专利名称：：一种抗肺癌a549细胞增殖的中药多糖提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药
技术领域：
，具体地说是涉及一种抗肺癌A549细胞增殖的中药多糖提取物及其制备方法。
背景技术：
：肺癌(lungcancer)原发于支气管黏膜和肺泡上皮细胞，是当今全球常见恶性肿瘤之一，近年来已居恶性肿瘤之首，特别是随着人口老龄化，城市人口比例逐年升高，城镇工业生产迅速发展，环境污染进一步恶化，吸烟等不良习惯相当普遍等原因，其发病率在我国呈上升趋势[1'2]。据世界卫生组织(WHO)预测，到2025年，我国每年新增的肺癌病死例数将超过100万，患病人数将居世界之首[3]。治疗包括肺癌在内的肿瘤一直是临床医学研究和新药开发的热点，但是传统的放化疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时往往给患者带来较大的毒副反应，而中药(包括单味药和中药复方)在这方面已崭露头角，并迅速发挥重要作用，具有广阔的开发前景。
发明内容针对肺癌高发病率及西医西药治疗局限性的现状，本发明的目的在于提供一种抗肺癌A549细胞增殖的中药多糖提取物及制备方法。本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的1.处方一种抗肺癌A549细胞增殖的中药多糖提取物，其特征在于它是由下列重量配比的原料药所制成猫爪草515g、金荞麦515g、鱼腥草515g、仙鹤草515g、冬瓜子5~15g、山茨蔬10~20g、苏木10~20g、红花10~20g、法半夏10~20g、胆南星515g、沙参5~15g、玉竹515g、麦冬515g。制备上述中药多糖提取物的方法，步骤如下-1)将处方药13味加水煎煮，过滤收集提取液，经浓缩得提取液I;2)取提取液I加乙醇溶液混匀，静置离心，取沉淀水溶醇沉纯化，得沉淀为多糖粗提取物II;3)取多糖粗提取物II用水加热溶解，用等量的氯仿-正丁醇萃取，剧烈振摇，静置分层后，离心去除水层与有机层中间的凝胶物，如此反复直到凝胶物除尽为止，将上层水液浓縮、干燥，得多糖提取物m。上述步骤1)中加水的水量为药材量的10~15倍，水煎煮0.51小时，提取溶液浓縮至0.5g生药/ml。上述步骤2)中加70~90%的乙醇溶液，加的量为提取液I的2~3倍，静置10~12小时后离心，取沉淀反复34次水溶醇沉纯化。上述步骤3)中所述的氯仿-正丁醇以5:l比例进行萃取，剧烈振摇1520分钟，将上层水液浓縮至10g生药/ml，6(TC真空干燥。上述中药多糖提取物在制备治疗肺癌药物中的应用。1.1处方来源肺为娇脏，主气，司呼吸，其气宜宣宜降。肺在病理状态下常为"贮痰之器"。肺癌患者的临床主要表现为咳嗽、咯痰，痰多或少，痰色或白或黄或灰黑，痰质或清稀如水、或粘稠浊腻，或痰中夹血，气急，胸闷，胸痛。西医学诊断通过CT、MRI、支气管镜、脱落细胞检查等发现肺部实质性占位病变及恶性细胞。周仲瑛教授为中国著名中医，博士生导师，政府津贴专家，已业医六十余年，医德高尚，技艺精湛，治愈急疑难杂症患者难计其数。近年来，随着肿瘤发病率的增高，肺癌患者急骤增多。周老师结合肺的生理病理特点，经过数十年的临床观察与治疗，认为肺癌的关键癌毒因素在于痰浊、瘀血、气逆；肺之气阴两虚是肺癌发生、复发，转移的关键。因此确立治则为祛邪治标实，固本培正虚。治法重在化痰泄浊，活血祛瘀、行气降逆以及益气养阴。根据病患病期之不同，病理因素的重点而随证治疗。多选用冬瓜子、法夏、胆南星(燥湿化痰)；山茨菇、猫爪草、金荞麦、鱼腥草(软坚散结)，仙鹤草、苏木、红花(活血化瘀)；沙参、玉竹、麦冬(益气养阴)等药物。该抗肺癌有效经验方又名周氏克金岩方(下简称克金岩方)，通过大量临床研究，肺癌的中医治疗在改善患者临床症状，防止复发，稳定瘤体，提高生活质量等方面均有良好的作用，成为肿瘤综合治疗手段中必不可少的组成部分。1.2.药效学研究1.2.1处方提取物制备取冬瓜子10g、法半夏12g、胆南星10g、山茨菇12g、猫爪草10g、金荞麦10g、鱼腥草10g，仙鹤草15g、苏木12g、红花15g、沙参10g、玉竹10g、麦冬10g，加15倍量水煎煮0.5小时，过滤收集提取液，浓縮得全方提取液I(0.5g生药/ml)。