专利名称：：用于伤口愈合的复方儿茶软膏及其配制方法
技术领域：
：本发明属于伤口愈合的中药，具体涉及一种用于伤口愈合的复方儿茶制剂。
背景技术：
：目前对于治疗伤口愈合的方法中，尚没有专门用于治疗伤品愈合的化学药物，因为常用的西药品只是其着消炎作用，并无促进肉芽组织生长生的作用。而传统的中药如生肌散，生肌玉红膏，珍珠生肌散等，多用于浅表创伤的治疗，对于深层创伤的疗效不好；同时上述中药达不到无菌的要求。
发明内容本发明的目的在于提供一种能对深层创伤具有治疗作用的用于伤口愈合的复方儿茶软膏，并提供该软膏的配制方法，从而解决上述问题。本发明的技术方案之一是用于伤口愈合的复方儿茶软膏，它是由下列药用原料配制而成儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白茨胶，原料的重量比为2:0.5-1.5:0.5-1.5:1.5~3.5:0.5~1.5:3~10。特别的所述儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶的重量比为2:0.8~1.2:0,8-1.2:1.8—2.2:0.8-1.2:4~8。特别的处方是乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶的重量比为2:1:1:2.4:1:5。本发明的技术方案之二是用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，它是将儿茶、乳香和没药分别粉粹后混合，或将儿茶、乳香和没药混合后粉粹；将红参的提取物和黄芪的提取物与上述混合物进行混合得第二混合物；将白芨胶水浸泡加热与第二混合物混合均匀后，进行灭菌处理得到复方儿茶软膏。所述药用原料儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶的重量比为2:0.5~1.5:0.5-1.5:1.5-3.5:0.5-1.5:3-10。所述红参的提取物是乙醇回流法提出得到的提取物。所述黄芪的提取物是黄芪的水煎煮提取物。在儿茶、乳香和没药分别粉粹后分别通过不低于90目的过滤后在混合。特别的红参提取物浓缩液中每毫升相当0.04-lg生药；黄芪提取物浓缩液中每毫升相当0.1~2.4克生药。该药物中以儿茶活血散瘀，收敛止血、清热解毒，生肌收湿为君药，配乳香，没药以活血行气止痛，消肿生肌为臣药。佐以红参、黄芪补益气血、生肌敛疮，以白芨收敛止血，消肿生肌为使药，以上诸药合用共奏活血散痹，行气止痛，收敛消肿，收湿生肌之功效。对深层创伤具有优良好促进愈合的作用。其配制方法简单，质量易控制，稳定性好。具体实施例方式实施例1将20克儿茶、5克乳香、5克没药分别粉粹后，通过100目筛过滤后混合均匀待用；将15克黄芪加水90克，煎煮l次后的提取液进行浓缩至每毫升相当0.3g生药待用，将红参5克利用30克体积浓度为50%的乙醇回流提取1次后，浓缩后的提取物浓缩液提取物浓缩液每毫升相当O.lg生药待用。将黄芪的提取物浓缩液，红参的提取物浓缩液与上述混合物混合均匀；将30克白芨胶水浸12小时后，加热溶胀搅拌与上述浓缩液混合物均合均匀，制成稠膏后，利用微波灭菌得到无菌复方儿茶软膏。实施例2将20克儿茶、8克乳香、8克没药分别粉粹后，通过100目筛过滤后混合均匀待用；将18克黄芪加水150克，煎煮3次后的提取液进行浓缩至每毫升相当0.36g生药待用，将红参8克利用60克体积浓度为50%的乙醇回流提取3次后，浓缩后的提取物浓缩液提取物浓缩液每毫升相当0.16g生药待用。将黄芪的提取物浓缩液，红参的提取物浓缩液与上述混合物混合均匀；将40克白芨胶水浸12小时后，加热溶胀搅拌与上述浓缩液混合物均合均匀，制成稠膏后，利用微波灭菌得到无菌复方儿茶软膏。实施例3将40克儿茶、20克乳香、20克没药分别粉粹后，通过100目筛过滤后混合均匀待用；将48克黄芪加水400克，煎煮3次后的提取液进行浓缩至每毫升相当0.96g生药待用，将红参20克利用160克体积浓度为50%的乙醇回流提取3次后，浓缩后的提取物浓缩液提取物浓缩液每毫升相当0.4g生药待用。将黄芪的提取物浓缩液，红参的提取物浓缩液与上述混合物混合均匀；将100克白复胶水浸12小时后，加热溶胀搅拌与上述浓缩液混合物均合均匀，制成稠膏后，利用微波灭菌得到无菌复方儿茶软膏。实施例4将20克儿茶、12克乳香、12克没药分别粉粹后，通过100目筛过滤后混合均勻待用；将22克黄芪加水170克，煎煮3次后的提取液进行浓缩至每毫升相当0.44g生药待用，将红参12克利用IOO克体积浓度为50%的乙醇回流提取3次后，浓缩后的提取物浓缩液提取物浓缩液每毫升相当0.24g生药待用。