专利名称：：蛋黄免疫球蛋白(IgY)口服制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明系与水产疾病之预防和治疗有关。
背景技术：
：禽蛋中的免疫球蛋白包含有IgA、IgM及IgY三种，它的来源是在产卵过程中由母禽的血液中转移而来，IgA与IgM会存在蛋白中，而IgY则会移行到蛋黄部分，故称为蛋黄免疫球蛋白。相较于其它种类的免疫球蛋白，作为抗体来源IgY有许多优点，如因哺乳类与家禽演化距离差距较大，在免疫分析上较不易与哺乳类抗体有交叉反应，且更容易生产相对其抗原具高度专一性的抗体。此外，因为蛋黄中只含有IgY—种抗体，在抗体分离上更为简单。目前欲由动物获得特定抗体来源时，须先免疫实验鼠或兔子，再以抽血的方式获得其血清以分离抗体。这种侵入性的抗体生产方式，对于动物容易造成痛苦与压力。然而，IgY的取得只需于免疫禽类后，每天收取禽蛋，再从蛋黄分离出抗体即可。因此，IgY不失为特定抗体来源更好的选择。在水产动物疫苗的开发上，目前市面上所使用的注射疫苗，较难处理大量且小体型水产动物(如仔稚鱼)之注射。若能采用口服疫苗，利用与饲料混合的方式投喂，将可大幅縮减人力，亦不会有佐剂残留的安全性问题。口服疫苗是利用水产动物口服传递系统直接将抗体或抗原混入饲料中，经口服进入动物体，但在制备的过程中蛋白质容易变性，在水中则可能水解；即使进入鱼的体内，也将被胃酸消化掉大部分，而使保护效果大打折扣。因此，如何将IgY抗体有效地送入动物体内，将是目前水产业极需解决的一个问题。
发明内容本发明系提供一种供水产动物服用的IgY口服制剂，其中包含IgY抗体的蛋粉包埋于水包油包水型三重相之乳化物中。此口服制剂结构稳定，方便储存与运送，在水中不易水解，同时可保护IgY不受胃酸影响，进入水产动物体内后缓慢释放出IgY抗体，提高预防及保护之效。因此，本发明之一方面在提供一种IgY口服制剂，其包括治疗或预防有效量之包含IgY抗体之蛋粉；约30-70%总重量比之油相物质，该油相物质于常温下呈液状，系用于包埋该蛋粉；约0.1_10%总重量比之第一乳化剂，其系加入该油相物质中；约10_30%总重量比之第一水相物质，构成一内水相，其系被该油相物质所包覆；约20_40%总重量比之第二水相物质，构成一外水相，其系用于包覆该油相物质；及约O.1_10%总重量比之第二乳化剂，其系加入该外水相中。本发明的另一方面在于提供一种制备如上述之IgY口服制剂之方法，其步骤包括(1)提供一包含IgY抗体之蛋粉；(2)将该蛋粉与一约30_70%总重量比之常温呈液态之油相物质混合后，再与约O.1_10%总重量比之第一乳化剂混合，得到一油相产物；(3)该油相产物与约10_30%总重量比之第一水相物质，构成一内水相，以1:l至l:5的范围内之一重量比混合后，可得一油包水乳化产物；(4)将约20_40%总重量比之之第二水相物质，构成一外水相，与约O.1_10%总重量比之第二乳化剂混合后，形成一混合物；(5)将该混合物与步骤(3)所得之油包水乳化产物以i:i至i:5的范围内之一重量比混合，得到IgY口服制剂。在本发明另一方面提供一种包含如上述之IgY口服制剂之水产用饲料。本发明之又另方面为提供一种预防或治疗水产动物疾病的方法，其系为口服给予水产动物如上述之水产用饲料。为了说明本发明的目的，在附图中显示现阶段较佳的具体实施例。不过，应了解本发明非限于所示的具体实施例。图1系为点带石斑鱼投喂三天各组饲料后的第一天进行病毒攻击，纪录每日死亡后而换算之相对活存率的结果。图2系为点带石斑鱼投喂三天各组饲料后的第五天进行病毒攻击，纪录每日死亡后而换算之相对活存率的结果。具体实施例方式本发明系提供一种IgY口服制剂，其包括治疗或预防有效量之包含IgY抗体之蛋粉；约30-70%总重量比之油相物质，该油相物质于常温下呈液状，系用于包埋该蛋粉；约0.1_10%总重量比之第一乳化剂，其系加入该油相物质中；约10-30%总重量比之第一水相物质，构成一内水相，其系被该油相物质所包覆；约20_40%总重量比之第二水相物质，构成一外水相，其系用于包覆该油相物质；及约O.1_10%总重量比之第二乳化剂，其系加入该外水相中。