性 的细胞群体。此处，我们证实，在人类血液中，曾被认为可4戈表常一见 记忆T细胞的CD4+CD25+ T细胞(Kanegane， H.等，Int. Immunol. 3:1349-1356 (1991); Taka, K.等，Immunol., 72:15-19 (1990); Jackson, A. L.等,Clin. Immunol, Innunopathol. 54:126-133 (1990))实际看来就是独 特的CD4+CD25+调节性T细胞的准确的人类的对应物，该T细胞是已 知的，并于啮齿动物中进行了多年的研究。我们可以从成人血液中分 离出相当量的CD4+CD25+ T细胞(平均占CD4+ T细胞的6% ),因而 可以着手具体的研究，并与CD4+CD25- T细胞进行比较。这证明人类 细胞与鼠CD4+CD25+免疫调节性T细胞共有关键表型和功能性的特 征。最令人感兴趣且以前未识别的表型特征是已经由人类CD4+CD25+ T细胞组成型表达(细胞内高水平，细胞表面为低水平)的CTLA-4分 子(CD152),在经由TCR刺激后被进一步正调节，并维持高的表面 水平至少长达一周(与下列文献所述的、受激后重新表达CTLA-4,并 且仅维持非常短暂时间的CD4+CD25- T细胞形成鲜明对比(Thompson, C. B., Allison, J.P., Immunity, 7:445-450 (1998); Chambers, C. A.等, Immunol. Rev. 153:27-46 (1996)) 。 CD4+CD25-表达CTLA-4的模式已 经证明了其与鼠CD4+CD25+调节性T细胞的关系，因为这些细胞组成 型表达的CTLA-4是其体内抑制活性所必需的分子。(Read, S.等，丄 Exp. Med. 192:295-302 (2000); Salomon, B.等，Immunity, 12:431-440 (2000))。人类CD4+CD25+ T细^l包与其鼠类对应物相似，受刺激后几 乎没有增殖，既不响应通过与培养冲反结合的抗CD3+抗CD28的多克隆
活化作用，也不响应最有效的自然免疫刺激性细胞，即成熟(异源)
DC的(甚至反复性地)刺激作用。当这些刺激物与高剂量的IL-2 (500U/ml)联合使用时，如下面所引文献所述，无反应性在小鼠中被 部分逆转(Thornton, A.M., Shevach， E.M., J. Immunol., 164:183-190 (2000))。新的发现是高剂量的IL-15 ( 50-100ng/ml)诱导相当的增殖， 而且甚至较低剂量的IL-2和IL-15 (分别为10U/ml和10ng/ml)的联合 作用也有强烈的协同作用，并诱导有活力的增殖。这一点可能是重要 的，因为对潜在的治疗应用，及为进一步更为具体的研究(包括机制 的和分子的)，而针对这些细胞的克隆化而言，CD4+CD25+ T细胞的 增殖都是至关重要的。令人感兴趣的是中和抗IL-10 mAb无法促进增 殖，这表明这些细胞释放IL-10不以自分泌方式引起无反应性。在共培 养实验中，CD4+CD25+ T细胞表现出另一种关键特征，即只能经由它 们自己的TCR活化，才以依赖接触和剂量，但不依赖细胞因子的方式 抑制CD25-CD4+或CD8+ T细胞的增殖。我们的间接体内系统还不允 许我们研究该抑制作用是否如最近利用TCR转基因小鼠显示的完全抗 原非特异性(Thornton, A. M.， Shevach, E.M., J. Immunol., 164:183-190 (2000))。不过，通过采用我们用于增殖这些细胞的IL-2+IL-15方法， 研究各自的机制是可能的。
最值得注意的是一份最近的报告显示具有调节特性、实质上与 我们从人类血液中间接体内分离出的CD4+CD25+ T细胞表型一致的T 细胞，可通过人类原初T细胞与未成熟DC的反复刺激于体外产生 (Jonuleit, H.等,J. Exp. Med., 192:1213-1222(2000))。在小鼠中， CD4+CD25+调节性T细胞群体在胸腺中是持续产生的(Itoh, M.等, 丄Immunol.162:5317-5326 (1999)),然而，外周调节性T细胞的维持需 要组织特异性抗原和IL-2( 25， 26 )的存在。基于两个补充发现(Jonuleit， H.等，丄Exp. Med.， 192:1213-1222(2000)),的确引人推测，通过摄取凋 亡抗体，取样外周组织的未成熟DC (Steinman, R.M.等，J. Exp. Med., 191:411-416 (2000); Roncarolo, M.G.等，J. Exp. Med. 193:F5-F9 (2001)), 和目前通用或组织特异性自身抗原，是迁移出的胸腺调节性T细胞的 存活和可能的轻微增殖的原因。相信间接体内分离的CD4+CD25+调节 性T细胞的存活可通过未成熟DC的相互作用被促进，并且最近报告的
