包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途的制作方法

专利名称：包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及GnRH-p53系列融合蛋白及其抗肺瘤用途，具体涉及包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途，更具体地说，本发明涉及利用基因工程技术表达人类肿瘤抑制基因p53与促性腺激素释
备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
目前癌症仍然是严重威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率都很高，特别是腺癌更是临床上最难治疗的恶性肿瘤之一。尽管恶性肿瘤的早期诊断、手术与放化疗等方面的技术和手段近年来都有了长足的进步和发展，但是手术疗法仅限于早期治疗，而化疗和放疗严重的毒副作用往往使得肿瘤患者不能耐受从而限制了其使用剂量和长期应用，进而大大影响了治疗的效果。因此，研究高效低毒治疗肿瘤的方法，制备真正有效的抗肿瘤药物一直以来都是肿瘤治疗研究的目标。靶向性药物的研究是近年来研究的重点。这类靶向性药物可以消除放疗和化疗在杀伤胂瘤细胞的同时也大量杀伤正常细胞的缺点，特异性地针对肿瘤细胞进行杀伤。这类药物主要应用靶向分子(包括肿瘤细胞表面过量表达的受体的配体或单克隆抗体等)可以进入体内特异性地到达肿瘤部位，而与该靶向分子连接的效应蛋白或与其偶联的化疗药物可以在肺瘤部位杀伤肺瘤细胞，从而达到特异性治疗肺瘤的目的。
促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone, GnRH)，也称促黄体激素生成激素(LHRH)，是下丘脑分泌的十肽激素，其生理功能是调节垂体前叶促性腺激素的分泌。GnRH必须与高亲和力的跨膜受体结合才能发挥作用。这些跨膜受体属于七次跨膜受体G蛋白偶联受体家族。研究发现，除垂体外，在脑、卵巢、子宫内膜、乳腺、睾丸、前列腺、肾上腺、胰腺和肝脏、肺等肿瘤细胞上均有GnRH受体分布，特别是GnRHm受体特异性分布于肿瘤细胞。试验证实，当GnRH及其类似物与肺瘤细胞上的GnRH受体结合后可以对肿瘤细胞的增殖发挥一定抑制作用。因此，应用GnRH为配体的靶向融合蛋白特异性杀伤肿瘤细胞，是抗癌靶向治疗的一大创新。
p53是细胞内重要的肿瘤抑制因子，它可以通过诱导胂瘤细胞凋亡和诱发肿瘤细胞发生细胞周期阻滞而产生抗肿瘤作用。p53基因激活时产生的蛋白质分子量为53000。研究表明人类50。/。以上的肿瘤的发生都与细胞内p53基因突变、缺失有关，因此p53—直是近年来抗肿瘤研究的热点。p53参与凋亡、细胞周期抑制、DNA损伤与修复及衰老等过程。p53蛋白通过诱导编码三个跨膜蛋白Fas、 DR5和PERP，形成死亡诱导信号复合物激活caspases，导致凋亡发生，形成外部凋亡信号途径。p53基因突变的研究为p53基因治疗提供了基础，以p53功能为基础的肿瘤药物研究成为多年来的研究热点。例如应用腺病毒载体进行p53基因治疗，在动物实验和临床研究中都取得了肯定性的抗肿瘤药效。但是使用载体的安全性、基因表达水平的调控及其对病人毒性作用等问题还没有完全解决。p53蛋白可进行原核表达制备，外源性补充野生型p53蛋白或其活性调节分子，可直接发挥它们的肿瘤抑制作用。此法避免了基因治疗的栽体安全性问题，剂量可调，也同样能达到体内表达p53基因的抗肿瘤，增加放、化疗效果的目的。然而，p53发挥作用的部位在细胞内，如何将p53转导进入肿瘤细胞，以及如何避免其对正常细胞的毒性，相对延长它们在肿瘤细胞内的半衰期成为p53靶向性发挥其抗肿瘤作用的关键。
已有许多临床证据表明，在缺氧环境下肿瘤细胞发生一 系列适应性变化，使肿瘤细胞对放疗、化疗耐受，而且使肿瘤细胞更具有侵袭性，容易发生远处转移。缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是细胞适应缺氧的重要转录因子，参与缺氧时相应靶基因的调控。HIF-l属于bHLHPAS蛋白族，由HIF-la和HIF-ip各两个亚单位组成的杂四聚体蛋白。HIF-la对氧的依赖性较强，当周围环境的氧浓度下降时，HIF-la表达增加。常氧时HIF-la蛋白容易降解，其半衰期小于5分钟，而缺氧可以增加HIF-la蛋白的稳定性，HIF-la蛋白的降解阻止。在研究HIF-1的降解调控时发现，HIF-la的氧依赖性蛋白降解结构域(oxygen國dependent degradation domain, ODD)是HIF-la稳定的重要元件，非缺氧状态时，HIF-1多聚羟化酶(HIF-1prolyhydroxylase, HIF PH)羟化ODD核心脯氨酸(Pro 564)，使得pVHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product)与HIF-la亚基结合，进而多聚蛋白化HIF-la，最终使其被蛋白酶降解，而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)使HIFPH失活，以上的反应过程被阻断。HIF-la的ODD含有203个氨基酸残基，Harada等发现ODD的aa548-603可以发挥对其融合蛋白的降解调控作用。
如何有效地使p53靶向转导进入肿瘤细胞内，提高融合蛋白在肿瘤细胞内的稳定性以及相对延长融合蛋白在中瘤细胞内的作用时间，减小p53对正常细胞的杀伤作用，仍是本领域技术人员急待解决的问题。

发明内容
本发明的目的是提供一组包含p53基因的融合基因。本发明的另一目的是提供一组由所述融合基因表达的融合蛋白。本发明的其它目的包括提供包含所述融合基因的重组体和由本发明方法得到的融合蛋白以及所述重组体或融合蛋白在制药中的用途。
本发明人在研究中令人意外地发现，将GnRH与p53的基因融合以及由此表达所获得的融合蛋白，可以有效地提高p53的抗肿瘤作用；本发明人还发现，在上述融合基因中引入缺氧诱导因子基因序列以及由此表达所获得的融合蛋白，可以有效地抑制癌细胞的生长，为肿瘤的临床治疗提供了一种全新的有益方案。基于该发现，本发明人完成了本发明。
因此，本发明提供的各个方面和特征概述如下本发明第一方面提供一种融合基因，其包含促性腺激素释放激素(GnRH)基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。
根据本发明第一方面的融合基因，其具有选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA序列。具体地说，本发明第一方面提供的是编码重组融合蛋白GnRH-p53 、 GnRH-ODD國p53 、 GnRHlE-p53、或GnRHlII-ODD國p53的融合基因，并且所述各融合基因分别具有SEQIDNO: 1、 SEQ IDNO: 3、 SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA序列。
本发明第二方面提供一种重组融合蛋白，其包含促性腺激素释放
激素(GnRH)氨基酸序列和p53氨基酸序列，以及任选的介于GnRHM酸序列与p53氨基酸序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的氨基酸序列。
根据本发明第二方面的重组融合蛋白，其选自重组融合蛋白GnRH誦p53 、 GnRH國ODD画p53 、 GnRHffl-p53和GnRHlII-ODD-p53 ，并且所述重组融合蛋白分别具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQID NO: 6、和SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列。
基于本发明第一方面，本发明第三方面提供一种包含如本发明第一方面所述融合基因的表达型重组体，其表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒表达载体。
根据本发明第三方面所述的重组体，其选自pET28a-GnRH-p53 、pET28a画GnRH画ODD國p53、 pET28a國GnRHlII-p53 和
pET28a-GnRHm-ODD-p53原核表达载体。
根据本发明第三方面所述的重组体，其为IPTG诱导表达型重组体。具体地说，本发明第一方面所述各融合基因的表达是基于IPTG诱导来实现的。
根据本发明第三方面所述的重组体，其中基因表达盒的上游选自真核细胞启动子、原核细胞启动子和病毒启动子。
本发明第四方面提供一种根据本发明第三方面任一 项所述表达型重组体转化、转染或转导所获得的工程菌。
根据本发明第四方面所述的工程菌，其为工程菌GnRH-p53/DH5a 、 GnRH-ODD-p53/DH5a、 GnRHEI-p53/DH5a、或GnRHm-ODD-p53/DH5a。具体地说，它们分别是本发明第三方面所述的表达型重组体pET28a-GnRH-p53 、 pET28a-GnRH-ODD-p53、pET28a國GnRHm陽p53和pET28a-GnRHHI-ODD-p53转化入大肠杆菌DH5a所得。