本发明所使用的IgY系包含于一蛋粉中，该蛋粉之来源为家禽类如鸡、鸭或鹅。本领域之技艺人士，可根据欲预防或治疗的水产性疾病，以自身之知识或根据文献，将全株不活化病毒或具抗原决定区位之多肽片段混合佐剂后免疫家禽，并由被免疫之家禽所生下的蛋中制备包含IgY抗体之蛋粉。根据本发明之一实施例，系将不活化之台湾石斑鱼虹彩病毒颗粒(GrouperiridovirusofTaiwan,TGIV)与佐剂免疫鸡只数次后，搜集该鸡只所产下的蛋并将蛋黄部分冷冻干燥后，所得到之包含IgY-抗台湾石斑鱼虹彩病毒之蛋粉。「有效量」乙辞在本发明中意指能达到预防或治疗水产动物疾病效果之含量。根据本发明之一实施例，系使用于油相物质中约5-20%重量比之包含IgY抗体之蛋粉。本发明中所使用之「油相物质」乙辞，系指于食品和药物中普遍使用，且于常温下呈液态状之酯类或非酯类油性基底。非酯型油性基底之实例包含矿物油，而酯类油性基底之实例包括天然存在的脂肪酸酯，例如液态植物油如花生油、大豆油、向日葵油、玉米油、橄榄油或菜籽油等，及源自动物之液态油如猪油、乌贼油或鱼油等。上述油类可视目的单独或组合使用。根据本发明之一实施例，该油相物质为鱼油。本发明中所使用之「第一乳化剂」乙辞，系指HLB值小于8且转化点(inversionpoint)在10-4(TC之间之非离子性接口活性剂。「HLB值」乙辞系指某种物质所具有的亲水亲油平衡值(hydrophilelipophilebalance)，数值越低，表示亲水性越差。本发明中，用于制备的第一乳化剂之实例包括己糖醇酐硬脂酸酯、己糖醇酐油酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、二辛基十二烷基-2月桂酰谷氨酸、单硬脂酸甘油酯或大豆磷脂。本领域之技艺人士可根据不同目的，自行决定单独或组合使用上述之乳化剂。根据本发明之一个实施例，第一乳化剂系使用脱水山梨醇脂肪酸酯(SPAMs)。本发明中所使用之「第二乳化剂」乙辞，系指HLB值大于8且转化点(inversionpoint)在10-4(TC之间之非离子性接口活性剂，亦即为亲水性乳化剂。本发明中，用于制备的第二乳化剂之实例包括己糖醇酐月桂酸酯、己糖醇酐棕榈酸酯、己糖醇酐硬脂酸酯、己糖醇酐油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、单硬脂酸聚甘油酯-io或聚甘油-10硬脂酸酯。本领域之技艺人士可根据不同目的，自行决定单独或组合使用上述之乳化剂。根据本发明之一个实施例，第二乳化剂系使用聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(Tween)。本发明中所使用之「水相物质」乙辞，系指一水溶液，其可为水或以水為基底的溶液。于本发明中，作为内水相之水相物质可进一步视情况包含一营养补充剂、一胺基酸、一蛋白质粉末、一维生素、一免疫赋活剂、一微量矿物质、一海藻多醣或一疫苗等水溶性物质或上述任两种以上物质之搭配。该水溶性物质之目的在于增进IgY口服制剂之效果，或是作为其它目的之使用如营养补充。本领域之技艺人士可根据所需，自行挑选欲使用之水溶性物质。于本发明中，作为外水相之水相物质可视情况进一步包含一水溶性物质，例如用于安定口服制剂之结构，诸如三仙胶、海藻酸钠、k-鹿角菜胶、褐藻酸钠、大豆卵磷脂、阿拉伯胶或上述其它物质之搭配。本发明亦提供一种制备如上述之IgY口服制剂之方法，其步骤包括(l)提供一包含IgY抗体之蛋粉；(2)将该蛋粉与一约30_70%总重量比之常温呈液态之油相物质混合后，再与约O.1_10%总重量比之第一乳化剂混合，得到一油相产物；(3)该油相产物与约10_30%总重量比之内水相以1:l至l:5的范围内重量比混合后，可得一油包水乳化产物；(4)将约20_40%总重量比之外水相与约0.1_10%总重量比之第二乳化剂混合后，形成一混合物；(5)将该混合物与步骤(3)所得之油包水乳化产物以1:1至1:5的范围内重量比混合，得到IgY口服制剂。因本发明之IgY口服制剂具有结构稳定及可抗胃酸之优点，适合以口服的方式提供水产动物对抗病毒之被动保护，本发明之IgY口服制剂可与水产用饲料混合，再将该饲料喂食目标水产动物。IgY口服制剂与水产用饲料混合之比例，可由本发明所属