将黄芪的提取物浓缩液，红参的提取物浓缩液与上述混合物混合均匀；将160克白芨胶水浸12小时后，加热溶胀搅拌与上述浓缩液混合物均合均匀，制成稠膏后，利用微波灭菌得到无菌复方儿茶软膏。实施例5将20克儿茶、15克乳香、15克没药分别粉粹后，通过100目筛过滤后混合均匀待用；将70克黄芪加水560克，煎煮3次后的提取液进行浓缩至每毫升相当1.4g生药待用，将红参15克利用120克体积浓度为50%的乙醇回流提取3次后，浓缩后的提取物浓缩液提取物浓缩液每毫升相当0.3g生药待用。将黄芪的提取物浓缩液，红参的提取物浓缩液与上述混合物混合均匀；将200克白茨胶水浸12小时后，加热溶胀搅拌与上述浓缩液混合物均合均匀，制成裯膏后，利用微波灭菌得到无菌复方儿茶软膏。将上述无菌复方儿茶软膏进行检测(1)理化鉴别①本品多种成分中含有还原性多糖，如白芨胶，乳香，没药，黄芪提取浓缩液和红参提取浓缩液，故Fehling反应和Molish反应都呈阳性，现象容易观察，但很多种中药材中都含有还原性多糖，阴性对照干扰大，故此反应鉴别意义不大。②取本品0.5g，加乙醇40ml，加活性炭少许，搅拌混匀，振摇，滤过，滤液加新配制的香草醛试液1~2滴，即显紫红色，此法为树脂的特征鉴别反应，可鉴别制剂中含树脂的药材没药、乳香和儿茶。(2)色镨鉴别①儿茶鉴别取本品一支，加乙醚30ml，超声处理10min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液。再取不含儿茶的阴性样品10g，同法制得阴性对照溶液。另取儿茶素对照品和表儿茶素对照品，加曱醇制成每mL各含0.2mg作为对照品溶液。照薄层色语法(ChP2005版一部附录VIB)试验，取上述溶液5pL，对照溶液2iaL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-曱醇-乙酸乙酯(4:1:l)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以对二曱氨基苯甲醛溶液,于卯。C加热5min,见供试品色谱在与对照品色谱相应的位置显相同颜色斑点，不含儿茶的阴性对照无干扰。②黄芪鉴别取本品三支，加乙醇30mL,加热回流20min，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3。/。NaOH溶液15mL^f吏溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH值至5~6,用乙酸乙酯15mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯lmL使溶解，作为供试品溶液。另取不含HU的阴性样品25g,同法制得阴性对照溶液。再取HU对照药材2g,同法制成对照药材溶液。照薄层色镨法(ChP2005版一部附录VIB)试—睑，吸取上述两种溶液各10pL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(10:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外灯(365nm)下检视。供试品色i普中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。不含黄芪的阴性对照无干扰。③红参鉴别取本品3支，力卩乙醇100ml,超声15min，过滤，滤液蒸干，加水饱和正丁醇10min,超声5min,取上清加3倍量的氨试液，摇勾，放置分层，取上层液蒸干，残渣加曱醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取不含红参提取液的阴性样品25g,同法制得阴性对照溶液。再取红参皂苷Rbl、红参皂苷Re、红参HS急香Rf、红参皂苷Rgl对照品，加甲醇制成每lmL各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谦法(ChP2005版一部附录VIB)试-验，吸取上述两种溶液各1~2pL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-曱醇-水(15:40:22:10)10。C以下放置后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105。C加热至斑点显色清晰。置紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。5.