根据本发明第四方面所述的工程菌，其为工程菌GnRH國p53/BL21/DE3 、 GnRH画ODD國p53/BL21/DE3 、GnRHlH-p53/BL21/DE3、或GnRHlII-ODD-p53/BL21/DE3。具体地说，它们分别是本发明第三方面所述的表达型重组体pET28a-GnRH-p53 、 pET28a國GnRH國ODD-p53 、 pET28a國GnRHm画p53和pET28a-GnRHDI-ODD-p53转化入大肠杆菌/BL21/DE3所得。
本发明第五方面提供一种生产重组靶向融合蛋白GnRH-p53 、GnRH-ODD-p53、 GnRHEI-p53和GnRHlII-ODD-p53的方法，其包括培养本发明第四方面任一项的工程菌，并且分离和纯化所述的融合蛋白。所述的"培养"可以本领域已知的任何在合适表达的条件下进行。
本发明第六方面提供本发明第三方面所述重组体在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途。所述的重组体可以作为所述药物的组成部分之一或者作为所述药物的唯一成分。
根据本发明第六方面所述的用途，其中所述的药物用于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射、腹腔内注射。
本发明第七方面提供本发明第二方面所述融合蛋白在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物肺瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途。所述的融合蛋白可以作为所述药物的组成部分之一或者作为所述药物的唯一组分。
根据本发明第七方面所述的用途，其中所述的药物用于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射、腹腔内注射。
8本发明第八方面提供了一种药物组合物，其含有本发明上述的融合蛋白或重组体，以及任选的药学可接受的载体。下面进一步详细地描述本发明。
本发明提供的编码重组融合蛋白GnRH-p53 、 GnRH-ODD-p53、GnRHm-p53、或GnRHEI-ODD-p53的融合基因分别具有SEQ IDNO: 1、 SEQIDNO: 3、 SEQIDNO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA序列；以及本发明提供的选自GnRH-p53 、 GnRH-ODD-p53、GnRHm-p53和GnRHlII-ODD-p53的重组融合蛋白分别具有SEQ IDNO: 2、 SEQIDNO: 4、 SEQIDNO: 6、和SEQ ID NO: 8中所示的"ll&酸序列。其中各序列详情参见序列表，它们分别简述如下
SEQ ID NO: 1是GnRH-p53基因序列，其中l)序列1-33为GnRH基因序列，2)序列34-1212为p53基因序列，3)序列1213-1215为终止密码子序列。
SEQIDNO: 2是GnRH-p53基因编码的^J^紗列，其中1)序列1-11为GnRH序列，2)序列12-404为p53蛋白序列。
SEQIDNO: 3是GnRH-ODD-p53基因序列，其中l)序列1-33为GnRH基因序列，2)序列34-204为缺氧诱导因子序列，3)序列205-1383为p53基因序列，4)序列1384-1386为终止密码子序列。
SEQ ID NO: 4是GnRH-ODD-p53基因编码的^J^紗列，其中l)序列1-11为GnRH序列，2)序列12-68为缺氧诱导因子依赖性蛋白降解结构域序列，3)序列69-461为p53蛋白序列。
SEQIDNO: 5是GnRHEI-p53基因序列，其中l)序列1-33为GnRHlE基因序列，2)序列34-1212为p53基因序列，3)序列1213-1215为终止密码子序列。
SEQIDNO: 6是GnRHlII-p53基因编码的氨基醋列，其中l)序列1-11为GnRHm序列，2)序列12-404为p53蛋白序列。
SEQ ID NO: 7是GnRHlH-ODD-p53基因序列，其中l)序列1-33为GnRHm基因序列，2)序列34-204为缺氧诱导因子序列，3)序列205-1383为p53基因序列，4)序列1384-1386为终止密码子序列。
SEQIDNO: 8是GnRHlII-ODD-p53基因编码的氨基紗列，其中l)序列1-11为GnRHm序列，2)序列12-68为缺氧诱导因子依赖 性蛋白降解结构域序列，3)序列69-461为p53蛋白序列。
本发明的内容主要涉及编码新型的重组靶向融合蛋白 GnRH-ODD-p53和GnRHm-ODD-p53的基因、包含所述基因的表达 型重组体、所述表达型重组体的工程菌、此类工程菌表达和分离的靶 向融合蛋白以及该类融合蛋白对恶性肿瘤细胞的特异性杀伤作用等方 面。因此，本发明主要在于将具有潜在治疗作用的基因与可以转导蛋 白进入细胞的配体、加速融合蛋白在正常组织中代谢的氧依赖性蛋白 降解结构域进行有机的融合，通过原核表达载体表达融合蛋白，经过 蛋白的纯化和复性，提供一种可以进入肿瘤细胞，在正常组织中快速 代谢，而在缺氧的肿瘤组织中诱导细胞凋亡的融合蛋白，达到治疗肿 瘤的目的。本发明的还在于提供该融合蛋白的制备方法及其用于制备 治疗肿瘤药物的应用。
为此，本发明提供一种GnRH/GnRHm、氧依赖性蛋白降解结构 域和人肿瘤抑制基因的表达栽体。该表达载体是将由DNA克隆技术构 建的原核表达栽体与上述融合蛋白基因表达相结合，构建成一个能在 原核细胞中扩增、繁殖，表达的肺瘤抑制蛋白的融合序列。本文所述 的术语"表达载体"，其含义是本领域技术人员公知的，并且通常是指 含有一个启动子顺序，能有效地促使插入的目的基因进行转录，进而 翻译出该插入基因编码的蛋白产物的载体。在本发明中，术语"表达 载体"可以是本领域技术人员已知的任何一种原核表达载体，并且优 选的原核表达栽体是pET28a。本文所述术语"人肺瘤抑制基因，，所述 可以是本领域技术人员已知的具有肿瘤抑制作用的基因中的任一种， 并且最优选的基因为p53基因，虽然本文主要以p53基因作为主要实 施方案，但本领域技术人员根据本发明的精神可以延及其它种类的人 肿瘤抑制基因。所述表达载体由载体与GnRH-ODD-p53和 GnRHlE-ODD-p53基因构建而成，定义为GnRH-ODD-p53和 GnRHm-ODD-p53表达栽体，其优选序列为SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8中所示的氨基M列。
另一方面，本发明提供了编码所述融合蛋白的SEQIDNO: 1、 3、5、 7中所示的核酸序列、含有上述核酸序列的表达载体以及包含所述 载体的工程菌 GnRH-p53/DH5a 、 GnRH-ODD-p53/DH5a 、 GnRHlE-p53/DH5a 、 GnRHm画ODD-p53/DH5a ，
GnRH國p53/BL21/DE3、GnRH-ODD-p53/BL21/DE3 、 GnRHm國p53/BL21/DE3、 GnRHlII-ODD画p53/BL21/DE3。它们分别是 通过表达型重组体pET28a-GnRH-p53 、 pET28a-GnRH-ODD-p53、 pET28a-GnRHm國p53和pET28a-GnRHm漏ODD誦p53转化入大肠杆菌 DH5a所得，以及分别是通过表达型重组体pET28a-GnRH-p53 、 pET28a國GnRH國ODD-p53、 pET28a國GnRHEI画p53 和
pET28a-GnRHm-ODD-p53转化入大肠杆菌/BL21/DE3所得。所述的 转化是本领域技术人员公知的，并且可以参照公知的教科书或工具书 的描述的方法进行操作。
本发明还提供了靶向融合蛋白对恶性肿瘤细胞具有特异性杀伤作 用的试验证据。
用于本文的术语"哺乳动物"是指罹患本发明所述肿瘤和/或癌症 的受试者，其包括但不限于猪、狗、猫、牛、羊等家畜和人类。优选 地，所述的哺乳动物是人类。
用于本文的术语"肿瘤，，和"癌"，其含义和两者关系是本领域技术 人员/>知的，并且二者在许多情况下可以互换4吏用。所述的肿瘤和/或 癌可以是医学上已知的任何肿瘤，包括恶性肿瘤和/或癌症。优选地， 所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)包括，但不限于
恶性肿瘤，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、 肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、头和颈癌、食管癌、胆囊癌、 卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌(包 括鳞状细胞癌)；
淋巴系统的造血肿瘤，包括但不限于白血病、急性淋巴细胞白血 病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴癌、T-细胞淋巴癌、霍奇金 淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛细胞淋巴癌、外套细胞淋巴瘤、骨髄瘤 和Burkett's氏、淋巴癌；
骨髓系统的造血胂瘤，包括但不限于急性和慢性髓细胞性白血病、