技术领域：
中具有通常知识者根据经验与混合之饲料种类自行试验而得知。根据上述概念，本发明亦提供一种预防或治疗水产动物疾病的方法，其系为口服给予水产动物如申上述之IgY口服制剂之水产用饲料。其中，该水产动物为鱼类或虾类，尤以不易注射之小型鱼类为最有价值。本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不受限于该用于展示之实施例。实施例1:抗台湾石斑虹彩病毒之IgY制备鸡只免疫与蛋粉制作选用3-4月龄的母鸡，使其自由摄取饮水及饲料。以肌肉注射方式施打弱毒株的台湾石斑虹彩病毒(TGIV)(实验室自行由罹病的石斑鱼中分离出的病毒)，共施打四次。第一次免疫时加入完全佐剂(sigma，USA)施打，后三次免疫皆使用不完全佐剂(sigma，USA)施打，每次免疫皆间隔两周。在每次注射前收集母鸡所生的蛋，并以i:4之蛋黄与o.i倍PBS溶液的比例在4t:中水化一天后，收集其蛋液。IgY力价测试以O.1MNaHC03稀释TGIV抗原并加入在96井的微盘上，每个井加入50iiL的抗原(浓度为100ng/50iiL)，置于操作台中于室温吹干。吹干后每个井加入50iiL含有l^速溶奶粉的PBS溶液，置于37t:作用2小时。甩干上述液体后，以PBS/T混冲液(含有0.05%Tween-20之PBS溶液)清洗1次，再用PBS溶液清洗2次，自然干燥后将培养盘保存于-2(TC中备用。将蛋液以含有1%速溶奶粉的PBS溶液作连续兩倍稀释后，在96井的微盘中，每个井加入50iiL待测液，于37t:作用2小时后，甩干上述液体，以PBS/T缓冲液清洗3次，再用PBS溶液清洗5次并拍干。接着将连接辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase)之山羊-抗鸡IgY抗体(华肝基因公司，台湾)以1:1000比例用含有1%速溶奶粉的PBS溶液稀释，并在每个井中加入50yL，放置于37t:作用l小时。反应时间结束后甩干上述液体，以PBS/T缓冲液清洗3次，再用PBS溶液清洗5次并拍干。最后每个井中加入50iiL的邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)(SIGMA，USA)作为呈色基质后，于室温下避光反应30分钟。呈色完毕后，每个井加入50iiL的3NHC1终止反应，并侦测490nm的吸光值(0D)。样品最大稀释倍率之倒数即为其力价。结果显示，IgY抗体力价约为1:16000-64000。IgY中和试验蛋液先以0.45iim滤膜过滤，再以PBS溶液进行从l:20连续二倍稀释至1:10240，并分别加入200TCID5。/mL的病毒液于25"下混合一小时，另外以PBS溶液混合相同浓度之病毒液为对照组。而后，把该两种混合液分别加入长有石斑鱼泳鳔细胞株之96井微量培养盘中，吸附二小时后抽掉液体，加入含有2%胎牛血清(Hyclone，USA)的1^细胞培养液。若抗体无法有效中和病毒，会出现如细胞变圆变大，核浓縮边缘化，最后细胞破裂死亡的病变症状，每天在显微镜下观察并记录细胞病变产生的情形。结果发现，在l:80，i:ieo，i:320以及i:640的稀释倍率下，细胞未产生病变的情形，显示在上述稀释倍数下，IgY具有最好的中和效果。实施例2:IgY口服制剂之制备第一阶段先配制水/油乳化物。