在体外通过未成熟DC从原初T细胞中CD4+CD25+ T细^^的"产生，， (Jonuleit, H.等，J. Exp. Med., 192:1213-1222 (2000))可能更代表在初始 接种体中已存在的CD4+CD25+的存活的维持。也应当指出，间接体内 分离的人类CD4+CD25+ T细胞与同源成熟DC的相互作用不足以激活 它们的抑制特性，而异源成熟DC为调节作用的有效诱导物。该观察结 果再度提示可进行试验的假设。例如，相对于成熟同源DC,未成熟 DC能激活CD4+CD25+ T细胞(表明它们携带一些用于相互作用的特定 配体)，或者仅在摄取凋亡体后〗敫活CD4+CD25+ T细胞(表明需要存 在自身抗原)吗？此外，呈递标称回忆抗原(nominal recall antigens ) 的成熟DC(如流感蛋白质/肽)于CD4+CD25- T细胞群体和CD4+CD25+ T细胞群体中均刺激T细胞，这表明除了自身抗原以外，外源抗原的识 别也可于炎性位点触发调节。
总之，在正常人类成人的外周血液中存在着相当大群体( 6%) 的CD4+CD25- T细胞，与以前的只见念相比，它们不代表常规记忆性T 细胞，而是调节性T细胞，这种调节性T细胞与在啮齿动物中已经研 究多年的CD4+CD25-"专业的"抑制性/调节性T细胞的独特群体相当。 现在，人类CD4+CD25+调节性T细胞的识别与特征化使得我们可以在 多种疾病病症中对其监控，并且对理解和治疗自身免疫性，移植排斥， 和癌症具有重要的意义。
通过以下附图和实施例进一步解释本发明，不过这些附图及实施 例并不对本发明构成限制
附图
图1: CD4+CD25+ T细胞表现出明显与CD4+CD25- T细胞不同的 表型。通过负MACS分类从PBMC中分离出CD4+ T细胞，并产出高 度纯化的未接触的CD4+ T细胞。这些细胞由抗CD25》兹珠标记并分类。
(A) :分类得到基本上纯的CD25+T细胞。该附图显示了从20 次独立标准试验中得到的代表性结果。
(B) :采用如"材料与方法"中描述的方法分析CD4+CD25+、 CD4+CD25-和活化的CD4+CD25- T细胞的表型。另外，采用固定化的 抗CD3+可溶性抗CD28活化CD4+CD25- T细胞。活化后，细胞由抗
CD25磁珠标记并分类。五次独立试-验的结果相似。
(C ):采用抗CTLA-4抗体于37。C将CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞染色2h。在固定化抗CD3+可溶性抗CD28活化后的不同时间点， 于体外进行该染色步骤。该附图显示了 4次独立试验中的 一个代表性结果。
图2: CD4+CD25+ T细胞对异源和多克隆刺激均无增殖/无反应性， 通过添加IL-2和/或IL-15可部分逆转，^f旦添加中和抗IL-10抗体则无法 逆转。
(A) :如图1通过MACS分类从成人血液中分离CD4+CD25+和 CD4+CD25-T细胞。采用不同数目的成熟异源DC刺激口105个丁细胞 /96孑L。通过卩H]Tdr掺入测定T细胞( 一式三份培养物)的增殖。6次 独立实验的结果相似。
(B) :用如(A)描述的步骤处理全部CD4+、 CD4+CD25+和 CD4+CD25-T细胞。通过卩H]Tdr掺入测定三份培养物的增殖(该图显 示的是5次独立实验的代表性结果)。
(C) :采用来自相同供体的成熟异源DC每周接触和再刺激经 MACS分类的CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞(DC'.T细胞比例为 1 :20)。通过[3H]Tdr掺入测定增殖(1 x 10 5个T细胞/96孔)。3次独 立实验获得相似结果。
