专利名称：：黄酮衍生物的用途及制备方法
技术领域：
：本发明涉及黄酮衍生物的用途及制备方法，属于医药领域。
背景技术：
：翠云草为巻柏科植物翠云草(5Wag/"e〃a(^mv.)^n'"g)的全草。味微苦，性寒。有清热利湿，解毒，消瘀，止血的功效。主治黄疸，痢疾，水肿，风湿痹痛，咳嗽吐血，喉痈，痔漏，刀伤，烫伤。黄酮类化合物是泛指两个苯环通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物。双黄酮类化合物为2个黄酮类化合物连接而成的化合物，其连接方式较多，结构复杂。双黄酮类化合物具有显著的抗肿瘤，抗病毒，抗炎等药理作用，对心血管系统疾病也有一定的疗效，具有广阔的医疗前景。缺氧是指氧气缺乏症，即空气中缺氧或氧气缺乏状态的总称。机体缺氧时会引起机能代谢变化，包括机体对缺氧的代偿性反应和由缺氧引起的代谢与机能障碍。对机体的呼吸系统，循环系统，血液系统等各个系统均会产生不同程度的影响。机体进入高海拔低压、低氧环境后，受低氧、寒冷等环境刺激引起周边小血管收縮，中心循环量增加，心功能失调和肺动脉压升高，引起组织器官水肿，另一方面则由于周边组织和器官血管阻力增加，血流缓慢和减少，更进一步缺血和缺氧，产生严重急慢性高原病。神经系统对于缺氧最为敏感，即便轻度缺氧也有可能出现智力和视觉的功能紊乱。脑是人体各器官中对氧的需求最大的器官。脑的重量只占体重的2%3%，而脑的耗氧量占人体总耗氧量的20%30%。心脏输出血量的15%都供给了脑。但是，脑组织本身几乎没有一点点供能物质储备，全部依靠脑循环带来新鲜血液里面的氧气来维持生存和执行正常的生理功能。所以，脑组织对缺氧(缺血)的耐受能力最低。脑的慢性轻度缺氧即可引发困倦、注意力分散、记忆力降低等症状，随之出现意识障碍、惊厥、昏睡或昏迷，以至死亡。如果脑的供血供氧完全中断，在815秒就会丧失知觉，610分钟就会造成不可逆转的损伤。由于缺氧造成的脑疾病包括缺氧缺血性脑损伤，脑缺血再灌注损伤，脑缺血再灌注后所致肺损伤，脑卒中，脑栓塞，新生儿缺血缺氧性脑病，缺氧性神经细胞凋亡。心脏也是耗氧量大、代谢率高和氧储备少的器官，所以对于缺氧也很敏感，最容易受到损伤。严重缺氧和持续缺氧，可使心肌收縮力降低、心率缓慢、心脏的血液输出量减少，与缺氧症状形成恶性循环，甚至心肌细胞变性、坏死。持续的慢性缺氧容易发生心力衰竭，心肌缺血再灌注损伤，冠心病及心绞痛等。生物体内的氧过量会产生自由基，当体内产生过多的自由基时，不仅会破坏遗传物质、蛋白质交联或多肽断裂,一些代谢酶因交联聚合而失活，引起一系列损伤，疾病，导致人体衰老，而且自由基还会攻击生物膜上的多不饱和酸，产生脂质过氧化。经过多年的研究现已证明自由基与一百多种人类疾病有关。其中包括肿瘤，心血管疾病(动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤，冠心病、高血压、心力衰竭等)，脑损伤(中风、新生儿缺氧缺血性脑病，脑卒中，脑缺血，脑梗死等)，衰老及由衰老引起的疾病(阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎縮性侧索硬化等)，肾脏疾病(急性肾小管坏死、肾病综合症、溶血尿毒综合症、急慢性肾衰竭、肾小球疾病、肾缺血-再灌注、肾盂肾炎等)，肺部疾病(慢性阻塞性肺病、肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、慢性支气管炎、哮喘、肺水肿等)，各种肝病(慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝脏疾病、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌等)，消化道疾病(胃黏膜损害、慢性胃炎、消化性溃疡、急性胰腺炎、炎性肠病、反流性食管炎、结肠炎等)，妇科疾病(宫颈癌、卵巢癌、宫体癌、子宫肌瘤、卵巢囊肿、子宫内膜异位症、妊娠高血压综合征)，皮肤病(皮肤肿瘤、光老化、红斑狼疮、白癜风及银屑病)，糖尿病及其并发症(糖尿病血管并发症、糖尿病神经病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等)。
发明内容本发明的首要目的在于提供一种黄酮衍生物作为抗氧化和抗缺氧药物或食品的用途。本发明的另一目的是提供一种制备上述黄酮衍生物的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，所述的黄酮衍生物具有如下结构通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述黄酮衍生物的2—3位为双键或单键；所述黄酮衍生物的R,为氢或结构式(A)，R2为氢或甲基，R3为氢、结构式(A)、结构式(B)、结构式(C)、结构式(D)或结构式(E)，R4为氢或甲基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述黄酮衍生物是(2S)-2，3-二氢-4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮(式1)、2〃，3〃-二氢罗波斯塔黄酮(式2)、2〃，3〃-二氢-4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮(式3)、(2S，2〃S)4'-甲氧基-四氢罗波斯塔黄酮(式4)、(2S，2"S)7〃-甲氧基-四氢罗波斯塔黄酮(式5)、(2S)2，3-二氢-4'-甲氧基-穗花杉双黄酮(式6)、(2S，2〃》-4'-甲氧基-四氢穗花杉双黄酮(式7)、6-(5-羧基-2-甲氧基-苯基)-芹菜素(式8)中的至少一种。