首先准备商业鱼油30mL，其系购自台湾谊华实业有限公司，商品代号为FO，由多种鱼类所提炼。于鱼油中分别添加不同浓度之蛋粉(含量分别为5%，10%，15%)，并添加0.9g亲油性乳化剂(Span，由日本林纯药工业株式会社购入)，混合均匀后以均质机(Silverson，England)8，OOOrpm的速度进行均质，并同时加入内部相水溶液(lOmL)。均质2分钟后形成水/油乳化物。第二阶段为将第一阶段所形成的水/油乳化物40mL，添加至含有lg的亲水性乳化剂(Tween，由日本林纯药工业株式会社购入)之20mL水溶液中，以5000rpm均质2分钟，均质后即可得到水包油包水型IgY口服制剂。实施例3:IgY口服制剂之制备特性形成率经过适当稀释后的IgY口服制剂，利用摄影系统撷取5张照片，每张照片最少有50颗乳滴，计算三重相乳滴占总乳滴的百分比即为其形成率。结果如表1所示，包含5%及710%蛋粉的组别其形成率有85%以上，而包含15%蛋粉的组别亦有78%的形成率。表1IgY口服制剂不同蛋粉比例的形成率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>乳化物安定性各组多重相乳化物分别取出10mL装载于15mL离心管中，并放置4t:，定期观察其变化并纪录。结果如表2所示，蛋粉含量越高，安定性则表现较不好，但低剂量组可达45天以上。表2IgY口服制剂不同蛋粉浓度组之安定性(储存天数)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4:抗台湾石斑虹彩病毒(TGIV)之IgY口服制剂之活体效果评估实验用之点带石斑鱼购自八八六水产动物生物科技股份有限公司，其点带石斑鱼系来自于高、屏地区，在盐度3033%。，温度263(TC的条件下畜养，每日以商用鳗鱼饲料投喂三次，畜养一周后进行实验。于实验开始前随机选取石斑鱼，采取脾脏与肾脏之检体进行TGIV聚合酶连锁反应检测之检测。每一循环之反应条件为先以94t:进行2分钟，再依次为94°C40秒，粘合温度52°C30秒及72°C1分钟，共进行35个循环增幅反应，最后以72t:作用IO分钟将未完成的反应完成。确认无TGIV感染后进行实验。用于聚合酶连锁反应检测之引子序列如下正向引子5〃CCCTTCCTTGTGTCGTGTCT3〃(序列编号1);反向引子5〃GCCACCGTAATCAGTTCGAT3〃(序列编号2)。饲料配制分为六组，分别为A包埋组以添加10%蛋粉之多重相乳化物和市售鳗粉(台荣产业股份有限公司，台湾)以重量1:1混合调配成湿性饲料；B未包埋高剂量组将蛋粉鳗粉混合调配成湿性饲料，而添加蛋粉剂量占总混料重的30%;C未包埋低剂量组将蛋粉鳗粉混合调配成湿性饲料，添加蛋粉剂量约占总混料重的5%;以及上述未含有抗体的空白蛋粉之阳性对照组，分别为AV，BV和CV。其中未包埋高剂量组的IgY抗体含量约为包埋组的6倍。病毒攻击试验的方法为每组取10尾鱼，组别分为腹腔注射攻击组及浸泡攻击组。注射组选用的病毒剂量分别为1033和1023TCID5。/0.05mL/每条鱼，而浸泡组选用的病毒剂量为105和10、CID5。/1500mL，浸泡两小时。攻击后每日观察并纪录死亡情形，计算累计死亡率。预防效果实验将点带石斑鱼如表3分组，每组40只鱼苗，平均长5.5公分，重3.9公克，并以两重复以流动式海水饲养于2尺缸中。表3活体实验分组<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>各组饲料每日投喂三餐，各组总体重5%以上的各组自制的湿性饲料当日投喂完毕。投喂三天后于第一天或第五天，实验组和阳性对照组于第1、5、10、20天各捞出IO只，进行TGIV腹腔注射攻击试验，选用剂量为1033TCID5。/0.05mL/鱼，阴性对照组则以L15培养液的腹腔注射取代病毒攻击，每日观察并纪录死亡情形，计算相对活存率。