检查应符合软膏剂项下的各项规定(中国药典2005版一部附录IR)。此外，由于本软膏是用于深度创伤，和肌肉组织接触，故对其pH值也进行;险查。(l)粒度取本品适量，置于载玻片上,涂成薄层,覆以盖玻片，共涂三片，照粒度测定法(中国药典2005版一部附录XIB第一法)测定.测定结果见表1表1粒度检查试验数据批号U80um粒子0705200705240705221100%100%100%2100%100%100%100%100%100%由上表可以看出，三批制剂均未检出大于180um的粒子，符合中国药典2005版一部附录IR软膏剂粒度检查项下规定。(2)pH值取本品，称取5g,加入5mL水稀释，按中国药典2005版一部附录VHG测定其pH值，要求pH值在4~7。三批制剂的测定结果见表2表2pH值测定试验数据批号07052007052207052414.654.674.6824.634.684.6734.644.694.66(3)无菌按中国药典2005年版一部附录XIIIB检查。结果见表3表3复方儿茶软膏无菌试验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6、含量测定本制剂处方中儿茶为君药，所以选择儿茶所含的有效成分儿茶素和表儿茶素作为本制剂的含量测定对象。中国药典2005版一部规定儿茶中含儿茶素和表儿茶素总量不得少于21.0%，本品含儿茶0.4g/支，故本品的含量限度为本品每支含儿茶以儿茶素(C16H1408)和表儿茶素(C16H1408)总量计，应不得少于84mg。(1)方法的选择根据中国药典2005版一部儿茶中儿茶素和表儿茶素含量测定方法，选择高效液相法作为制剂儿茶素和表儿茶素含量测定方法.(2)选择依据①测定波长的选择a.根据中国药典2005版一部儿茶含量测定项下HPLC法，选择280nm作为测定波长.b.紫外扫描:将标准品按中国药典2005版一部儿茶素和表儿茶素含量测定项下对照品溶液的制备方法，配制成含儿茶素和表儿茶素20ug/ml的溶液，在190nm-800nm范围扫描，本品在280nm和230.lnm处有最大吸收峰，考虑到230.1nm处有溶剂的末端吸收，对流动相的选择要求更严格，所以选择才企测波长为280nm。②色谱条件色镨柱DiamonsiLTMQi柱(4.6*250mm,5—;流动相曱醇-0.04M柠檬酸溶液一N,N-二曱基曱酰胺(13:45:8);流速lmL.min-1;4全测波长280nm;柱温35°C;进样量20|aL。③系统适应性取复方儿茶软膏、不含儿茶的软膏(阴性对照)及对照品儿茶素和表儿茶素按"2.8，，项下方法分别制备供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液，按上述色镨条件分别进样20pL,记录色谱图，结果理论塔板数按儿茶素峰计算不低于3000;儿茶素和表儿茶素与软膏中其他物质得到很好的分离，阴性对照对测定成分无干扰。线性关系；晴密称取儿茶素和表儿茶素对照品10.50mg和6.60mg，50%甲醇溶解定容于50mL容量瓶，摇匀，精密吸取此液各0.5mL、lmL、2mL、3mL、4mL、5mL,分别置于10mL容量瓶，50%曱醇定容，摇匀，即得儿茶素和表儿茶素对照品溶液。取20pl注入高效液相色语仪中，记录色谱图，结果见表4和表5。将浓度与主峰面积进行回归，得儿茶素和表儿茶素线性方程分别A=0.2714C-0.1391，r=0.9994;A=0.2439C+0.1,r=0.9996。线性范围分别为10.5~105fig.mL—1和6.6~66ng.mL—1。表4儿茶素标准曲线(n=6)C(pg/ml)10.5214263841052.7635.452511.006516.811223.257228.0346A2.76325.536711.025416.751223.192527.95782.83155.611411.208116.781423.449428.0384A平均值2.78595.533511.0816.781223.29928.0103RSD1.42%1.44%1.01%0.18%0.57%0.16%表5表儿茶素标准曲线(n=6)C(pg/ml)6.613.226.439.652.8661.68213.3136.41279.680413.3716.0731.70983.37266.43259.603813.2616.044A1.73793.41586.51799.640113.15616.0589A平均值1.70993.36716.45449.641413.26216.0586RSD1.63%1.53%0.87%0.40%0.81%0.09%⑤检测限和定量限:分别配制儿茶素和表儿茶素标准液,继续用50%曱醇稀释儿茶素稀释到浓度为0.525ug/ml时，A为噪音信号的10倍，进样量是20ul,那么本法测定儿茶素的定量限为10.5ng;稀释到0.1525ug/ml,A约为噪音信号的3倍，则本法测定儿茶素的检测限为3.15ng.