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式8所述抗缺氧药物或食品是用于改善或治疗缺血性机体组织损伤的药物或食品。所述抗氧化药物或食品是用于改善机体内环境，增强抗氧化能力的药物或食品。本发明的改善或治疗缺血性机体组织损伤的药物或食品组合物，含有10%90%治疗有效量的上述黄酮衍生物和10%90%药学上可接受的载体。本发明的改善机体内环境，增强抗氧化能力的药物或食品组合物，含有10%90%治疗有效量的上述黄酮衍生物和10%90%药学上可接受的载体。上述的黄酮衍生物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)将翠云草的干燥全草粉碎，用810倍翠云草重量的溶剂或水进行回流提取；:(2)过滤或离心去除不溶物，减压干燥，得到初提物；(3)将初提物分散于等体积水中，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取;(4)取乙酸乙酯萃取液，真空减压干燥，得乙酸乙酯萃取物。(5)用色谱法分离精制得到。步骤(1)所述的溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯的一种或几种；歩骤(1)所述的回流提取的提取温度为20-100°C，提取时间为1-72小时；步骤(5)所述的色谱法是正相色谱法、反向色谱法、凝胶色谱法。本发明的作用机理是本发明提供的双黄酮类化合物具有较强的抗氧化作用，易于与体内的自由基相结合，可以降低缺氧状态下生物机体内过高的自由基浓度，保护机体抗氧化系统不被破坏。本发明相对现有技术具有如下的优点及效果(1)提供了一种结构新颖的黄酮类化合物；(2)通过对小鼠密闭性缺氧的保护作用的动物体内模型和对PC12细胞缺氧的保护作用的体外细胞模型，确定了本发明化合物具有显著抗缺氧作用，可以作为抗缺氧药物使用；通过氧自由基吸收能力(oxygenradicalabsorbancecapacity,ORAC)模型，确定了本发明化合物具有显著抗氧化作用，可以作为抗氧化药物使用。具体实施例方式实施例1(1)将翠云草(Selaginellauncinata(Desv.)Spring)的干燥全草4.2公斤粉碎，用10倍翠云草重量，即42公斤的60%乙醇加热回流提取三次，每次2小时，合并提取液；(2)过滤除去不溶物，滤液减压干燥得到乙醇浸膏。(3)乙醇浸膏分别以等体积乙酸乙酯、正丁醇萃取3次；(4)取乙酸乙酯萃取液，真空减压干燥，得乙酸乙酯提取物。(4)将乙酸乙酯提取物经行开放硅胶柱层析，以氯仿甲醇分别为99:1，98:2，97:3，95:5，9:1，8:2，7:3，6:4的溶剂梯度洗脱。综合运用凝胶SephadexLH-20柱色谱，ODS柱色谱，RP-18高效液相制备等分离手段，对氯仿甲醇95:5，9:1，8:2洗脱部分进行分离，得到并鉴定了17个双黄酮类和黄酮类化合物(25)-2，3-二氢-4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮((25)-2，3-dihydrorobustaflavone-4'國methylether)(1)*，(2"5)-2〃,3〃陽二氢罗波斯塔黄酮((2"5>2〃，3"-dihydrorobustaflavone)(2)*，2',3'-二氢-4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮(2',3'-dihydrorobustaflavone-4'-methylether)(3)*，(2&2〃5>4'-甲氧基-四氢罗波斯塔黄酮((2&2〃5>2,3,2',3'-tetrahydrorobustaflavone-4'-methylether)(4)*，(2&2〃5)-7〃-甲氧基-四氢罗波斯塔黄酮((2&2"5)-2，3,2'，3'陽tetrahydrorobustaflavone-7〃-methylether)(5)*，(2》-2,3-二氢-4'-甲氧-穗花杉双黄酮((2Q-2,3-dihydroamentoflavone-4'-methylether)(6)*，(2&2"^-4'-甲氧基-四氢穗花杉双黄酮((2&2〃5>2，3,2',3'-tetrahydroamentoflavone-4'-methylether)(7)*，6-(5-羧基-2-甲氧基-苯基)-存菜素(6-(5-carboxyl-2陽methoxyphenyl)-apigenin)(8)*，(2S，2"5)-四氢穗花杉双黄酮((2&2〃5)-tetrahydroamentoflavone)(9)，(2&2〃5>四氢罗波斯塔黄酮((2&2"5)-tetrahydrorobustaflavone)(10)，(2S)-2,3-二氢穗花杉双黄酮((2S)-2,3-dihydroamentoflavone)(11)，2',3'-二氢穗花杉双黄酮(2',3'-dihydroamentoflavone)(12)，穗花杉双黄酮(amentoflavone)(13)，(25)-2，3-二氢-7〃-甲氧基扁柏双黄酮((2》-2,3-dihydroisocryptomerin)(14)，罗波斯塔黄酮(robustaflavone)(15)，4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮(robustaflavone4'-methylether)(16)(其中，有*号者为新化合物，结构如下)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>实施例2取实施例1制得的化合物1-16分别配制成浓度为180(imol/L、90pmol/L、45pmol/L的药液作为药物组，以10。/。DMSO为对照组，对PC12细胞进行细胞缺氧保护试验，计算PC12细胞存活百分率。实验结果经Student'sttest计算，表示为mean士SD。结果见表1。表1化合物对PC12细胞缺氧损伤的影响(3f土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与对照组相比*P<0.05，**P<0.01结论从表9可以看出，与空白溶剂组对比化合物1-16在不同浓度下对缺氧PC12细胞均具有较强的保护作用，具有体外抗缺氧活性。说明这16个化合物可以作为抗缺氧药物应用。实施例3取实施例1制得的化合物1-16分别配制成浓度为40mg/mL的药液作为药物组，以20Q/。DMSO为对照组，进行小鼠密闭性缺氧耐力试验，观察小鼠在密闭条件下的存活时间。结果见表2。表2缺氧条件下小鼠的存活(3fiSD，w-10)组别剂量存活时间(g/Kg)(min)对照1.028.75±5.35Compound11.042.03±6.49**Compound21.044.69±8.32**Compound31.041.56±7.67**Compound41.038.53±7.21'Compound51.043.22±6.32**Compound61.040.17士8.54'Compound71.045.38±5.92**Compound81.043.98±7.26**Compound91.035.83±5.09'Compound101.037.13±6.47'Compound111.036.32±6.03'Compound121.042.54±7.71"Compound131.039.65±6.49'Compound141.038.74±6.72'Compound151.039.06±7.84'Compound161.041.63±5.36**注与对照组相比*P<0.05，**P<0.01结论从表10可以看出，与对照组相比化合物1-16能显著的提高小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间，具有一定的体内抗缺氧活性，可以作为抗缺氧药物使用。将0.5g化合物1与0.5g化合物6同20g淀粉混合均匀，加入适量10%淀粉桨制成软材，制粒后置于8(TC下干燥后，于12目筛整粒，加入1.5g滑石粉混合后，单冲压片机压片，得药物片剂。将此药物片剂配制成浓度为40mg/mL的药液作为药物组，以20y。DMSO为对照组，进行小鼠密闭性缺氧耐力试验，观察小鼠在密闭条件下的存活时间。结果见表3。表3缺氧条件下小鼠的存活((i±SD，"=10)组别剂量存活时间Cg/Kg)(min)对照1,025.37±5.42药物组1.040.62±6.19"注与对照组相比**P<0.01结论从表ll可以看出，与对照组相比实施例4制得的片剂药物组合物能显著的提高小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间，具有一定的体内抗缺氧活性，可以作为抗缺氧药物使用。实施例5将0.5g化合物4与0.5g化合物15同20g淀粉混合均匀，加入适量100^淀粉浆制成软材，制粒后置于8(TC下干燥后于12目筛整粒，加入1.8g硬脂酸镁混合后，灌装胶囊，药物胶囊剂。将此药物片剂配制成浓度为40mg/mL的药液作为药物组，以20%DMSO为对照组，进行小鼠密闭性缺氧耐力试验，观察小鼠在密闭条件下的存活时间。结果见表4。表4缺氧条件下小鼠的存活(i±SD，w=10)对照剂量存活时间(g/Kg)(min)对照1.025.37±5.42药物组1.043.28±7.61"注与对照组相比**P<0.01结论从表ll可以看出，与对照组相比实施例6制得的胶囊剂药物组合物能显著的提高小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间，具有一定的体内抗缺氧活性，可以作为抗缺氧药物使用。实施例6:本实验原理为荧光素钠在485nm光激发下，发射527nm荧光，可以被AAPH释放的过氧自由基氧化而使荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的速度。根据这一特性，可用来测定样品氧自由基清除活性。