(D) :采用固定化抗CD3( 10叱/ml)和可溶性抗CD28( 10|iig/ml) [上框]，或者如(A)所述的采用成熟异源DC[下框]刺激CD4+CD25+ 和CD4+CD25—T细胞。于培养开始时分别加入500U/ml IL-2、 100ng/ml IL-15、 10U/ml IL-2+lng/ml IL-15的混合物或10pg/ml抗IL-IO。培养5 天后测卩H]Tdr的掺入。该图显示了 3次独立实马全中的一次。无多克隆 或异源T细胞刺激物的情况下，加入IL-2和/或IL-15,在CD25+或 CD25T细胞亚型中不会诱导有意义的增殖(数据未显示)。
图3:如果由TCR刺激，CD4+CD25+T细胞将以依赖细胞接触和 依赖剂量方式抑制CD4+和CD8+T细胞的活化
(A, B):将经由MACS分类的总CD4+ (A)和CD8+ (B) T 细胞(10 5个T细胞/96孔)按图示比例加入到CD4+CD25+ T细胞中， 并以DC/CD4+或CD8+T细胞1:20的比例，采用异源DC刺激。5天后 通过^H]Tdr掺入测定增殖。该图显示了 5次独立实-验中的一次。
(C ):从相同供体(供体I)产生/分离DC和CD4+CD25+ T细 胞。另外，从另一供体(供体II)分离全部的CD4+T纟田月包和CD4+CD25+ T细胞。将105个全部CD4+ T细胞/96孔与5xl03个DC/孔一起培养(即 DC:T=1:20;在DC:T=1:100时结果是可比较的，该结果未显示)。然 后分别加入来自供体I和供体II的CD4+CD25+ T细胞。培养5天后， 通过^H]Tdr掺入测增殖。3次独立实验的代表性结果显示为三份培养 的平均cpm <直。
(D):采用5xl(^个异源成熟DC刺激全部的CD4+ T细胞或 CD4+CD25+T细胞(105个T细胞/96孔)(DC:T=1:20)(上部两框)。 另外，全部的CD4+T细胞与CD4+CD25+T细胞以1:1的比例共培养(105 个T细胞/96孔培养板)，并于10昭/ml抗IL-IO、 2(ig/ml TGF-卩、500U/ml IL-2、 50ng/ml IL-15或者10U/ml IL-2与lng/ml IL-15的混合物存在或 不存在的情况下再次由异源DC以DC:T为1:20的比例进行刺激。在平 行Transwell方法中，在一个Trans well室中，由异源DC ( DC/T细胞 比例为l:20)刺激CD4+CD25+T细胞，并将全部CD4+T细胞响应物再 次与异源DC—起置入孔内，DC:T比例为1:20。通过卩H]Tdr掺入测培 养5天后的增殖。该图显示了 4次代表性实验中的一次结果。
图4: CD4+CD25+和CD4+CD25— T细胞的不同细胞因子廓型 (profiles)。
(A) :采用PMA(20ng/ml)和A23187 Ca2+离子载体(500ng/ml) 刺激经MACS分类的CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞6h。后5h加入 莫能菌素(2pM)。进行CD3表面表达的染色。将细胞洗涤、固定、 透化并染色，以采用FITC结合或PE结合的特异抗体检测细胞内细胞 因子。该图显示了具有相似结果的5次独立实验中的一次。当T细胞 由与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28AB刺激时，结果是一样的
(未显示)。
(B) :采用与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28活化
CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞。培养48h后，通过核糖核酸酶保护 分析进行RNA表达分析。
(C):通过ELISA测定上清液中的细胞因子(该图显示5次独 立实验中的一次)。
材料与方法
培养基将补充有1°/。热灭活的自身血浆、20吗/ml艮他霉素 (Merck)和2mM谷氨酸盐(Bio Whittaker )的RPMI1640 ( Bio Whittaker)用于树突细胞(DC)的增殖，将补充有1%热灭活单供体人类 血清、20叱/ml艮他霉素(Merck)和2mM谷氨酸(Bio Whittaker)的 X-VIVO-20 ( Bio Whittaker)用于T细胞培养。
