专利名称：一种提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法
技术领域：
本发明属于分析化学、纳米生物技术和生物分析技术领域，具体涉及一 种提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法，其在细胞标记、肿瘤成像 等方面都有广阔的应用前景。
背景技术：
量子点，因其具有荧光强度高、荧光光发射峰窄而对称、无拖尾、光 稳定性好、耐光漂白等优点，使得其成为有望弥补传统的荧光染料不足的 新型荧光物质。目前，它已被广泛地应用于生物学领域并取得了许多重要 成果。在金属离子的检测，蛋白质的相互作用，细胞的标记与成像及组织 与动物活体成像方面有广阔的应用前景。
尽管量子点生物探针已被广泛用于生命科学的各个方面，但是在生物
学研究的温度范围内对于量子点生物探针的温度敏感性研究却极少。Liu等 研究了巯基乙酸包被的CdSe/ZnS水溶性量子点的温度敏感性，环境温度的 改变会对生物探针的荧光强度和波长产生较大影响，且量子点温度稳定性 较差，反复升温降温其荧光不可恢复，这将给荧光的检测带来较大误差(Liu T.C.， et al., Analytica Chimica Acta, 2006, 559, 120-123.)。因此研究一种操作 简单，产率高并且能够提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法将成为 生物标记领域的关键技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高量子点生物探针环境温度稳定性的方 法，该方法具有较高的精确性和可重复性，并且操作简单易行。
本发明提供的提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法，其步骤为 (l)将含Cd或Zn的水溶性量子点用异丙醇洗涤，去除水溶性量子点 溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；
(2)向水溶性量子点中加入变性蛋白质，使水溶性量子点与变性蛋白质 的摩尔比在l: l与l: 4之间，然后60，80。C水浴中加热10-30分钟，得 到连接产物；
(3)用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个 吸收峰的流出物；
(4)对上述流出物进行浓縮，得到量子点生物探针。
所使用的变性蛋白质可以按照下述方法获取向0.01-0.1毫摩尔/升 的蛋白质水溶液中加入硼氢化钠，使得硼氢化钠的浓度为l-io毫摩尔/升， 静置0. 5-2小时后，放在60-80°C的水浴中加热10-30分钟。
本发明实现了一种提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法，先制 备水溶性的量子点，再通过竞争取代方法用变性蛋白取代量子点表面的巯 基小分子，使变性蛋白与量子点连接，得到量子点生物探针的环境温度稳 定性大幅提高，可以直接应用于金属离子的检测和细胞成像。同时，量子 点表面还提供了氨基、羧基等活性基团，可以与生物分子进一步连接。本 发明在提高量子点的温度稳定性的同时，其量子产率也有较大的提高，同 时为生物识别分子在其上的固定也提供了更多的选择。这种量子点生物探 针在生物标记中有着较大的应用价值。
图l为CdTe量子点的荧光光谱随温度变化的曲线； 图2为变性蛋白修饰的CdTe量子点生物探针的荧光光谱随温度变化的 曲线；
图3A为反复升温降温对量子点荧光强度的影响，图,3B为反复升温降温 对量子点荧光发射波长的影响。
具体实施例方式
本发明方法是通过将蛋白中的二硫键用化学变性的方法转化为巯基， 通过巯基与Cd、 Zn之间的强烈作用结合来实现的。本发明所适用的量子点 为含Cd或Zn的水溶性量子点，如CdS、 CdTe、 CdSe、 CdSe/ZnS、 CdTe/CdS 中的任一种，所使用的蛋白质也可以采用任意一种，如牛血清白蛋白、卵 清蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等。下面结合实例对本发明做进一步的阐 述，而不是要对本发明进行限制。 实施例1
(1) 向0.05毫摩尔/升的牛血清白蛋白水溶液中加入硼氢化钠，使得 硼氢化钠的浓度为2毫摩尔/升，静置1小时后，放在70°C的水浴中加热 20分钟，得到变性牛血清白蛋白。
(2) 取200毫升的巯基乙酸包被的CdTe量子点用异丙醇反复洗涤， 去除水溶性量子点溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；
(3) 加入100微升变性牛血清白蛋白，在70。C水浴中加热15分钟。
(4) 用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个 吸收峰的流出物，检测波长为280纳米。选用G100葡聚糖凝胶，缓冲液为 0. 01摩尔/升磷酸盐缓冲液，流速为300微升/分钟。