实验结果表达为荧光衰退曲线下积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的保护面积。不同抗氧化剂的保护面积统一换算成1wmolL"Trolox(TE)的保护面积进行比较。具体测定方法是将96孔板每个微孔中加入待测样品溶液20uL，再加入磷酸钾缓冲液20yL和AAPH140uL(终浓度12.8mmolL'1)，最后添加荧光素钠20PL至终浓度为63nmol*L"，立即启动反应并迅速将酶标板置于预温37。C的荧光酶标仪中开始测定。采用动力学方式，每2min测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。实验结果经Student'sttest计算，表示为mean士SD。结果见表5。表5氧自由基清除能力试验(i±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结论从表13可以看出，实施例1制得的化合物1-16在氧自由基吸收能力(ORAC)体系中的抗氧化活性均强于阳性药Vc，且具有一定的量效关系。说明这16个化合物具有较强的抗氧化活性，可以作为抗氧化药物应用。权利要求1、黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，所述的黄酮衍生物具有如下结构通式2、根据权利要求1所述的黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，其特征在于所述黄酮衍生物的2—3位为双键或单键；所述黄酮衍生物的Ri为氢或结构式(A)，R2为氢或甲基，R3为氢、结构式(A)、结构式(B)、结构式(C)、结构式(D)或结构式(E)，R4为氢或甲基；3、根据权利要求1所述的黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，其特征在于所述黄酮衍生物是(2S)-2，3-二氢-4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮、2"，3"-二氢罗波斯塔黄酮、2"，3〃-二氢-4'-甲氧基-罗波斯塔黄酮、(2S，2〃S)4'-甲氧基-四氢罗波斯塔黄酮、(2S，2"S)7"-甲氧基-四氢罗波斯塔黄酮、(2S)2，3-二氢-4'-甲氧基-穗花杉双黄酮、(2S，2〃5)-4'-甲氧基-四氢穗花杉双黄酮、6-(5-羧基-2-甲氧基-苯基)-开菜素中的至少一种。4、根据权利要求1所述的黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，其特征在于所述抗缺氧药物或食品是用于改善或治疗缺血性机体组织损伤的药物或食品。5、根据权利要求1所述的黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，其特征在于所述抗氧化药物或食品是用于改善机体内环境，增强抗氧化能力的药物或食品。6、根据权利要求4所述的黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，其特征在于所述的用于改善或治疗缺血性机体组织损伤的药物或食品含有10%90%治疗有效量的权利要求13任一项所述的黄酮衍生物和10%90%药学上可接受的载体。7、根据权利要求5所述的黄酮衍生物作为抗缺氧和抗氧化药物或食品的用途，其特征在于所述的用于改善机体内环境，增强抗氧化能力的药物或食品含有10%90%治疗有效量的权利要求13任一项所述的黄酮衍生物和10%90%药学上可接受的载体。8.如权利要求1所述的黄酮衍生物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)将翠云草的干燥全草粉碎，用810倍翠云草重量的溶剂或水进行回流提取；(2)过滤或离心去除不溶物，减压干燥，得到初提物；(3)将初提物分散于等体积水中，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；'(4)取乙酸乙酯萃取液，真空减压干燥，得乙酸乙酯萃取物。(5)用色谱法分离精制得到。9、根据权利要求8所述的黄酮衍生物的制备方法，其特征在于步骤(l)所述的溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯的一种或几种；步骤(1)所述的回流提取的提取温度为20-100°C，提取时间为l-72小时；步骤(5)所述的色谱法是正相色谱法、反向色谱法、凝胶色谱法。全文摘要本发明涉及医药领域，提供了一种黄酮衍生物作为抗氧化和抗缺氧药物或食品的用途。该化合物具有如右结构通式。该黄酮衍生物的制备方法包括以下操作步骤将翠云草的干燥全草粉碎，用溶剂或水进行回流提取；过滤或离心去除不溶物，减压干燥，得到初提物；将初提物分散于等体积水中，依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；取乙酸乙酯萃取液，真空减压干燥，得乙酸乙酯萃取物；用色谱法分离精制得到。文档编号A61P39/06GK101361733SQ200810198590公开日2009年2月11日申请日期2008年9月17日优先权日2008年9月17日发明者丁爱石,刘宏伟,吴丽颖,姚新生,毅戴,王乃利,明范,郑俊霞,昊高申请人:暨南大学