ii间质成因的肿瘤，包括但不限于纤维肉瘤和横紋肌肉瘤； 中枢和周围神经系统的肿瘤，包括但不限于星形细胞瘤和神经胶
质瘤；以及
其他肿瘤，包括但不限于黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、、 曱状腺滤嚢癌和卡波氏肉瘤。
更优选地，所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)选自乳腺癌、肝 癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌、膀胱癌、结肠癌、 肾癌、头和颈癌、食管癌、胆嚢癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫颈癌、曱 状腺癌、前列腺癌和皮肤癌。
更进一步优选地，所述的肿瘤(包括恶性肿瘤和/或癌症)选自乳腺 癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌。
根据本发明所述重组体在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或 预防哺乳动物肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途，以及 所述融合蛋白在制备用于治疗哺乳动物实体肿瘤和/或预防哺乳动物 肿瘤转移及手术切除后肿瘤再生的药物中的用途，其中所述的药物其 可以通过本领域已知的任何途径给予有治疗需求的受试者，例如哺乳 动物特别是人类。所述的给药途径包括但不限于全身给药、皮肤局 部给药、病灶区局部给药等。特别地，所述的给药途径包括但不限于 静脉内、动脉内、肌内、经口、经皮、腹膜内、肿瘤病灶区、经肺吸 入或吹入、胃肠外、经粘膜、经鼻、经直肠。更特别地，所述的给药 途径包括但不限于静脉内和肿瘤病灶区。例如，非限制性地，根据 本发明的含有所述重组体或融合蛋白的药物其可通过肿瘤病灶区局部 注射或者通过静脉注射给药。具体而言，例如，可以参考有关重组质 粒和腺病毒的本领域公知的给药方式给予有治疗需求的受试者；进一 步地，例如参考Clayman GL et al. J Clin Oncol， 1998， 16 :2221-2232 和Martin B et al. Cancer Res ,1999， 59 : 1391-1399中的方法通过肿瘤 部位局部注射给药，或者参考Reid T et al. Cancer Gene Ther， 2002 ， 9:979-986中的方法通过静脉注射给药。以上文献以其全部内容通过引 用并入本文。根据本发明，所述的药物可以是本领域公知的任何可用于给药的 药物形式，包括药物组合物、药物制剂等。虽然本发明所述用途中涉 及的药物可以经口、经皮的途径给药，并且这些给药方式也是本发明 的一部分。但是，本领域技术人员清楚适合于本发明所述用途的最优 选给药途径是胃肠外途径。对于本发明的实施而言，所述用途中涉及 的药物优选是用于胃肠外给药的制剂，包括但不限于局部注射用制剂 和全身注射用制剂，具体剂型包括但不限于注射用溶液剂和注射用粉 针剂。更优选的，所述的药物是无菌的注射用含水溶液剂，或者是无 菌的用于临床使用前用注射用水复溶配制的粉针剂，特别是冷冻干燥 粉针剂。
另外，根据下文中提供的研究结果，本领域技术人员可以容易地 确定在哺乳动物中使用时有效剂量。可以将一天的剂量在一天中一次 性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、 四个或更多个小剂量以合适的间隔给药。所述小剂量可以配制成单元 剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应 量。当然，也可以以一定的时间周期给药，例如一天给药一次、两天 给药一次、 一周给药一次、 一月给药一次等。
本发明所述用途中涉及的药物在具体的临床案例中，它们的具体 使用量可因多种因素而可能需要作相应的变化，这些因素包括但不限
于受试者病况的严重程度，受试者的年龄、性别、体重，给药途径， 药物剂型等等。
本发明还涉及所述融合蛋白的表达、纯化和复性的方法，所述的 表达、纯化和复性的方法是本领域技术人员公知的，并且可以参照公 知的教科书或工具书的描述的方法进行操作。优选的方法包括将编 码所述融合蛋白和His标签质粒(包括，但不限于，例如pET质粒)转化 宿主菌BL21(DE3)，培养在25。C ~ 42。C，取出活化菌液，以5%~20% 的比例在新鲜培养基中培养至OD6。。值为0.5 ~ 2.0，加入诱导剂IPTG至 终浓度为0.4 lmM，诱导时间为3 24h,收集诱导表达的菌体，PBS 洗涤，用pH8.5 11.5的10mmol/LTris緩冲液重悬菌体，振荡混匀，置 水浴超声10 25min破菌，回收包涵体。用6-10M尿素溶解，用镍柱或层析柱纯化包涵体。采用连续梯度法复性目的蛋白。
另一方面，本发明提供了所述融合蛋白或重组体用于治疗实体瘤 的药物用途。本发明特别涉及含有所述融合蛋白或重组体的药物组合 物，为选自适于静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注 射、器官注射和胸腔、腹腔内注射的剂型。所述的药物组合物含有本 发明所述的融合蛋白或重组体，还可以任选地含有一种或多种药学可 接受的栽体，例如所述药物组合物为注射用粉针剂时可以含有赋形剂 例如甘露醇。
本发明从肿瘤细胞的特点入手，在GnRH和p53融合蛋白中引入 ODD，通过肺瘤细胞膜上的GnRH受体介导融合蛋白进入细胞内，利 用ODD加速融合蛋白在正常细胞内的降解，相对延长其在胂瘤细胞内 的半衰期达到p53蛋白靶向抗胂瘤的目的。本发明提供的重组靶向融 合蛋白 GnRH-p53 、 GnRH-ODD國p53 、 GnRHEI-p53 、 GnRHEI-ODD-p53，以p53为肿瘤治疗的效应分子，通过促性腺激素 释放激素(GnRH)与其受体特异结合介导蛋白进入相应的肿瘤细胞，应 用氧依赖性降解区域(ODD)减轻p53对正常组织的损伤，增强蛋白对 实体肺瘤的靶向作用。经研究在细胞和动物整体水平上，融合蛋白具 有抑制肿瘤生长作用，并且其肝、肾等毒副作用较轻微。使用本发明， 可以制备抗肿瘤蛋白制品，在肺瘤治疗方面具有很好的应用前景。


图l显示了 pET-GnRH/GnRHm-ODD-p53构建示意图。 图2显示了pET-GnRH/GnRHm-ODD國p53经Nhe I和Xho I双 酶切鉴定。图中各标签分别表示l为pET-GnRH-p53; 2为 pET-GnRH-ODD國p53; 3为pET國GnRHlII-p53; 4为pET國GnRHEI國ODD -p53; M为DNAMarker,从下到上分别为500、 1000、 2000、 3500、 5500、 7000bp。
图3显示了 pET誦GnRH/GnRHm-ODD誦p53表达(120/0 SDS誦PAGE)。 图中从左到右共9条电泳带，依次分别是pET28a-GP(0h)、 pET28a-GP(4h) 、 pET28a國GOP(0h) 、 pET28a-GOP(4h) 、 Marker 、pET28a-G3P(0h) 、 pET28a國G3P(4h) 、 pET28a-G3OP(0h)、 pET28a画G30P(4h) 。
M为标准蛋白；GP为GnRH-p53 ; GOP为 GnRH-ODD國p53; G3P为GnRHHI-p53; G30P为GnRHlII-ODD-p53。 图中所示Marker的分子量从上到下分别为97.4、 66.2、 43.0、 31.0、 20.1、 14.4 kD。
图4显示了 GnRH/GnRHm-ODD-p53的Western免疫印迹 (Western免疫印迹)。图中从左到右共6条色带分别为p53、 GP、 GOP、 p53、 G3P、 G30P
图5显示了复性后蛋白的SDS-PAGE(12。/o)图。图中从左到右共5条 电泳带，依次分别是GP，表示GnRH-p53; GOPGnRH-ODD-p53， 表示；G3P，表示GnRHm-p53; G30P，表示GnRHlII-ODD-p53; Marker,表示才示准蛋白。
图6显示了免疫细胞化学方法检测H1299细胞中融合蛋白的显微图 (200x)，其中图a e依次为无血清培养基、p53、 GP、 GOP、 G3P、 G30P。
图7显示了常氧及缺乏氧条件下GnRH-p53系列融合蛋白对细胞的 影响。A、 B、 C、 D四个图的横坐标均为蛋白剂量(ng/mL)。其中，A 图是融合蛋白对H1299细胞生存抑制实验结果(MTT法，缺氧)；B图是 融合蛋白对H1299细胞生长抑制作用研究结果(MTT法，缺氧48h); C 图是融合蛋白对H1299细胞生长抑制作用研究结果(MTT法，常氧)；D 图是融合蛋白对H1299细胞生长抑制作用研究结果(MTT法，常氧48h)。
图8显示了 GnRH-p53系列融合蛋白对荷瘤动物的影响。图中 ##表示与TC组比较P<0.01， #表示与TC组比较P<0，05; SPSS统计 分析软件，ANOVA; V=(LW2)/具体实施例方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为， 这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以 任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性