细胞因子所有用于该研究的细胞因子均为重组人类蛋白质。最 终浓度为GM-CSF l,000U/ml (Leukomax ; Novartis), IL-4 800 U/ml (Sandoz), IL-2 ( Proleukin; Chiron Corp.)和IL-15 ( PeproTech )以指示 浓度使用；对DC的成熟而言，我们采用含有IL-l卩2ng/ml (Sigma)、 IL-6 1000 U/ml ( Sandoz ) 、 TNF-a 10ng/ml ( Bender, Vienna )、及PGE2 l^ig/ml (Sigma)的混合物(cocktail)。
抗体对免疫染色而言，应用的是抗CD3、 CD4、 CD5、 CD8、 CD14、 CD19、 CD25、 CD28、 CD45 RA、 CD45 R〇、CD56、 CD62L、 CD80、 CD83、 CD86、 CD95、 CD95L、 CD122、 CD152、 CD154、 HLA-DR 的PE-和FITC结合抗体(Ab )(均来自BD Pharmingen ),及各自的 小鼠和大鼠同种型对照。用于细胞内细胞因子染色的抗体是FITC-和 PE-结合抗IL-2 (MQ1-17H12)、抗IL-4( 8D4-8 )、抗IL-IO( JES3-19F1 ) 和抗IFN-了( 4S,B3 ),均来自BD Pharmingen。未结合抗IL-10( JES3-19F1 ) (Pharmingen )和抗TGF-卩(R&D Systems )被用于中和实验。抗CD3 (UCHT1 )和抗CD28 ( CD28.2 )用于T纟田月包的多克隆激活。
细胞因子分析由异源DC，或由X-VIVO-20+lo/。血清中的与培养 板结合的抗CD3 ( 10貼/ml) +可溶性抗CD28 ( 10昭/ml)刺激T细胞。
通过采用适用于人类IL-2、 IL-4、 IL-IO、 IFN-y和TGF-卩(BD Pharmingen ) 的市售ELISA试剂盒对上清液进4t分析的方法，于不同时间点进行细 胞因子分析。对细胞内细胞因子产生而言，T细胞由PMA 20ng/ml和 Ca2+离子载体A23187 500)ig/ml (均来自SIGMA)刺激6小时,或由培 养板结合抗CD3和可溶性抗CD28 Ab刺激6小时。于培养最后4小时 加入2pM的莫能菌素(SIGMA)。收集、洗涤、固定并皂苷透化细胞 (Fix/perm溶液，BD Pharmingen ),并由细胞因子特异Ab或同种型 进行染色。
对细胞因子mRNA分析而言，T细胞是由与培养板结合的抗CD3 和可溶性抗CD28 Ab刺激。通过核糖核酸酶保护分析模板装置(BD Pharmingen)分对斤纟田月包。
细胞分离和DC生成:如(18, 19)所述，DC产生自血沉棕黄 层，或除去白细胞后的产物中(均获得自the Department of Transfusion medicine,经健康供体同意后获得)。简言之，通过Ficoll密度梯度离 心分离PBMCs。通过塑料吸附分离单核细胞，并将其培养在补充有IL-4 和GMCSF的RPMI培养基中。第6天，加入一种成熟混合物(IL-l卩、 IL-6、 PGE2和TNFa)。第7天，收获未吸附细胞，并且构成对协同分 子(CD80、 CD86)和CD83而言，为〉90%双阳性的成熟DC。
采用阴性CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)从PBMC 中分离CD4十T细胞。采用CD25 M腦beads ( Miltenyi Biotech)从纯 的、未接触的CD4+ T细胞中分离CD4+CD25+ T细胞。采用阴性CD8+ T 细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech )进行CD8+T细胞的分离。纯度由 FACS评定。
流式细胞仪分析:为进行免疫焚光检验，将染色细胞洗涤，再采 用每种Ab的最优稀释液于4。C将其染色20mm。再次洗涂细胞，并通 过流式细胞仪(FACSScanTM和CELLQuestTM软件；Becton Dickinson ) 分析。为进行细胞表面CD152表达的分析，细胞需经恰当的抗体于37。C 染色2小时。
增殖分析:为评估不同CD4+亚型的增殖，于96孔培养板中的、