同理测得表儿茶素的定量限为13.2ng，；险测限为3.96ng。(3)样品的含量测定①对照品溶液的制备精密称取儿茶素和表儿茶素对照品适量，50%甲醇溶解定容，即得。②供试品溶液的制备精密称取本品适量，用曱醇20mL转移溶解至25mL容量瓶，超声10min，甲醇定容，摇匀，过0.45|iim滤膜，取续滤液5mL于10mL容量瓶，纯净水定容，摇匀，即得供试品溶液.③测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20jil注入液相色谱仪中，记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中儿茶素和表儿茶素的含量。见表6表6三批样品儿茶素和表儿茶素素含量测定三批样品儿茶素和表儿茶素素含量测定主峰面积平均峰面积RSD/%总含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>13.81000.81486.26670.5141对照16.20120.51236.20860.51410.880.376.〗5780.516114.12971.2898对照214.05861.314614.11941.29640.401.2314.11941.2964将上述无菌复方儿茶软膏进行药理研究l.复方儿茶软膏皮肤用药安全性试验(1)皮肤急性毒性试验目的观察豚鼠完整皮肤及破损皮肤短时间接触复方儿茶软膏后所产生的毒性反应。方法①完整皮肤急性毒性试验取上述豚鼠20只，依体重随机分为2组，每组10只，A组复方儿茶软膏；B组基质。给药前24hr，用电推剪将背部脊柱两侧去毛，去毛面积约为40cm2。24hr后，将受试物分别均匀涂布于各组对应去毛区的皮肤上，给药量为lg/只。涂药后24hr,用温水洗去残留药液，而后1、24、48、72hr至第七日每天观察，观察内容为动物的全身中毒表现和死亡情况，包括动物皮肤、毛发、眼睛和粘膜的变化，呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等的变化。若有死亡动物则进行尸检，当有肉眼可见病变时，进行病理组织学检查。②破损皮肤急性毒性试验取豚鼠20只，称取体重，按上述方法去毛、分组后，用砂纸将去毛消毒皮肤磨破以渗血为度，再按上述方法喷药并观察，观察内容与完整皮肤急性毒性试验组相同。结果观察期内，动物皮肤、毛发、眼睛和粘膜及呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等均正常。未见动物死亡，体重正常增加，与对照组比较，无明显差异。(2)皮肤刺激性试验目的观察豚鼠完整皮肤及破损皮肤多次接触复方儿茶软膏后所产生的局部刺激反应。方法取上述豚鼠12只，用电推剪将背部脊柱两侧去毛，去毛面积左右各约为12cm2。观察24hr无刺激反应后，按体重随机分为2组，每组6只，雌雄兼用，其中一组进行完整皮肤刺激性试验，另一组进行破损皮肤刺激性试验，破损方法采用砂纸将去毛消毒皮肤磨破，以磨破表皮而不出血为度。给药方法均为各组豚鼠左侧脱毛区涂以0.5g复方儿茶软膏，右侧涂以0.5g基质，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再用粘贴手术巾固定，8hr后用温水洗去残留物。每日一次，连续给药7天，每次去除药物后lhr以及再次涂抹前观察刺激情况。末次敷药后，在去除药物后1、24、48、72hr肉眼观察皮肤刺激情况，并按《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中皮肤刺激性反应评分标准进行评分，并计算平均值，按"皮肤刺激性强度评价标准"进行评价。结果给药后，完整皮肤及破损皮肤组左右两侧皮肤未见明显红斑及水肿现象，各时间点刺激反应平均分值均为0分，按刺激强度评价标准判断，属无刺激性。结果见表7表7复方儿茶软膏对豚鼠皮肤刺激反应结果结、、、时果间\^完整皮肤受试物完整皮肤基质破损皮肤受试物破损皮肤基质1天00002天0011给3天0011药4天0011中5天00116天00117天0011停lhr0011<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(3)皮肤过敏试验(BT)目的通过动物皮肤重复涂抹复方儿茶软膏后，观察机体免疫系统在动物皮肤上的反应。