的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员 清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本 领域公知的。
例l、制备p53基因
取人胎总RNA lg，按cDNA synthesis system操作指南依次加入反应 成分。反应总体积20nl， 42。C反应15min后，95。C灭活5min，作为PCR 模板。以P7 : GAGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTC ; P4 : CCGTCGACTTAGTCTGAGTCAGGC为引物，PCR人全长p53基因。
分别取栽体pET28a和p53PCR片段，用EcoRI和Sal I进行双酶 切，在37。C下处理3h，再用凝胶回收试剂盒回收。pET载体片段与p53 片段以1:3的比例混合，加3U的T4连接酶，16。C反应16h，将反应产物 转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴 定。阳性克隆经过测序正确后命名为pET-p53。将pET-p53质粒转化于 感受态大肠杆菌BL21中。
例2、制备GnRH-ODD-D53基因和GnRHm-ODD-D53基因 采用重叠延伸法构建GnRH和GnRHm基因。将GP1 : CTAGCATGGAGCACTGGTCCTATGGACTGCGCCCTGGAA 和 GP2: AGCTTTCCAGGGCGCAGTCCATAGGACCAGTGCTCCATG 等量混合加入PCR^应体系，反应30次，得到片段(GnRH)。 同法将G3P1:
混合加入PCR反应体系，反应30次，得到片段(GnRHm)。
将Nhe I和Hindm双酶切的pET-p53载体与GnRH或GnRHm片段 以1:3的比例混合，加T4连接酶，16。C反应16h,将反应产物转化于感 受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒PCR鉴定。阳性 克隆经过测序正确命名为pET-GnRH-p53(GP)和
16pET-GnRHm-p53(G3P)。将pET國GnRH國p53和pET隱GnRHm-p53质粒转 化于感受态大肠杆菌BL21中。
用Hindm和BamH I双酶切(全基因合成ODD， pET-GnRH-p53和 pET-GnRHEI-p53) ， 37。C处理2h后用凝胶回收试剂盒回收ODD片段及 pET-GnRH-p53和pET-GnRHm-p53载体，将载体与片段以l:3的比例混 合，加T4连接酶，16。C反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌 DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒Nhe I和Xho I双酶切鉴定(参 见图l、图2)。 阳性克隆命名为pET-GnRH-ODD-p53(GOP)和 pET-GnRHm-ODD-p53(G30P)。将其质粒转化于感受态大肠杆菌 BL21中。
例3、制备GnRH-ODD-D53和GnRHm-ODD-D53融合蛋白 1)、 GnRH曙ODD画D53和GnRHm画ODD-D53的表达 分别挑取转化pET-GnRH-p53和pET-GnRHm-p53的阳性菌落置 LB培养液中(含卡那霉素60g/ml)活化，再按5-20%接种于2YT培养液 中，培养至OD鋼值为0.5 2.0时，加入IPTG至0.4 ~ lmM诱导表达。收 集诱导表达3 24h的菌体，PBS洗涤。
2、、 GnRH-ODD-o53和GnRHm-ODD-D53的Western免疫印迹鉴定 经诱导表达获得的融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(12% SDS-PAGE，见图3)分析表明沉淀中有目的蛋白，其分子量与理论值 相符。经Western免疫印迹，用p53单克隆抗体鉴定分析为GnRH-p53 系列融合蛋白(见图4)。图4中，p53、 GP、 GOP、 G3P、 G30P依次分 别表示的是p53蛋白、重组融合蛋白GnRH-p53 、重组融合蛋白 GnRH-ODD-p53 、重组融合蛋白GnRHlII-p53 、和重组融合蛋白 GnRHm画ODD画p53。
3) 、包涵体洗涤
以上所得菌体用10 mM磷酸緩沖液(pH 7.6)重悬，超声破菌，在4。C 下以10000 rpm离心，沉淀部分用0.5-4M尿素、100mmol/L NaCl、 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)在4。C下洗涤过夜。
4) 、包涵体溶解及复性
17以10000rpm离心15分钟，收集沉淀，用6-10moI/L尿素(溶于20mmol/L三羟甲基胺基曱烷緩冲液，pH 8.0-12.0)溶解，緩慢加入等体积复性液(含20mmol/L Tris、 lmmol/L EDTA、 0.1mmol/L GSH;0.01mol/LGSSG)，以12000rpm离心15分钟，取上清装入Mr 50000透析袋，置4-12。C中釆用连续梯度透析法透析至复性液，用生理盐水透析3次。复性后蛋白进行SDS-PAGE(12。/。)，见图5。透析后蛋白溶液至水箱过夜冷冻后进行真空冷冻干燥，-80°<:存放备用。
例4、 GnRH-ODD-D53和GnRHm-ODD-D53活性测定
1) 、 GnRH-ODD-D53和GnRHm-ODD-D53跨膜进入细胞实验
将例3获得的GnRH-p53系列融合蛋白以40ng/mL的终浓度加入H1299细胞(p53缺陷型人肺腺瘤细胞)中，同时以等量无血清培养基及p53蛋白作为对照，2h后以抗p53单克隆抗体为一抗做免疫组织化学检测，对照组分别用无血清培养基、p53蛋白加入H1299细胞中，结果表明，GP、 GOP、 G3P、 G30P均能进入细胞内，并以细胞核中分布为主(见图6)。
2) 、 MTT法测定常氣及缺乏氣条件下GnRH-p53系列融合蛋白对细胞的影响
用不含小牛血清的RPMI 1640培养基溶解融合蛋白GP、 GOP、G3P、 G30P，用0.22nm滤器过滤除菌后4。C存放备用。
收集对数生长期的H1299细胞，用含10。/q小牛血清的RPMI 1640完全培养基将其稀释成lxl()s个/mL的浓度，以100jil/孔接种于96孔细胞培养板中，在37。C和5。/。C02下培养过夜。
将融合蛋白GP、 GOP、 G3P、 G3OP用RPMI 1640完全培养基稀释后分别分为6个剂量组，蛋白终浓度为5jig/mL、 10ng/mL、 20吗/mL、30ng/mL、 40ng/mL、 50jig/mL，以100^1/孔的量加入已经接种H1299细胞中的96孔板中，同时以等量p53蛋白作为对照，将培养板分别常氧和缺氧(氧含量^l.l。/。)条件下培养48h后，以20fil/孔的量加入MTT(5g/L)，在37。C和5。/。C02的条件下继续培养4h。分别吸弃孔中培养基，以150nl/孔的量加入DMSO，在室温下轻微振荡，直至沉淀溶解，用酶标仪测定A492,结果见图7。
3)、 GnRH-p53系列融合蛋白对荷瘤动物的影响
将H1299细胞按规定量(5xl(^个细胞/只动物)在BALB/c棵鼠(雌性，18-22g， 6-8周龄)右肩胛下侧注射，14天后建成模型。将荷瘤动物随机分成5组，分别为TC组(肿瘤对照组)、GP组(GnRH-p53)、 GOP组(GnRH画ODD國p53)、 G3P组(GnRHIII画p53) 、 G30P组(GnRHIII-ODD画p53), 6只/组。给药组动物剂量为5mg/kg，对照组给予等体积的生理盐水，腹腔注射(ip)，连续给药12天，实验结束之后处死动物，测定各组动物瘤体的直径，计算瘤体的体积，结果见图8。从图可见，本发明提供的四种融合蛋白可以在动物体内明显抑制肿瘤生长。
本发明利用基因工程、蛋白质纯化等手段，制备出具有穿膜活性、在缺氧环境中稳定及具有生物学活性的蛋白或多肽，并指导制备出具有药用价值的生物栽体药物，GnRH-ODD-p53在体外缺氧环境可以抑制肿瘤细胞生长，在体内可以抑制移植瘤在小鼠体内的生长，延长小鼠的存活时间。用于人类多种恶性肿瘤的治疗，具有重要的医学研究及临床使用价值。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所<120>包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途<130〉 IDC080094<160> 8
<170〉 Patentln version 3.4
<210〉 1
〈211> 1215
<212> 腿<213〉人工序列<220>
〈223> GnRH-p53基因序列<柳〉1
atggagcactggtcctatggactgcgccctggaatgga^ggagccgcagtcagatcctagc60
gtcgagccccctctgagtcagggi肌cattttcagacctatggaaactacttcctgaaeiac120