含有不同数目的DC或不同浓度的与培养板结合的抗CD3+可溶性抗 CD28的X-VIVO-20中培养105个分类T细胞。为评估调节特性，需在 96孔培养板中，采用5><103个(有些实验中也可采用lxio3) DC培养 105个CD4+ T细胞。加入不同浓度、已纯化的CD4+CD25+或 CD4+CD25-T细胞。培养4 5天后，加入[3H]Tdr ( 37KBq/孔)并继续 培养16h。采用液体闪烁记数器测定增殖。
Transwdl实验:于24孔培养板中进行Transwell实验。采用5xl03 个DC刺激106个CD4+ T细胞。另外，既可将106个CD4+CD25+或 CD4+CD25— T细胞直4^加入培养物中，也可将其置于Tmnswell室 (Millicell， 0.4|im; Millipore )中。共培养5天后，将一式三份的T细 胞转移至96孔培养板中(105个细胞/孔)。经[3H]Tdr 16h的脉沖标记 后，采用液体闪烁计数器测定增殖。
实施例
实施例1: CD4+CD25+T细月包对异源和多克隆刺激均显示增殖减 少响应。
低增殖潜力是在鼠科系统中，被很好地特征化的调节CD25+CD4+ T细胞的一个显著的特性(Sakaguchi S.等,J.Imm漏l., 155:1151-1164 (1995))。为分析人类CD4+亚群的增殖能力，将CD4+ T细胞根据其 CD25的表达进行磁性分类。通过采用MACS CD4阴性选择试剂盒， 并且随后进行CD25阳性选择，获得了超过95%纯度的CD4+CD25+ T 细胞群体(图1A)。这些细胞包4舌了约6% (2.8-17.2%, n=20)的， 存在于我们所研究的健康成人的血液中的外周CD4+T细胞。
成熟DC是已知的最有效的抗原呈递细胞(Bancherau, J., Steinman R. M., Nature, 392:245-252 (1998))。然而，与CD4+CD25- T细胞(图 2A， B)、或整个CD4+群体(图2B)形成对比，当体外采用充分成熟 异源DC刺激时，CD4+CD25+T细胞实质上不显示增殖响应。有趣的是， 与整个CD4+群体相比，当采用异源DC刺激时，除去了 CD25+T细胞 的CD4+群体(图2B)显示出较高的增殖。
接着确定了 CD4+CD25+ T细月包是否可能仅通过成熟DC反复刺激
而增殖。再刺激后，CD25-丁细胞的增殖响应稍微增加，然而CD25+T 细胞的响应仍然很低(图2C)。通过异源成熟DC激活(priming)和再 刺激，在2个循环的再刺激后引起CD25-群体30 50倍的增殖。相反， CD25+群体无明显的增加(数据未显示)。反复刺激后，在明显缺乏凋 亡或坏死的情况下，收获了与初始接种体相比绝对数目有轻微( 10% ) 减少的CD4+CD25+ T细胞(数据未显示)。
当这些细胞群体经由与培养板结合的抗CD3+可溶性抗CD28多 克隆刺激时，CD4+CD25+T细胞的极低增殖响应也是明显的。为验证T 细胞生长因子IL-2和IL-15是否能影响增殖潜力，将二者以不同剂量加 入到CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞中，这些T细胞已经用固定化抗 CD3+可溶性抗CD28 (图2D，上框)，或用成熟异源DC (图2D，下 框)进行了刺激。 一系列试验研究显示IL-2仅在高剂量(100-1000U/ml) 下增强CD25+T细胞的增殖。IL-15有相似的效果，也仅在50-100ng/ml 的高剂量下增强CD25+ T细胞的增殖。当两种细胞因子混合使用时， 它们具有强的协同效应，并且10U/mlIL-2力。10ng/mlIL-15的剂量就足 以促进CD4+CD25+ T细胞的增殖。在不存在多克隆或异源T细胞刺激 物的情况下，加入IL-2和/或IL-15,在CD25+或CD25-T细胞亚型中不 引起明显的增殖(数据未显示)。
实施例2:CD4+CD25+ T细胞表现出与CD4+CD25— T细胞明显 不同的表型。