方法取上述豚鼠30只，雌雄各半，称其体重，于试验前一日用电动推剪将其背部去毛(面积3x3cm2)。观察24hr，验证脱毛区无红斑、水肿、破损后，将动物分为三组，各组10只。第一组为复方儿茶软膏组，第二组为基质组，第三组为阳性对照组。试验时取上述受试物，1%DNCB、基质，按约0.2g/只剂量分别均匀喷布于相应组别脱毛区左侧，然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖，再用粘贴手术巾固定，持续6hr后，用温水洗去残留物，第7天和第14天，以同样方法各重复一次，共计三次。末次后第13天，将动物肋腹部去毛，方法及面积同背部，次日，以背部给药相同方法、剂量，于肋腹部脱毛区涂以相应受试物、0.1%DNCB、基质6hr后用温水清洗残留物，然后观察1小时并于第24、48、72hr后观察皮肤过敏反应情况，并按《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中皮肤过敏反应评分标准和皮肤过敏性评价标准进行评分和皮肤过敏性评价，同时观察动物是否有哞喘，站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。结果观察结果表明，受试物组及基质组在激发给药后的观察期内，豚鼠皮肤反应正常，无红斑、水肿，也无哮喘、站立不稳及休克现象，致敏率为0%,按标准判定为无皮肤过敏性反应。DNCB组动物在各^见定时间点，均表现有明显过敏反应，有明显的红斑水肿，反应率为100%，试验结果见表8表8复方儿茶软膏豚鼠过敏反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0000.74.93.0100结论在上述试验条件下，复方儿茶软膏及对照用复方儿茶软膏按2g/只剂量对正常豚鼠皮肤及破损皮肤给药，观察期内，均未见明显急性毒性反应。多次给药对豚鼠正常皮肤及破损皮肤无刺激性。对动物不产生局部及全身过敏反应。2.创伤模型的制备及创面形态学观察机械性创伤修复模型常用的有两种，一种是动物背部切割伤模型，其实验目的是观察皮肤以及组织愈合后的抗撕裂强度、定量观察创面肉芽组织的生成总量，以及创面肉芽组织中RNA、DNA......等含量变化；另一种模型是动物背部全层皮肤切除模型，用于评价药物疗效和观察创伤愈合的自然过程[13]。本实验目的是评价复方儿茶软膏的疗效，以及探讨其促进创伤愈合的作用机理，因此选用动物背部全层皮肤切除模型。fl《动物分组随机分为4组，编组为高剂量组(100%)、中剂量组(50%)、低剂量组(25%)、阳性对照组(EGF)。每组各8只。分笼饲养。fl动物模型的制备大鼠背部剪毛，10%硫化钠脱毛，温水洗净，拭干。次日，用1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后，将大鼠固定于手术台上，在背部肩胛稍靠后，离脊柱两侧1.5cm处，各标记一直径1.6cm的圓形切口线。经捵伏消毒皮肤后，用剪刀沿标记线剪除全层皮肤至筋膜，形成两个圓形创面，制成全层皮肤切除模型[14]。fi给药方法左侧为阴性对照侧，右侧为给药侧。模型制备2h后给药，阴性对照侧给O.lml生理盐水，阳性组给0.1mlEGF,高、中、低剂量组用药量均为0.4ml。然后用两层纱布覆盖包扎，再用粘贴手术巾固定。每创面给药l次/天，连续3天，换药前以生理盐水沖洗创面。稱观察指标和方法①创面形态学观察每次清洗创面后，肉眼观察创面情况，观察肉芽组织生长情基质100DNCB103.4况。②创面愈合率圓形全层皮肤切除后2h,用消毒的半透明称量纸贴于创面，沿创缘划线，用CAD软件计算所测面积，作为伤口的原始面积。于术后第3、7天测伤口残留面积，计算愈合率。愈合率=愈合面积/创口原始面积。结果形态学观察术后第1天，基本上每组的伤口都有渗液，有的有出血情况，仅高剂量组和低剂量组各有一只动物给药侧伤口有少量肉芽生长，其余伤口均尚未开始愈合，观察不出四组的区别。术后第7天，所有伤口均收缩明显，创面干燥结痂。EGF组术后第2天，给药侧伤口干燥，无渗出，创面基底部可见鲜红色的肉芽组织；对照侧伤口与第1天相比无明显变化，创面有较多渗液。术后第3天，给药侧表皮生长明显，但基本无肌肉增生，愈合面低于正常皮肤；对照侧伤口有渗液。高剂量组术后第2天，给药侧伤口有大量肉芽生长，创面鲜红，渗出液基本消失，创面干燥；对照侧伤口与第l天相比，无明显变化，创面有较多渗液。术后第3天，给药侧伤口已完全被肉芽组织填充，表面呈颗粒状，肉芽组织较坚实，愈合面略低于正常皮肤；对照侧伤口有渗液。中剂量组术后第2天，给药侧伤口有大量肉芽生长，创面鲜红，渗出液基本消失，创面干燥；对照侧伤口与第l天相比无明显变化，创面有较多渗液。术后第3天，给药侧伤口肉芽生长量比高剂量组少，创面呈颗粒状，愈合面高度低于正常皮肤(高度小于高剂量组);对照侧有少许肉芽生长，长出白色皮肤组织(高度小于给药侧)。低剂量组术后第2天，给药侧伤口均有少许肉芽生长，创面微红，无渗液；对照侧也有2只有生长情况，但肉芽生长量不及给药侧。术后第3天，给药侧与对照侧均有愈合现象，但肉芽生长量不明显，给药侧生长高度低于中剂量组。总体来说，两侧伤口生长情况无明显区别。不同给药组愈合率的比较采用配对t检验，比较给药侧与自身对照侧的愈合率；采用完全随机设计的方差分析，比较各给药组的愈合率。结果见表9和表10表9复方儿茶软膏对大鼠创面愈合率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表10各给药组与EGF组愈合率比较结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注l-高剂量组，2-中剂量组，3-低剂量组，4-EGF组由上述统计结果可知，中剂量组和阳性对照组与自身对照相比，愈合率差异显著(P<0.05);高剂量组与自身对照相比，愈合率差异有非常显著的统计学意义(P<0.01);低剂量组与自身对照相比愈合率无显著差异(P>0.05)。各给药组与阳性对照组比较，高剂量组与阳性对照组的差异显著(P<0.05)，中剂量组和低剂量组与阳性对照组无显著差异(P>0.05)。由此可见，高剂量和中剂量的复方儿茶软膏与EGF都能显著的促进伤口愈合，但低剂量的复方儿茶软膏对伤口愈合的意义不大。讨论创面愈合过程随着组织创伤的开始而发动。在伤后3天内，主要是局部炎症反应，伴随着修复细胞由静止转为激活形成最初的肉芽，3天后主要是肉芽组织大量增生。皮肤创面愈合率是衡量皮肤创面愈合快慢的中药指标。本研究采用大鼠背部全层皮肤圆形切除模型证实，创面局部使用本制剂可有效地提高创面愈合率，与生理盐水组比较，有较显著的差异。3.创面组织学观察取大鼠创面新生组织，制作常规病理组织学切片，光镜观察组织结构，评价创面的愈合情况。(1)标本取材及处理分别于术后第4、7天，以锋利手术刀取皮肤创缘及周围0.5cm左右宽的组织，深达皮下组织，将组织块置于10%中性緩和曱醛中固定5天后,常规石蜡包埋备用，将蜡块常规脱水，包埋,切成5fam切片后作HE染色。(2)HE染色步骤①石蜡切片经二甲苯脱蜡5~10min,然后投入100%,95%，90%,80%,70%,50。/。等各级酒精各35min,再入蒸馏水3min;②苏木精染液15~30min;③自来水冲洗变蓝；④含1%HCL的70%酒精分色至粉红色；⑤自来水冲洗变蓝；⑥蒸馏水，50%,70%,80%，90。/。酒精各3min;⑦入^f尹红染液染色lmin;⑧入100%酒精lmin⑨二曱苯透明，封片。染色结果普通显微镜下观察，细胞核为蓝色，细胞质为粉红色，胶原纤维呈红色。(3V见测指标和方法光镜观察皮肤及肉芽组织结构改变,并在400倍光学显微镜下每张切片随机选取5个视野，计数成纤维细胞，取5个视野观察值之均数作为各例的观察值。结果阴性对照创伤后第4天，HE染色镜下可见有幼稚肉芽组织增生，肉芽组织中有新生毛细血管形成，血管内皮细胞增生、肥大。每视野内炎症细胞和成纤维细胞数目较多，成纤维细胞胞体较大，胞核呈圓形或椭圆形。创伤后第7天，可见有多量着色较深的成纤维细胞，血管增生活跃，炎症细胞数量较少，可见新生增厚的上皮细胞层。阳'性^f照ia创伤后第4天，有众多新生的毛细血管生成，血管内皮细胞肥大，炎症细胞浸润较少，成纤维细胞数量较多，散在分布，胞体大，胞浆染色较淡。创伤后第7天成纤维细胞及炎症细胞数量增多，染色深，毛细血管数量减少。高剂量组镜下见创伤后第4天，新生毛细血管生成较多，成纤维细胞数量较低剂量组和阴性对照多，细胞虽散在分布，但排列呈束状，较为整齐，胞体大，胞浆染色较淡，局部有炎症细胞聚集。创伤后第7天，成纤维细胞及炎症细胞数量进一步增多，染色深，毛细血管数量减少。中剂量组创伤后第4天，有较多毛细血管生成，血管内皮细胞肥大，局部有炎症细胞聚集，淡染的成纤维细胞数量较多，散在分布，胞体大。创伤后第7天，成纤维细胞及炎症细胞增多，毛细血管成分多。低剂量组创伤后第4天，有众多新生毛细血管生成，血管内皮细胞肥大，炎症细胞浸润较少，成纤维细胞数量较少，核呈圆形或椭圓形，染色较深。创伤后第7天，细胞成分多，有较多的炎症细胞浸润，成纤维细胞数量多，染色较深，毛细血管成分多。