(5) 对上述流出物进行浓縮，即得到量子点生物探针。
实施例2(1) 向0.1毫摩尔/升的卵清蛋白水溶液中加入硼氢化钠，使得硼氢 化钠的浓度为5毫摩尔/升，静置0.5小时后，放在75。C的水浴中加热30 分钟，得到变性卵清蛋白。
(2) 取200毫升的巯基丙酸包被的CdTe量子点用异丙醇反复洗涤， 去除水溶性量子点溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；
(3) 加入IOO微升变性卵清蛋白，在70。C水浴中加热15分钟。
(4) 用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个 吸收峰的流出物，检测波长为280纳米。
(5) 对上述流出物进行浓縮，即得到量子点生物探针。
实施例3
(1) 向0.08毫摩尔/升的转铁蛋白水溶液中加入硼氢化钠，使得硼氢 化钠的浓度为2毫摩尔/升，静置1小时后，放在70。C的水浴中加热20分 钟，得到变性转铁蛋白。
(2) 取200毫升的谷胱甘肽包被的CdTe量子点用异丙醇反复洗涤， 去除水溶性量子点溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；
(3) 加入100微升变性转铁蛋白，在65。C水浴中加热20分钟。
(4) 用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个 吸收峰的流出物，检测波长为280纳米。
(5) 对上述流出物进行浓縮，即得到量子点生物探针。
实施例4
(1) 向0.04毫摩尔/升的免疫球蛋白水溶液中加入硼氢化钠，使得硼 氢化钠的浓度为8毫摩尔/升，静置1.5小时后，放在7(TC的水浴中加热 25分钟，得到变性免疫球蛋白。
(2) 取200毫升的巯基丁二酸包被的CdTe量子点用异丙醇反复洗涤，
去除水溶性量子点溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；
(3) 加入100微升变性免疫球蛋白，在70。C水浴中加热30分钟。
(4) 用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个 吸收峰的流出物，检测波长为280纳米。
(5) 对上述流出物进行浓縮，即得到量子点生物探针。
根据本发明所述方法，可以制备变性蛋白包裹的其他类型量子点。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施 例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修 改，都落入本发明保护的范围。
权利要求
1、一种提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法，其步骤包括(1)将含Cd或Zn的水溶性量子点采用异丙醇洗涤，去除水溶性量子点溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；(2)向水溶性量子点中加入变性蛋白质，使水溶性量子点与变性蛋白质的摩尔比在11与14之间，然后60-80°C水浴中加热10-30分钟，得到连接产物；(3)用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个吸收峰的流出物；(4)对上述流出物进行浓缩，得到量子点生物探针。
2、 根据权利要求1所述的提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法, 其特征在于步骤(2)中，通过向0.01-0. l毫摩尔/升的蛋白质水溶液中 加入硼氢化钠，使得硼氢化钠的浓度为1-10毫摩尔/升，静置0.5-2小时 后，放在60-80。C的水浴中加热10-30分钟，得到变性蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种提高量子点生物探针环境温度稳定性的方法，步骤为①将含Cd或Zn的水溶性量子点采用异丙醇洗涤，去除水溶性量子点溶液中多余的表面稳定剂，然后用惰性气体吹干；②向水溶性量子点中加入变性蛋白质，使水溶性量子点与变性蛋白质的摩尔比在1∶1与1∶4之间，然后60-80℃水浴中加热10-30分钟，得到连接产物；③用葡聚糖凝胶层析法对上述连接产物进行分离纯化，收集第一个吸收峰的流出物；④对上述流出物进行浓缩，得到量子点生物探针。本发明具有很好的精确性和重复性，操作简单易行，而且得到的生物探针具有优异的光学性质，有利于促进量子点生物标记技术的发展和应用。
文档编号A61B5/00GK101393206SQ200810197230
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月10日 优先权日2008年10月10日
发明者王建浩, 王海桥, 赵元弟 申请人:华中科技大学