1.2.2细胞来源人肺癌A549细胞由南京大学生命科学院惠赠。1.2.3A549细胞的增殖抑制作用取对数生长期肺癌A549细胞，消化、重悬，调节细胞浓度为5^1(^个/mL，接种至96孔培养板，每孔(X2mL，继续培养24小时后，每6孔为一组，吸弃细胞培养液，每组添加由细胞培养液配制成提取物I，每孔0.2mL，另有6孔对照组，每孔加入0.2mL细胞培养液。分别于培养24小时后，吸弃培养液，每孔添加新细胞培养液0.2mL，并加入20pL5mg/mL的MTT(用PBS配制)，继续培养4小时后，吸弃培养液，每孔加入0.15mLDMSO，振摇30min，充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，于490nm下测定每孔吸光度(OD值)。结果见表l。提取物I可显著抑制肺癌A549细胞的增殖。表lMTT法检测提取物I对A549细胞的增殖抑制作用提取物I浓度(ng/mL)OD值对照组—0.632±0.030高浓度组16000.658±0.033中浓度组4000.593±0.029*低浓度组謂0.587士0.029"注与对照组比较，*:/<0.05，**:p<0.012.多糖提取物2.1提取物制备将全方提取液I加2倍量90%乙醇溶液混匀，静置12小时离心，取沉淀经反复3次水提醇沉纯化，取沉淀为多糖粗提物II。粗提物II水加热溶解，用等量的氯仿-正丁醇(5:1)萃取，剧烈振摇，静置分层后，离心去除水层与有机层中间的凝胶物，如此反复多次，直到凝胶物除尽为止，将上层水液浓縮至10g生药/ml，6(TC真空干燥，即得提取物m。2.2提取物III的定性分析2.2.1定性鉴别取少量提取物III用水溶解，a-萘酚-浓硫酸反应为阳性，双縮脲反映为阴性，说明是多糖类化合物。2.2.2红外光谱分析红外光谱分析显示，提取物in的红外光谱为多糖的特征吸收图谱。定性鉴别与红外光谱分析表明，提取物ni为多糖提取物。2.3对A549细胞的增殖抑制作用方法同上，结果见表2，多糖提取物III对A549细胞的增殖有抑制作用。表2MTT法检测多糖提取物III对A549细胞的增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与对照组比较，*:p<0.05，2.4流式细胞检测以5xl()S个/ml的密度接种A549细胞于6孔板中，每孔2.5ml。待细胞贴壁后换不含血清的培养液饥饿24h，再分别用含有终浓度为100、10、lng/ml多糖提取物HI的培养液继续培养，继续培养72h收集细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为1"06个/ml，PI染液避光染色30min，400目尼龙网过滤，采用流式细胞仪进行检测，分析细胞周期各时相分布百分比。结果见表3，提取物m具有显著促进A549细胞凋亡的作用。表3流式细胞检测不同浓度多糖提取物III对A549细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:与对照组相比，；K0.05;**:与对照组相比，p<0.01有益效果本发明提供的一种抗肺癌的中药多糖提取物。由处方药猫爪草5—15g、金荞麦5一15g、鱼腥草5—15g、仙鹤草5—15g、冬瓜子5—15g、山茨菇10—20g、苏木10一20g、红花10—20g、法夏10—20g、胆南星5—15g、沙参5—15g、玉竹5—15g、麦冬5—15g所提取的多糖提取物，该处方药是由我国名中医周仲瑛教授数十年的临床观察和治疗的经验方，又名周氏克金岩方，经药效学试验结果表明，该中药多糖提取物对肺癌A549细胞的增殖有显著的抑制作用。具体实施例方式实施例l:抗肺癌A549细胞的多糖提取物及其制备方法(一)处方冬瓜子10g、法半夏12g、胆南星10g、山茨菇12g、猫爪草10g、金荞麦10g、鱼腥草10g，仙鹤草15g、苏木12g、红花15g、沙参10g、玉竹10g、麦冬10g。(二)制法1、处方提取物制备取冬瓜子10g、法半夏12g、胆南星10g、山茨菇12g、猫爪草10g、金荞麦10g、鱼腥草10g，仙鹤草15g、苏木12g、红花15g、沙参10g、玉竹10g、麦冬10g，加15倍量水煎煮0.5小时，过滤收集提取液，浓縮得全方提取液I(0.5g生药/ml)。