结果见表11表11复方儿茶软膏对大鼠创面组织成纤维细胞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注*与阴性对照比较PO.05由表ll可知，阳性组、高剂量组和中剂量组均能显著的促进创面愈合组织成纤维细胞的增生。在创伤修复、愈合过程中，其关键的步骤之一是肉芽组织的形成，肉芽组织的质量好坏直接影响着创面的修复愈合程度及其预后。肉芽组织的本质是大量的毛细血管和微小血管及丰富的成纤维细胞。肉芽组织在损伤后2~3天内即可出现，自下而上，或从周围向中心生长推进，随着时间推移，肉芽组织按其生长的先后顺序，逐渐成熟。其主要形态为间质的水分逐渐减少；炎性细胞减少并逐渐消失，部分毛细血管管腔闭塞，数目减少，成纤维细胞产生越来越多的胶原纤维，同时成纤维细胞数目逐渐减少，变为纤维细胞，时间再长，胶原纤维量更多，细胞和毛细血管成分更少[15]。本实验的创面生长情况符合这一过程，且阳性组、高剂量组和中剂量组均能促进这一过程的完成，与阴性对照相比，能显著的促进创伤愈合。4.创面新生组织中总蛋白及羟脯氨酸含量的测定胶原是机体非常重要的结构蛋白之一，由于其在结締组织中提供稳定性而具有重要特殊性，它构成创面的基质。胶原是极少数含有羟脯氨酸的蛋白质之一，因此通过测定创面羟脯氨酸的含量来反映创面胶原的含量，从而评价创面愈合的能力。样本前处理于术后第4、7天，切取创面组织，去除皮下脂肪，吸干水分，取约200mg精密称重，于-200C水箱冷冻保存，备用。组织匀浆液的制备取待测组织，纟安重量体积比加生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000转/分，离心10min,然后取组织匀浆上清，再用生理盐水按l:4稀释成2%的组织匀浆，待测。3.创面组织中总蛋白含量测定(考马斯亮兰法)蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。操作步骤见表12表12蛋白含量测定操作表空白管标准管测定管蒸馏水(ml)0.563g/L标准液(ml)样品(ml)考马斯亮兰显色剂(ml)0.050.053.00.053.0混匀，静置10分钟，于595nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管OD值。计算公式蛋白含踏/^IH^I^III^Ix标准管浓度fe/丄)(1)标准管OD值-空白管OD值创面组织中羟脯氨酸的含量测定(消化法)羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二曱基苯甲醛作用呈现紫红色，通过测定吸光度值可计算出羟脯氨酸的含(l)消化见表13,各管混匀，370C水浴3小时表13羟脯氨酸含量测定操作表空白管标准管测定管双蒸水(ml)0.252|ug/ml标准应用液(ml)0.25检测液(ml)0.25消化液(ml)0.050.050.05(2)测定①各管加试剂一0.5ml，混匀，室温静置10分钟；②各管加试剂二0.5ml，混匀，室温静置5分钟；③各管加试剂三l.Oml，混匀，600C水浴15分钟，流水冷却后，3500转/分离心，IO分钟，取上清在550nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度。(2)计算公式组织中羟脯氨酸含量-测定管吸光度-空白管吸光度(标准管浓度蛋白含量(〃g/附伊ro,)=标准管吸光度-空白管吸光度X(2傳/附/)5.结果(1)组织总蛋白含量的测定创伤后第4天，阳性组的创面组织平均总蛋白含量与阴性对照的创面组织平均总蛋白含量相比有非常显著的统计学意义(PO.01),高剂量组和中剂量组与阴性对照相比有显著的统计学意义(P0.05)，低剂量组与阴性对照相比无显著的统计学意义(P〉0.05)，高、中、低剂量组与阳性对照相比无显著的统计学意义(P〉0.05)。创伤后第7天，高、中剂量组和阳性组的创面组织平均总蛋白含量与阴性对照的创面组织平均总蛋白含量相比均有非常显著的统计学意义(P<0.01),低剂量组与阴性对照相比无显著的统计学意义(P〉0.05)，高剂量组和中剂量组与阳性对照相比无显著的统计学意义(P〉0.05)，低剂量组与阳性组相比有显著的统计学意义(P〈0.05)。各组创面总蛋白含量随时间增长而增加。结果见表14表14创面组织中总蛋白含量的测定(7±s,g/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注与生理盐水组比4交，*P<0.05，**P<0.01(2)创面组织中羟脯氨酸含量的测定创伤后第4天，EGF组和高剂量组的创面组织中平均羟脯氨酸含量与阴性对照的相比有显著的统计学意义(P<0.05)，低剂量组与生理盐水组相比无显著的统计学意义(P〉0.05)，高、中、低剂量组与EGF组相比无显著的统计学意义(P〉0.05)。