aacgttctgtcccccttgccgtccc肪gcs3tggstg3tttgstgctgtcCCCgg3Cg8t180
attgaaceiatggttcactga8gaccc3ggtCC6lg8tgEiagctcccagaatgccagaggct240
gctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcElCC3gCCCCC300
tcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctacc柳gcagctacggtttc360
cgtctgggcttcttgcattctggg3CElgCCasgtctgtgacttgcacgtactcccctgcc420
ctcaacaag3tgttttgccasctggcc肌gacctgccctgtgcagctgtgggttgattcc480
acacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagC3gtcacagcacatg540
acggsggttgtgaggcgctgCCCCC3CCBtgagcgctgctcagatagcgatggtctggcc600
cctcctcagcatcttatccg8gtgg肌ggaaatttgcgtgtggagtatttgg3tgacag8660
aacacttttcgeicatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgt720
gtccaccatccactacaactacatgtgtaacEigttcctgcatgggcggcatgaaccggagg780
cccatcctcaccatcatcacactggaeiggictccagtggtaatctactgggacggaacagc840
tttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctc900
cgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcact肌gcgagcactgccc960
aacaacaccagctcctctccccagccaaaga^g肌acc3ctggatggagaatatttcacc1020
cttcagatccgtgggcgtgagcgcttcggigatgttccgagagctgaatgaggccttggaa1080
ctcaaggatgCCCElggCtggg肌ggagcc3gggggg柳agggctcactccagccacctg1140
aagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaag8CBgaaggg1200
cctgactcag1215
〈210〉 2
<211> 404
〈212〉 PRT
〈213> E.coli〈220>〈223〉 GnRH-p53基因编码的氨基酸序列<400> 2
Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro
Met1
Ser
Leu
Gin
Phe
65
Ala
Ala
Thr
Thr
Phe145Thr
Ser
Cys
Glu
His225Thr
Met
Gly
Pro
Glu305Asn
Glu
Asp
Trp
Ala
50
Thr
Pro
Pro
Tyr
Ala130Cys
Pro
Gin
Ser
Gly210Ser
Thr
Asn
Asn
Gly290Pro
Asn
His
Pro
Lys
35
Met
Glu
Arg
Ala
Gin115Lys
Gin
Pro
His
Asp195Asn
Val
lie
Arg
Leu275Arg
His
Thr
Ser
20
Leu
Asp
Asp
Val
Pro100Gly
Ser
Leu
Pro
Met180Ser
Leu
Val
His
Arg260Leu
Asp
His
Ser
5
Val
Leu
Asp
Pro
Ala
85
Ser
Ser
Val
Ala
Gly165Thr
Asp
Arg
Val
Tyr245Pro
Gly
Arg
Glu
Ser325
Glu
Pro
Leu
Gly
70
Pro
Trp
Tyr
Thr
Lys150Thr
Glu
Gly
Val
Pro230Asn
lie
Arg
Arg
Leu310Ser
Pro
Glu
Met
55
Pro
Ala
Pro
Gly
Cys135Thr
Arg
Val
Leu
Glu215Tyr
Tyr
Leu
Asn
Thr295Pro
Pro
Pro
Asn
40
Leu
Asp
Pro
Leu
Phe120Thr
Cys
Val
Val
Ala200Tyr
Glu
Met
Thr
Ser280Glu
Pro
Gin
Leu
25
Asn
Ser
Glu
Ala
Ser105Arg
Tyr
Pro
Arg
Arg185Pro
Leu
Pro
Cys
lie265Phe
Glu
Gly
Pro
10Ser
Val
Pro
Ala
Ala
90
Ser
Leu
Ser
Val
Ala170Arg
Pro
Asp
Pro
Asn250lie
Glu
Glu
Ser
Lys330
Gly Met Glu Glu Pro Gin15
Gin Glu Thr Phe Ser Asp30
Leu Ser Pro Leu Pro Ser45
Asp Asp lie Glu Gin Trp60
Pro Arg Met Pro Glu Ala75 80Pro Thr Pro Ala Ala Pro95
Ser Val Pro Ser Gin Lys110
Gly Phe Leu His Ser Gly125
Pro Ala Leu Asn Lys Met140
Gin Leu Trp Val Asp Ser155 160Met Ala lie Tyr Lys Gin175
Cys Pro His His Glu Arg190
Gin His Uu lie Arg Val205
Asp Arg Asn Thr Phe Arg220
Glu Val Gly Ser Asp Cys235 240Ser Ser Cys Met Gly Gly255
Thr Uu Glu Asp Ser Ser270
Val Arg Val Cys Ala Cys285
Asn Leu Arg Lys Lys Gly300
Thr Lys Arg Ala Leu Pro315 320Lys Lys Pro Leu Asp Gly335
21Glu Tyr Phe Thr Leu Gin lie Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe
340 345 350
Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys
355 360 365
Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys
370 375 380
Gly Gin Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Uu Met Phe Lys Thr Glu Gly385 390 395 400
Pro Asp Ser Asp
〈210> 3
<211> 1386
<212〉 DNA<213>人工序列<220>
<223> GnRH-ODD-p53基因序列
〈400〉 3
atggagcactggtcctatggactgcgccctggaatgaeicccattttctactcaggacaca60
gattt叫3cttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttccagttacgt120
tccttcgatcagttgtcaccattagaaagcagttccgcaagccctgaaagcgcaagtcct180
c肌agca^gttacagtattccagatggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccc240
cctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaacgttctg300
tcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaa360
tggttcactga^geiccc3ggtccagatg肌gctcccagaatgccagaggctgctccccgc420
gtggcccctgcaccagcagc tcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggccc480
ctgtcatcttctgtxccttccceLggiaaEicctaccagggcagctacggtttccgtctgggc540
ttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaag600
atgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggUgattccaceicccccg660
cccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggtt720
gtgaggcgctgCCCCC8CC3tgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcag780
catcttatccgagtgg肌gg3￡l￡ltttgCgtgtgg3gteitttgg3tg3C3g838C8Ctttt840
cgaca^3gtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatc900
cactacaactacatgtgt肌cagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctc960
accatcatcacsctggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtg1020
cgtgtttgtgcctgtcctggg柳gaccggcgcacEigaggaagagaatctccgcaagaaa1080
ggggagcctcaccacgagctgcccccagggeigcactaagcgagcactgcc1140
agctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatc1200
cgtgggcgtg叫cgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggat1260
gCCCELggCtgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtcceieis1320
肌gggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactca1380
gact犯1386<210> 4
〈211〉 461
〈212〉 PRT
<213> E.coli<220>
<223> GnRH-ODD-p53基因编码的氨基酸序列
<400> 4
Met Glu His
Thr Gin Asp
Met Asp Asp35
Glu Ser Ser50
Thr Val Phe65
Pro Leu Ser
Asn Asn Val
Leu Ser Pro115
Asp Glu Ala
130Pro Ala Ala145
Leu Ser Ser
Phe Arg Leu
Thr Tyr Ser195
Cys Pro Val
210Val Arg Ala225
Val Arg Arg
Ala Pro Pro
Tyr Leu Asp275
Trp Ser Tyr Gly5
Thr Asp Leu Asp20
Asp Phe Gin Leu
Ser Ala Ser Pro55
Gin Met Glu Glu70
Gin Glu Thr Phe85
Leu Ser Pro Leu100
Asp Asp lie Glu
Pro Arg Met Pro135
Pro Thr Pro Ala150
Ser Val Pro Ser165
Gly Phe Leu His180
Pro Ala Leu Asn
Gin Leu Trp Val215
Met Ala lie Tyr230
Cys Pro His His245
Gin His Leu lie260
Asp Arg Asn Thr
Leu Arg Pro Gly Met Asn Pro Phe Ser
10 15Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr lie Pro
25 30Arg Ser Phe Asp Gin Leu Ser Pro Leu40 45Glu Ser Ala Ser Pro Gin Ser Thr Val60
Pro Gin Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro
75 80Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu
90 95Pro Ser Gin Ala Met Asp Asp Leu Met
105 110Gin Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro120 125Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala140
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro155 160Gin Lys Thr Tyr Gin Gly Ser Tyr Gly
170 175Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys
185 190Lys Met Phe Cys Gin Leu Ala Lys Thr200 205Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg220
Lys Gin Ser Gin His Met Thr Glu Val235 240Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu
250 255Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu
265 270Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr280 285
23Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr lie His Tyr Asn Tyr
290 295 300
Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro lie Leu 305 310 315 320
Thr lie lie Thr Uu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Uu Gly Arg Asn
325 330 335
Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr
340 345 350
Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro
370 375 380
Gin Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gin lie 385 390 395 400
Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu
405 410 415
Glu Leu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala
420 425 430
His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser Arg His
435 440 445
Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 450 455 460
<210> 5
<211> 1215
<212〉 DNA 〈213>人工序列 <220>
<223> GnRHm-p53基因序列
〈400〉 5
atggagcactggtcccacgactggaagcctggaatggaggagccgcagtcagatcctagc60
gtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggELaeictEicttcctgaaaac120
aacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggeitgatttgatgctgtccccggacgat180
8ttg肌C肌tggttcactgaag3ccc3ggtccagatgaagctcccagaatgcc卿ggct240
gctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccc300
tcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccaga犯BCctaccagggcagctacggtttc360
cgtctgggcttcttgcattctggg8C3gCCaagtctgtgaCttgC8Cgt3ctcccctgcc420
CtC￡L￡lC￡l￡lg8tgttttgccaactggcc肌gacctgccctgtgcagctgtgggttgattcc480
aceicccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatg540