2、多糖粗提取物制备提取液I加2倍量90%乙醇溶液混匀，静置12小时离心，取沉淀反复3次水溶醇沉纯化，得沉淀为多糖粗提取物II。3、多糖提取物制备多糖粗提物II用水加热溶解，用等量的氯仿-正丁醇(5:1)萃取，剧烈振摇20分钟，静置分层后，离心去除水层与有机层中间的凝胶物，如此反复多次，直到凝胶物除尽为止，将上层水液浓縮至10g生药/ml，6(TC真空干燥，即得抑制肺癌A549细胞增殖的多糖提取物ni。实施例2:抗肺癌A549细胞的多糖提取物及其制备方法(一)处方冬瓜子5g、法半夏20g、胆南星5g、山茨菇10g、猫爪草5g、金荞麦5g、鱼腥草5g，仙鹤草10g、苏木20g、红花10g、沙参5g、玉竹15g、麦冬15g。(二)制法1、处方提取物I制备取冬瓜子5g、法半夏20g、胆南星5g、山茨菇10g、猫爪草5g、金荞麦5g、鱼腥草5g，仙鹤草10g、苏木20g、红花10g、沙参5g、玉竹15g、麦冬15g，加10倍量水煎煮0.5小时，过滤收集提取液，浓縮得全方提取液I(0.5g生药/ml)。2、多糖粗提取物II制备提取液I加3倍量70%乙醇溶液混匀，静置10小时离心，取沉淀反复4次水溶醇沉纯化，得沉淀为多糖粗提取物n。3、多糖提取物制备多糖粗提物II用水加热溶解，用等量的氯仿-正丁醇(5:1)萃取，剧烈振摇15分钟，静置分层后离心去除水层与有机层中间的凝胶物，如此反复多次，直到凝胶物除尽为止，将上层水液浓縮至10g生药/ml，6(TC真空干燥，即得抗肺癌A549细胞增殖的多糖提取物m。权利要求1.一种抗肺癌A549细胞增殖的中药多糖提取物，其特征在于它是由下列重量配比的原料药所制成猫爪草5～15g、金荞麦5～15g、鱼腥草5～15g、仙鹤草5～15g、冬瓜子5～15g、山茨菇10～20g、苏木10～20g、红花10～20g、法半夏10～20g、胆南星5～15g、沙参5～15g、玉竹5～15g、麦冬5～15g。2.—种制备权利要求1所述中药多糖提取物的方法，其特征在于其方法步骤如下1)将处方药13味加水煎煮，过滤收集提取液，经浓縮得提取液I;2)取提取液I加乙醇溶液混匀，静置离心，取沉淀水溶醇沉纯化，得沉淀为多糖粗提取物II;3)取多糖粗提取物II用水加热溶解，用等量的氯仿-正丁醇萃取，剧烈振摇，静置分层后，离心去除水层与有机层中间的凝胶物，如此反复直到凝胶物除尽为止，将上层水液浓縮、干燥，得多糖提取物ni。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤1)中加水的水量为药材量的10~15倍，水煎煮0.51小时，提取液浓縮至0.5g生药/ml。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在歩骤2)中加70~90%的乙醇溶液，加的量为提取液I的23倍，静置1012小时后离心，取沉淀反复34次水溶醇沉纯化。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在步骤3)中所述的氯仿-正丁醇以5:1比例进行萃取，剧烈振摇1520分钟，将上层水液浓縮至10g生药/ml，60°C真空干燥。6.如权利要求1所述的中药多糖提取物在制备治疗肺癌药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种抗肺癌A549细胞增殖的中药多糖提取物，它是由猫爪草、金荞麦、鱼腥草、仙鹤草、冬瓜子、山茨菇、苏木、红花、法半夏、胆南星、沙参、玉竹、麦冬按一定重量配比所制成，其提取方法是首先将13味处方药加水煎煮，过滤收集提取液I浓缩至0.5g生药/ml，其次把浓缩的提取液I中加乙醇混匀后，静置离心，取沉淀水溶醇沉纯化得沉淀为多糖粗提取物II，最后将多糖粗提取物II用水加热溶解，用等量的氯仿-正丁醇萃取，剧烈振摇，静置分层后，离心去除水层与有机层中的凝胶物，将上层水液浓缩至10g生药/ml，60℃真空干燥，即得多糖提取物，经药效学试验结果表明该中药多糖提取物对肺癌A549细胞的增殖有显著的抑制作用。文档编号A61P35/00GK101391043SQ20081019506公开日2009年3月25日申请日期2008年10月28日优先权日2008年10月28日发明者叶丽红,周仲瑛,怡孙,莲尹,旭张,阳美平申请人:南京中医药大学