创伤后第7天，高剂量组和中剂量组的创面组织平均羟脯氨酸含量与生理盐水组的创面组织平均羟脯氨酸含量相比均有非常显著的统计学意义(PO.Ol)，EGF组与生理盐水组相比有显著的统计学意义(P<0.05)，低剂量组与生理盐水组相比无显著的统计学意义(P〉0.05),高、中、低剂量组与EGF组相比无显著的统计学意义(P〉0.05)。各组创面组织羟脯氨酸含量随时间增长而增加。结果见表15表15创面组织中鞋脯氨酸的含量测定(7±s,ng/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注与阴性对照比较，*P<0.05，**P<0.0权利要求1、一种用于伤口愈合的复方儿茶软膏，它是由下列药用原料配制而成儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶，原料的重量比为2∶0.5～1.5∶0.5～1.5∶1.5～3.5∶0.5～1.5∶3～10。2、如权利要求1所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏，其特征在于所述儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶的重量比为2:0.8~1.2:0.8~1.2:1.8~2.2:0.8-1.2:4~8。3、如权利要求1所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏，其特征在于所述儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶的重量比为2:1:1:2.4:1:5。4、一种用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于它是将儿茶、乳香和没药分别粉粹后混合，或将儿茶、乳香和没药混合后粉粹；将红参的提取物和黄荒的提取物与上述混合物进行混合得第二混合物；将白芨胶水浸泡加热与第二混合物混合均匀后，进行灭菌处理得到复方儿茶软膏，所述药用原料儿茶、乳香、没药、黄莱、红参和白芨胶的重量比为2:0.5~1.5:0.5~1.5:1.5~3.5:0.5~1.5:3~10。5、如权利要求4所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于所述红参的提取物是乙醇回流法提出得到的提取物。6、如权利要求5所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于它是用5~IO倍于红参重量，体积浓度为50%的乙醇至少回流提取1次后，浓缩后的提取物浓缩液(回流提取的工艺过程)。7、如权利要求4所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于所述黄芙的提取物是黄芪的水煎煮提取物。8、如权利要求7所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于它是用110倍于黄芪重量的水，至少煎煮提取l次后，浓缩后的提取物浓缩液。9、如权利要求4所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于儿茶、乳香和没药分别粉粹后分别通过不低于卯目的过滤后在混合。10、如权利要求6或8所述用于伤口愈合的复方儿茶软膏的配制方法，其特征在于所述红参提取物浓缩液中每毫升相当0.04-lg生药；黄芪提取物浓缩液中每毫升相当0.1~2.4克生药。全文摘要本发明公开了一种用于伤口愈合的复方儿茶软膏及其配制方法。它是将儿茶、乳香和没药分别粉粹后混合，或将儿茶、乳香和没药混合后粉粹；将红参的提取物和黄芪的提取物与上述混合物进行混合得第二混合物；将白芨胶水浸泡加热与第二混合物混合均匀后，进行灭菌处理得到复方儿茶软膏，所述药用原料儿茶、乳香、没药、黄芪、红参和白芨胶的重量比为2∶0.5～1.5∶0.5～1.5∶1.5～3.5∶0.5～1.5∶3～10。活血散瘀，行气止痛，收敛消肿，收湿生肌之功效。其配制方法简单，质量易控制，稳定性好。文档编号A61P17/02GK101357191SQ200810196908公开日2009年2月4日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者易以木申请人:易以木