stcggaggttgtgaggcgctgcccccacca>tgagcgctgctcagatagcgatggtctggcc600
cctcctcagcatcttatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgac卿660
aacacttttcgscatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgt720
accaccatccactacaactacatgtgt肌cagttcctgcatgggcggcatgaaccggagg780
24cccatcctca tttgaggtgc cgcaagaaag aacaacacca cttcagatcc ctcaaggatg 犯gtccaa犯 cctgactcag
ccatcatcac gtgtttgtgc gggagcctca gctcctctcc gtgggcgtgs cccaggctgg agggtcagtc actaa
actggaagac ctgtcctggg ccacgagctg ccagccaaag gcgcttcgsg gaaggagcca tacctcccgc
tccagtggta agagaccggc cccccaggga aagaaaccac atgttccgag ggggggagca cataaaaaac
atctactggg gcacagagga gcactaagcg tggatggaga 3gctg3atg8 gggctcactc tcatgttcaa
acggaacagc agagaatctc agcactgccc atatttcacc ggccttggaa cagccacctg gaceigaaggg
840 900 960 1020 1080 1140 1200 1215
<210〉 6 <211〉 404 <212> PRT <213> E.coli 〈220〉
〈223〉 GnRHIE-p53基因编码的氨基酸序列 <400> 6
Met Glu His Trp Ser His Asp Trp Lys Pro Gly Met Glu Glu Pro Gin
15 10 15
Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Uu Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp
20 25 30
Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser
35 40 45
Gin Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp lie Glu Gin Trp
50 55 60
Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala 65 70 75 80
Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gin Lys
100 105 110
Thr Tyr Gin Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met
130 135 140
Phe Cys Gin Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser 145 150 155 160
Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala lie Tyr Lys Gin
165 170 175
Ser Gin His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg
180 185 190
Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu lie Arg Val 195 200 205Glu
His 225 Thr
Met
Gly
Pro
Glu 305 Asn
Glu
Arg
Glu
Gly 385 Pro
Gly 210 Ser
Thr
Asn
Asn
Gly 290 Pro
Asn
Tyr
Glu
Pro 370 Gin
Asp
Asn Leu Arg Val
Val
lie
Arg
Leu 275 Arg
Val
His
Arg 260 Leu
Asp
Val
Tyr 245 Pro
Gly
Arg
Pro 230 Asn
lie
Arg
Arg
His His Glu Leu 310
Thr Ser Ser Ser 325
Phe Thr Leu Gin 340
Leu Asn Glu Ala 355
Gly Gly Ser Arg
Ser Ser
Thr Asp
Ser
Arg 390
Glu 215 Tyr
Tyr
Leu
Asn
Thr 295 Pro
Pro
lie
Leu
Ala 375 His
Tyr
Glu
Met
Thr
Ser 280 Glu
Pro
Gin
Arg
Glu 360 His
Lys
Leu
Pro
Cys
lie 265 Phe
Glu
Gly
Pro
Gly 345 Leu
Ser
Lys
Asp
Pro
Asn 250 lie
Glu
Glu
Ser
Lys 330 Arg
Lys
Ser
Leu
Asp
Glu 235 Ser
Thr
Val
Asn
Thr 315 Lys
Glu
Asp
His
Met 395
Arg 220 Val
Ser
Leu
Arg
Leu 300 Lys
Lys
Arg
Ala
Leu 380 Phe
Asn
Gly
Cys
Glu
Val 285 Arg
Arg
Pro
Phe
Gin 365 Lys
Lys
Thr
Ser
Met
Asp 270 Cys
Lys
Ala
Leu
Glu 350 Ala
Ser
Thr
Phe
Asp
Gly 255 Ser
Ala
Lys
Leu
Asp 335 Met
Gly
Lys
Glu
Arg
Cys 240 Gly
Ser
Cys
Gly
Pro 320 Gly
Phe
Lys
Lys
Gly 400
〈210> 7 <211〉 1386 <212〉 DNA <213>人工序列 <220>
〈223〉 GnRHm-ODD-p53基因序列 〈400〉 7
atggagcact ggtcccacga ctggaagcct ggaatgaacc cattttctac tcaggacacs 60 gatttagact tggagatgtt agctccctat atcccaatgg atgatgactt ccagttacgt 120 tccttcgatc agttgtcacc attagaaagc agttccgcaa gccctgaaag cgcaagtcct 180 caaagcacag ttacagtatt ccagatggag gagccgcagt cagatcctag cgtcgagccc 240 cctctgagtc aggaaacatt ttcagaccta tggaaactac ttcctgaaaa caacgttctg 300 tcccccttgc cgtcccaagc aatggatgat ttgatgctgt ccccggacga tattgaacaa 360 tggttcactg aagacccagg tccagatgaa gctcccagaa tgccagaggc tgctccccgc 420 gtggcccctg caccagcagc tcctacaccg gcggcccctg caccagcccc ctcctggccc 480 ctgtcatctt ctgtcccttc ccagaaaacc taccagggca gctacggttt ccgtctgggc 540 ttcttgcatt ctgggacagc caagtctgtg acttgcacgt actcccctgc cctcaacaag 600atgttttgcc cccggcaccc gtgaggcgct catcttatcc cgacatagtg C3ctac犯ct accatcatca cgtgtttgtg ggggagcctc agctcctctc cgtgggcgtg gcccaggctg aagggtCBgt gact肪
肌ctggcc犯 gcgtccgcgc gcccccacca gagtggaagg tggtggtgcc acatgtgtaa cactggaaga cctgtcctgg accacgagct
CCC2lgCC333 ElgCgCttCga
ggaaggagcc ctacctcccg
gacctgccct catggccatc tgagcgctgc aaa/tttgcgt ctatgagccg cagttcctgc ctccagtggt gag卿ccgg gcccccaggg
gatgttccga 3gggggg叫c ccataaaaaa
gtgcagctgt tacaagcagt tceigatagcg gtggagtatt cctgaggttg
3tgggCggC3
aatctactgg cgcscagagg agc3ctaagc
Ctgg3tgg3g