结果如图l和图2所示。图1为投喂三天各组饲料后的第一天进行病毒攻击，并纪录每日死亡，计算相对活存的结果。如图1所示，在病毒攻击十四天后，除了IgY口服制剂组(A)和未包埋高剂量组(B)尚有50%左右的存活率，其它各组活存率皆为0%。此外，图1亦显示本发明之IgY口服制剂与未包埋高剂量组的效果相当。图2为投喂三天各组饲料后的第五天进行病毒攻击，并纪录每日死亡，计算相对活存的结果。如图2所示，在病毒攻击第十四天时，本发明之IgY口服制剂组(A)的存活率几乎100%，未包埋高剂量组(B)有约80X的存活率，而除了喂食一般饲料的D组外，其它组别仅剩10-20%的存活率。由上述数据可知，本发明之IgY口服制剂在活体试验上，对于抵抗病毒攻击有十分显著的效果，可大幅提升水产动物的存活率，且该存活率比未包埋的高剂量相等或更高。在此所列举之专利或文献仅为参考文献。所属领域的技术人员当知道可在不偏离广义的本发明概念下修饰上述具体实施例。应了解本发明不局限于所揭示的特定具体实施例，而意欲涵盖如权利要求所界定的本发明的精神及范围内的修饰。序列表〈110〉周信佑〈120〉蛋黄免疫球蛋白(IgY)口服制剂及其制备方法〈130〉8P99183-TW〈160〉2〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉引子〈400〉1cccttccttgtgtcgtgtct20<210>2〈211>20〈212〉DNA〈213〉人合成〈220〉〈223〉引子〈400>2gccaccgtaatcagttcgat2010权利要求一种蛋黄免疫球体蛋白口服制剂，其包括治疗或预防有效量之包含蛋黄免疫球蛋白抗体之蛋粉；约30-70％总重量比之油相物质，该油相物质于常温下呈液状，系用于包埋该蛋粉；约0.1-10％总重量比之第一乳化剂，其系加入该油相物质中；约10-30％总重量比之第一水相物质，构成一内水相，其系被该油相物质所包覆；约20-40％总重量比之第二水相物质，构成一外水相，其系用于包覆该油相物质；及约0.1-10％总重量比之第二乳化剂，其系加入该外水相中。2.如申请专利范围第l项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中第一乳化剂为亲水亲油平衡值小于8之非离子性界面活性剂。3.如申请专利范围第2项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中第一乳化剂系为己糖醇酐硬脂酸酯、己糖醇酐油酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、二辛基十二烷基_2月桂酰谷氨酸、单硬脂酸甘油酯、大豆磷脂或上述任两种或以上物质之搭配。4.如申请专利范围第3项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中第一乳化剂系为脱水山梨醇脂肪酸酯。5.如申请专利范围第l项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中第二乳化剂为亲水亲油平衡值大于8之非离子性界面活性剂。6.如申请专利范围第5项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中第二乳化剂系为己糖醇酐月桂酸酯、己糖醇酐棕榈酸酯、己糖醇酐硬脂酸酯、己糖醇酐油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、单硬脂酸聚甘油酯-10、聚甘油-10硬脂酸酯或上述任两种或以上物质之搭配。7.如申请专利范围第6项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中第二乳化剂系为聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯。8.如申请专利范围第1项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中包含蛋黄免疫球蛋白抗体之蛋粉之量为于油相物质中约5-20%重量比。9.如申请专利范围第1项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中该内水相再包含一水溶性物质。10.如申请专利范围第9项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂，其中该水溶性物质系为一营养补充剂、一胺基酸、一蛋白质粉末、一维生素、一免疫赋活剂、一微量矿物质、一海藻多醣、一疫苗或上述任两种或以上物质之搭配。11.一种制备如申请专利范围第1项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂之方法，其步骤包括(1)提供一包含IgY抗体之蛋粉；(2)将该蛋粉与一约30-70%总重量比之常温呈液态之油相物质混合后，再与约O.1_10%总重量比之第一乳化剂混合，得到一油相产物；(3)该油相产物与约10-30%总重量比之第一水相物质以1:l至l:5的范围内重量比混合后，可得一油包水乳化产物；(4)将约20_40%总重量比之第二水相物质与约0.1_10%总重量比之第二乳化剂混合后，形成一混合物；(5)将该混合物与步骤(3)所得之油包水乳化产物以i:i至i:5的范围内重量比混合，得到蛋黄免疫球蛋白口服制剂。12.如申请专利范围第11之方法，其中于常温呈液态之油相物质系为植物油、动物油或矿物油。13.如申请专利范围第11项之方法，其中第一乳化剂为亲水亲油平衡值小于8之非离子性界面活性剂。14.如申请专利范围第13项之方法，其中第一乳化剂系为己糖醇酐硬脂酸酯、己糖醇酐油酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、二辛基十二烷基_2月桂酰谷氨酸、单硬脂酸甘油酯、大豆磷脂或上述任两种或以上物质之搭配。15.如申请专利范围第14项之方法，其中第一乳化剂系为脱水山梨醇脂肪酸酯。16.如申请专利范围第11项之方法，其中第二乳化剂为亲水亲油平衡值大于8之非离子性界面活性剂。17.如申请专利范围第16项之方法，其中第二乳化剂系为己糖醇酐月桂酸酯、己糖醇酐棕榈酸酯、己糖醇酐硬脂酸酯、己糖醇酐油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、单硬脂酸聚甘油酯-10、聚甘油-10硬脂酸酯或上述任两种或以上物质之搭配。18.如申请专利范围第17项之方法，其中第二乳化剂系为聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯。19.如申请专利范围第ll项之方法，其中包含蛋黄免疫球蛋白抗体之蛋粉之量为于油相物质中约5-20%重量比。20.如申请专利范围第11项之方法，其中该内水相再包含一水溶性物质。21.如申请专利范围第20项之方法，其中该水溶性物质系为一营养补充剂、一胺基酸、一蛋白质粉末、一维生素、一免疫赋活剂、一微量矿物质、一海藻多醣、一疫苗或上述任两种以上物质之搭配。22.—种包含如申请专利范围第l项之蛋黄免疫球蛋白口服制剂之水产用饲料。23.—种预防或治疗水产动物疾病的方法，其系为口服给予水产动物如申请专利范围第22项之水产用饲料。全文摘要本发明系提供一种用于水产动物之蛋黄免疫球蛋白(IgY)口服制剂及其制备方法，其为一种水包油包水型制剂。本发明之蛋黄免疫球蛋白(IgY)口服制剂具有高稳定性且可抗胃酸，抗病效果极佳。文档编号A61K47/14GK101745110SQ20081018647公开日2010年6月23日申请日期2008年12月19日优先权日2008年12月19日发明者任俊懿,吴彰哲,周信佑,朱家莹申请人:周信佑