为进一步特征化CD25+CD4+ T细胞群体，将CD4+CD25+、 CD4+CD25-不同表面分子的表达，与受激的CD4+CD25- T细胞不同表 面分子的表达(图1B)相比较。三个群体均显示CD3和CD4的同源 表达。通过FACS分析检测不到污染细胞，如单核细胞、B细胞、CD8+ T细胞或NK细胞(数据未显示)。无预先刺激，即间接体内，CD25+ 群体高水平表达细胞内，低水平表达细胞表面CTLA-4 (CD152)。间 接体内分离的CD4+CD25+ T细胞进一步组成型表达CD122 (IL-2R (3 链)、HLA-DR ( 50%),并组成CD45RO细胞的主要成分( 80% ), 该CD45RO细胞类似一种记忆T细胞表型。形成鲜明对比的是，间接 体内分离的CD4+CD25- T细胞不表达CTLA-4 (既不在细胞内，也不在
细胞表面)、CD122、或HLA-DR,并且更多的细胞表达CD45RA而不 是表达CD45RO。然而在用培养板结合抗CD3+可溶性抗CD28激活后， 正如所预期的，大部分CD4+CD25-优势地成为CD25+ ( CD25表达水 平与CD4+CD25+T细胞相比，约高出1 log,数据未显示)，并且显示 高水平的HLA DR和CD122 (与CD4+CD25+ T细胞相比，也约高出1 log)。另外，如预期的，细胞内和表面CTLA-4均于24 48h内被正调 节，但其后被迅速地负调节(图1C)。当CD4+CD25+T细胞受激后， CTLA-4/CD152表达的动力学显示出显著的差异。这些细胞也正调节其 (已经组成型存在但水平;f艮低)CD152的表面表达，然而CD152的强 表达仍保持不变超过1周(图1C)。用其它一些诸如抗CD28、 CD62L、 CD69、 CD95、 CD95L、 CD154(CD40L)的mAb染色，在CD4+CD25+ 与CD4+CD25-T细胞之间不显示出可重现的和显著的差异。
实施例3:如果通过TCR刺激CD4+CD25+ T细胞会以细胞接触和 剂量依赖的方式抑制CD4+和CD8+ T细胞的活性。
为分析CD25+ T细胞的推定的调节特性，进行了协调培养试验。 在首个系列的试验中，我们从特定供体分离出了 CD4+总群体和CD25+ 及CD25—片断。然后将全部的CD4+ T细胞与CD4+CD25+或CD4+CD25— T细胞亚群体以所示比例混合，并采用异源成熟DC进行刺激(图3A)。 CD4+CD25+ T细胞明显抑制全部CD4+ T细胞的增殖，并且在1:1比例 时实质上阻断其增殖(cpm表示CD25+ T细胞增殖的本底水平，见图 2A-D )。加入CD25- T细胞替代CD25+ T细胞轻微地加强增殖(未显 示)。由于CD4+CD25—在多克隆(见图1B)以及异源DC的刺激下， 迅速表达CD25和CD 122，即IL-2R的双链(数据未显示)。这个发现 表明CD4+CD25+ T细胞亚型的抑制活性不是简单地由于通过它们的 IL-2R对IL-2的消耗或被动吸收。CD4+CD25+ T细胞在全部CD8+ T细 胞上发挥了抑制活性虽然负调节不够强烈(图3B)。
在一组进一步的试马全中，确定了同源DC对CD4+CD25+ T细胞的 活化作用，对它们的调节特性的诱导是否足够。为此目的，将成熟DC 和。04+。025+ T细胞从相同供体(供体I)中产生/分离出来。另外， 从另 一供体(供体II)中分离出全部CD4+ T细胞及CD4+CD25+ T细胞
亚型。然后在缺乏(图3C，仅为CD4+)或存在从供体I或供体II中分 离出的、不同数目的CD4+CD25+ T细胞的情况下，采用异源成熟DC
(供体I)刺激全部CD4+T细胞(供体n)(图3C)。当采用异源的、 来自供体I的DC刺激时，获得自供体II的全部CD4+ T细胞如预期一 样旺盛地增殖(图3C,仅CD4+)。在供体I来源的CD4+CD25+ T细 胞存在的情况下(即与所用DC同源)，获得自供体II的全部CD4+ T 细胞的增殖(即同种反应性)根本不受抑制(图3C)。然而，当加入 供体II来源的CD4+CD25+ T细胞(即与所用DC异源)会发生潜在的 抑制作用(图3C)。抑制作用也可在有分别来源于三个不同供体的DC、 全部CD4+ T细胞、CD4+CD25+ T细胞的实.验中观测到。这些数据表明 为使CD4+CD25+ T细胞发挥调节作用，需要TCR介导的CD4+CD25+ T 细胞激活，也表明同源DC不足以诱导它们的抑制活性。