geigctg肌tg agggctcact ctcatgttca
gggttgattc cacagcacat atggtctggc tggatgacag gctctgactg tgaaccggag
gaCgg33C3g
asgag33tct gagcactgcc aatatttcac aggccttgga ccagccacct eigacagaagg
cacacccccg gacggaggtt ccctcctcag aaacactttt taccaccatc gcccatcctc ctttgaggtg ccgcaagaaa caacaacacc ccttcagatc actceieiggat gaagtccaaa gcctgactca
660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1386
<210> 8 〈211〉 461 <212> PRT 〈213〉 E. coli <220>
〈223〉 GnRHHI-ODD-p53基因编码的氨基酸序列 <400〉 8
Met Glu His Trp Ser His Asp Trp Lys Pro Gly Met Asn Pro Phe Ser
1 5 10 15
Thr Gin Asp Thr Asp Uu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr lie Pro
20 25 30
Met Asp Asp Asp Phe Gin Leu Arg Ser Phe Asp Gin Leu Ser Pro Leu
35 40 45
Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gin Ser Thr Val
50 55 60
Thr Val Phe Gin Met Glu Glu Pro Gin Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro 65 70 75 80
Pro Leu Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Uu Leu Pro Glu
85 90 95
Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gin Ala Met Asp Asp Leu Met
100 105 110
Leu Ser Pro Asp Asp lie Glu Gin Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro
115 120 125
Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro 145 150 155 160Leu
Phe
Thr
Cys
Val 225 Val
Ala
Tyr
Glu
Met 305 Thr
Ser
Glu
Pro
Gin 385 Arg
Glu
His
Lys
Ser
Arg
Tyr
Pro 210 Arg
Arg
Pro
Leu
Pro 290 Cys
lie
Phe
Glu
Gly 370 Pro
Gly
Leu
Ser
Lys 450
Ser
Leu
Ser 195 Val
Ala
Arg
Pro
Asp 275 Pro
Asn
lie
Glu
Glu 355 Ser
Lys
Arg
Lys
Ser 435 Leu
Ser
Gly 180 Pro
Gin
Met
Cys
Gin 260 Asp
Glu
Ser
Thr
Val 340 Asn
Thr
Lys
Glu
Asp 420 His
Met
Val 165 Phe
Ala
Leu
Ala
Pro 245 His
Arg
Val
Ser
Leu 325 Arg
Leu
Lys
Lys
Arg 405 Ala
Leu
Phe
Pro
Leu
Leu
Trp
lie 230 His
Leu
Asn
Gly
Cys 310 Glu
Val
Arg
Arg
Pro 390 Phe
Gin
Lys
Lys
Ser
His
Asn
Val 215 Tyr
His
lie
Thr
Ser 295 Met
Asp
Cys
Lys
Ala 375 Leu
Glu
Ala
Ser
Thr 455
Gin
Ser
Lys 200 Asp
Lys
Glu
Arg
Phe 280 Asp
Gly
Ser
Ala
Lys 360 Leu
Asp
Met
Gly
Lys 440 Glu
Lys
Gly 185 Met
Ser
Gin
Arg
Val 265 Arg
Cys
Gly
Ser
Cys 345 Gly
Pro
Gly
Phe
Lys 425 Lys
Gly
Thr 170 Thr
Phe
Thr
Ser
Cys 250 Glu
His
Thr
Met
Gly 330 Pro
Glu
Asn
Glu
Arg 410 Glu
Gly
Pro
Tyr
Ala
Cys
Pro
Gin 235 Ser
Gly
Ser
Thr
Asn 315 Asn
Gly
Pro
Asn
Tyr 395 Glu
Pro
Gin
Asp
Gin
Lys
Gin
Pro 220 His
Asp
Asn
Val
lie 300 Arg
Leu
Arg
His
Thr 380 Phe
Leu
Gly
Ser
Ser 460
Gly
Ser
Leu 205 Pro
Met
Ser
Leu
Val 285 His
Arg
Leu
Asp
His 365 Ser
Thr
Asn
Gly
Thr 445 Asp
Ser
Val 190 Ala
Gly
Thr
Asp
Arg 270 Val
Tyr
Pro
Gly
Arg 350 Glu
Ser
Leu
Glu
Ser 430 Ser
Tyr 175 Thr
Lys
Thr
Glu
Gly 255 Val
Pro
Asn
lie
Arg 335 Arg
iLeu
Ser
Gin
Ala 415 Arg
Arg
Gly
Cys
Thr
Arg
Val 240 Leu
Glu
Tyr
Tyr
Leu 320 Asn
Thr
Pro
Pro
lie 400 Leu
Ala
His
28
权利要求
1、一种融合基因，其包含GnRH基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。
2、 根据权利要求l所述的融合基因，其具有选自SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA 序列。
3、 一种重组融合蛋白，其包含GnRH M^列和p53 M酸 序列，以及任选的介于GnRH氨基酸序列与p53氨基酸序列之间的缺 氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的氨基^列。
4、 根据权利要求3所述的重组融合蛋白，其选自重组融合蛋白 GnRH隱p53 、 GnRH國ODD画p53 、 GnRHm陽p53和GnRHm-ODD國p53, 并且所述重组融合蛋白分别具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、和SEQ ID NO: 8中所示的^J^酸序列。
5、 一种包含如权利要求1或2所述融合基因的表达型重组体，其 表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒表达栽体。
6、 根据权利要求5所述的表达型重组体，其选自 pET28a-GnRH誦p53 、 pET28a画GnRH誦ODD画p53 、 pET28a-GnRHlE-p53 和pET28a-GnRHm-ODD-p53原核表达载体。
7、 根据权利要求6所述的表达型重组体，其为IPTG诱导表达型 重组体。
8、 根据权利要求5所述的表达型重组体，其中基因表达盒的上游选自真核细胞启动子、原核细胞启动子和病毒启动子。
9、 由权利要求5至7任一项所述的表达型重组体转化、转染或转导所获得的工程菌。
10、 根据权利要求9所述的工程菌，其特征在于i) 其为工程菌GnRH-p53/DH5a 、工程菌GnRH-ODD-p53/DH5a、工程菌GnRHm-p53/DH5a、或工程菌GnRHm-ODD-p53/DH5a;或者ii) 其为工程菌GnRH-p53/BL21/DE3、工程菌GnRH-ODD-p53/BL21/DE3、工程菌GnRHlE-p53/BL21/DE3、或工程菌GnRHHI-ODD画p53/BL21/DE3。
全文摘要
本发明涉及一种融合基因，其包含GnRH基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。本发明还涉及一种重组融合蛋白，和所述融合基因的表达型重组体、由其获得的工程菌，以及所述表达型重组体和融合蛋白的制药用途。根据本发明可以有效地提高p53的抗肿瘤作用。
文档编号A61K38/17GK101684472SQ20081016683
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者武军华, 王玉霞, 贾培媛, 宇 赵 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所