下一步，为了研究CD4+CD25+ T细胞的调节功能是否主要通过可 溶性因子介导或者需要细胞间接触，进行了 Transwell室实验(图3D )。 如图3D所示，在异源DC存在的情况下，CD4+CD25+ T细胞几乎完 全地抑制全部CD4+ T细胞的增殖。在Transwell室中两种群体的分离， 实际上破坏了它们的抑制效应。这些观测结果提示直接的细胞接触 对于CD4+CD25+ T细胞的抑制能力是必要的，因为Transwell室的半 透膜允许可溶性因子自由通过，却排斥直接细胞接触。Transwell实验 也证明通过CD4+CD25+ T细胞的IL-2的消耗不是造成抑制的机理。
尽管调节性细胞和响应细胞之间的密切接触是明显需要的，但是 通过Transwell实验既不能排除抗原呈递DC的定向也不能排除可溶性 因子的作用。因此，与培养板结合的抗CD3 Ab (与可溶性抗CD28Ab 结合)也被用作为 一种不依赖抗原呈递细胞的和多克隆T细胞刺激物。 在这种刺激下，单独的全部CD4+T细胞显示了强的增殖。如上文所述
(图2D.) , CD4+CD25+T细胞不增殖。在两种群体的共培养中，与对 照相比在比例为1:1时至少有75%的降低(数据未显示)。这些数据提 示，该调节作用不是主要通过APC功能的调节而发生的。细胞因子 IL-10和TGF-卩的中和抗体(分别只于所谓的Trl和Th3的抑制活性是关 键性的(Groux, H.等，Nature, 389:737-742 (1997); Fukaura, H.等,J.Clin. Invest., 98:70-77 (1996))不破坏CD4+CD25+ T细胞的调节活性，这证
明这些细胞因子至少在我们着眼的分析中不扮演主要的抑制角色。以
高剂量将IL-2和/或IL-15加入到共培养物中，促进了 CD4+CD25+T细 胞的增殖(见图2D)，降低了它们的抑制作用。然而，抑制活性很可 能并没有被破坏，因为说明数据时必须将CD4+CD25+ T细胞的显著增 殖考虑在内。
实施例4: CD4+CD25+T细胞占优势地分泌IL-10 为了分析并比较细胞因子特;f正，采用与培养板结合的抗CD3+抗 CD28激活刚刚分选的CD4+CD25+和CD4+CD25— T细胞。然后通过 ELISA分析上清液，并且通过核糖核酸酶保护分析研究RNA表达。另 外，进行细胞内细胞因子染色，以测定释放一定细胞因子的细胞的百 分数。如图4所示，CD4+CD25-T细胞占优势地分泌IFN-y和IL-2，少 量分泌IL-10和IL-4,类似Thl样特征。另一方面，CD4+CD25+T细胞 中占优势地分泌IL-IO,并且仅分泌低水平的IL-2、 IL-4及IFN-y，类似 Trl细胞。两种亚群体在RNA水平上的比较表明与CD25— T细胞相 比，CD25+ T细胞表达更多的IL-10,较少的IFN-y,类似水平的IL-2 mRNA。在CD4+CD25+ T细胞占优势地发现IL-1受体拮抗物(IL-lRa ) mRNA，而显著的IL-1卩mRNA水平仅存在于CD4+CD25- T细胞中。在 两种细胞类型中，TGF-卩以类似的低水平表达。
实施例5:激活的并随后固定的CD4+CD25+T细胞仍然显示调节能力。
通过所述的MAC⑧分选方法，从来自成人血液的全部CD4+ T细 胞中分离出CD4+CD25—和CD4+CD25+ T纟田月包。将CD4+CD25+ T细胞分 为三份。其中一份由10|iig/ml与培养板结合的抗CD3和10|ig/ml可溶 性抗CD28抗体活化过夜。第二天，将该部分与另一部分未活化 CD4+CD25+T细胞用2%曱醛固定1小时。第三部分不进行处理。洗涤 细月包三次。
单独的未固定CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞，及每一部分的 CD4+CD25+ T细胞与CD4+CD25— T细胞以1:1的比例混合后得到的混 合物，均采用固定的抗CD3和可溶性抗CD28活化。5天后，通过卩H]Tdr
掺入法测定增殖。图5显示的是5次独立实验中的一个代表，图中符号 意义如下
CD4+CD25- 未固定的CD4+CD25-细月包 CD4+CD25+ 未固定的CD4+CD25+细胞
Reg. 1:1 未固定的CD4+CD25+与CD4+CD25-T细胞以1:1混
合
Reg. 1:1
CD25+stim fix活化的固定CD4+CD25+ T细胞和未固定的 CD4+CD25—T细胞以1:1混合 Reg. 1:1
CD25+fix未活化的固定CD4+CD25+ T细胞与未固定的 CD4+CD25-T细胞以1:1混合。
权利要求
1. T细胞刺激物或抗原呈递细胞在制备用于体内诱导调节性CD4+CD25+CTLA-4+T细胞的药剂中的用途。
2. 权利要求1的用途，其中该物质适合用于治疗患者自身免疫疾病。
3. CD4+CD25+CTLA-4+T细胞在以下方面的用途(a) 用于识别其它生长和/或功能性修饰(抑制/增强)/凋亡或抗凋亡因子的间接体内分析；(b) 用于间接体内识别由CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞表达的分子，包括在该细胞上新的分子，或(or if)被认为是药物活性成分的呈递分子； 或(c) 用于间接体内识別调节性CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞的前体细 胞或后代。
4. 富集的CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞，或增殖T细胞，或固定T 细胞在制备用于过继性转移治疗的药剂；用于治疗与增强免疫性相关、 包括自身免疫性疾病的药剂；或者用于预防/治疗移植反应，包括移植 物抗宿主疾病和移植排斥反应的药剂上的用途。
5. 制备具有特定所需的抗原特异性T细胞受体的CD4+CD25+ CTLA-4+T细胞的方法，包括(1)采用抗原呈递细胞活化/刺激/增殖CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞，并体外呈递该抗原；或者(ii)利用表达于CD4+CD25+CTLA-4+调节性T细胞(的亚型)上的 特定T细胞受体的配体/抗体，或一种与CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞或其亚型上的特定T细胞受体结合的MHC肽复合物。
6. 权利要求5的方法，其中该抗原呈递细胞是未成熟或成熟的树突细胞(DC)。
7. 权利要求5或6的方法，其中抗原呈递细胞是由组织或任何限定或未限定的抗原脉沖/加载/补料接触，其中(i) 限定抗原是自身抗原，外源抗原，或者同种抗原/移植抗原，及(ii) 未限定抗原是来源于组织或细胞的抗原或来源于病原体的抗原。
8. 权利要求7的方法，其中抗原是寻常型天疱疮中的desmoglem 3; 白癜风中的melanA或酪氨酸酶；甲状腺炎中的曱状腺球蛋白，来源于 病原体的抗原，如丙肝，或者以来源于坏死或凋亡的细胞或组织的RNA 形式，或是以目的细胞与树突细力包/抗原呈递.细胞的杂合体的形式存在 的抗原，以其他形式运送进入到4对突状细胞或其他抗原呈递细胞的未 限定抗原。
9. 具有特定所需抗原特异性T细胞受体、可通过权利要求5 8任 意一项的方法获得的CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞、或通过将所需抗原 特异性的T细胞受体转染进间接体内分离或增殖的T细胞中获得的 CD4+CD25+CTLA-4+T细胞。
10. 药物组合物，包括权利要求9的T细胞，优选地该药物组合物 适用于治疗与免疫性增强相关的疾病，包括但不仅限于，自身免疫性疾病，移一直物抗宿主疾病和移植非斥。
11. 特异性地与位于T细胞上的CTL-A4 (CD152)实体结合的药 剂，选自抗CTL-A4 mAb，或与位于CD4+CD25+CTLA-4+细胞上的T 细胞受体结合的抗体或MHC肽复合物或其它配体，在制备用于 CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞的体内清除或功能性损伤的药物中的用途， 用以增强免疫反应，阻抑体内CD4+CD25+CTLA-4+ T细胞的调节，以 及增强肺瘤免疫性。
全文摘要
本发明涉及来自人类血液的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。具体地说，本发明提供抑制性和/或调节性人类CD4⁺CD25⁺T细胞，用于增殖该细胞的方法，及抑制性和/或调节性人类CD4⁺CD25⁺T细胞和增殖的T细胞作为调节性药剂的用途。
文档编号A61P37/00GK101385742SQ20081016570
公开日2009年3月18日 申请日期2002年3月12日 优先权日2001年3月12日
发明者D·迪克曼, 杰罗尔德·许勒 申请人:梅里克斯生物科学公司