专利名称：具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型温敏纳米药物载体的制备方法，尤其是一种 具有磁性和叶酸双重耙向的温敏纳米药物载体的制备方法，以及通过 该制备方法获得的温敏纳米药物载体及其用途。
背景技术：
根据大量的研究表明，叶酸受体是一种在多种癌细胞中广泛过量 存在并且能和叶酸分子发生特殊相互作用的物质。利用叶酸与叶酸受 体特有的相互作用，人们通常将叶酸作为特殊的靶向分子来修饰各种 纳米尺寸的抗癌药物载体，起到对癌细胞的靶向识别作用，从而提高 药物的传递效率，同时可以降低药物的副作用。
在各种载体中，具有空腔结构的载体因其特有的性质，例如较大
的内部空间尺寸和壳层可调节的渗透性，在装载DNA，蛋白质以及各 种药物分子的领域中得到了广泛的研究和应用。在实际应用中，控制 调节载体对于外来分子的渗透能力一直是人们研究的一个热点，因为 载体对外来分子的渗透能力关系到外来分子的装载以及释放，是非常 重要的。为了进一步改善载体的渗透性， 一种比较可行的方法就是设 计制备一种能对外界的刺激，例如温度，pH值和磁场，做出特殊响应 的载体。从而通过外界刺激的调节来控制载体对于外来分子的渗透能 力。
基于四氧化三铁纳米粒子的磁性，其功能微球材料在细胞分离， 固定化酶，磁靶向载药，磁共振成像等生物领域都有着广泛的应用。并且四氧化三铁纳米粒子被证明就有很好的生物相容性。聚N-异丙 基丙烯酰胺(PNIPAM)是一种具有温度响应性的聚合物，它在32°C 左右有一个最低临界溶解温度(LCST)。当温度小于32'C的时候， PNIPAM表现出亲水性；当温度大于32"C的时候，它表现出憎水性。 并且PNIPAM的LCST在较大范围内是可调节的，加入亲水性共聚单体 会升高LCST，反之加入憎水性共聚单体会降低LCST。 PNIPAM的这种 特殊的温敏性质使它在药物传递以及药物的可控释放领域都得到了 广泛的研究报道。
基于以上信息，设计制备一种兼具磁靶向和叶酸靶向，同时具有 温敏特性的具有空腔结构的纳米药物载体将会是对药物传递领域的 一次很好探索。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有磁性和叶酸双重 耙向的温敏纳米药物载体的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述制备方法获 得的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体。
本发明所要解决的再一技术问题在于提供一种上述温敏纳米药 物载体的用途。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是 一种具有磁性和
叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，包括下述步骤 第一步将四氧化三铁纳米粒子表面亲油改性；
第二步在四氧化三铁纳米粒子表面通过细乳液聚合方法包覆聚N-
异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，制成具空腔结构的复合种子微 球；第三步在复合种子微球表面通过沉淀聚合方法包覆N-异丙基丙烯 酰胺(NIPAM)和甲基丙烯酸脱水甘油酯(GMA)的共聚物， 制得纳米复合微球；
第四步将纳米复合微球表面带上氨基；
第五步将带氨基的纳米复合微球与叶酸结合，得到温敏纳米药物载 体。
本发明首先用经油酸等改性的四氧化三铁纳米粒子作为磁性材 料，通过改进的细乳液聚合方法得到内部具有空腔结构的，以四氧化 三铁纳米粒子为核，以PNIPAM为壳层的复合种子微球；再通过沉淀 聚合方法在种子微球外包覆NIPAM和GMA的共聚物，进一步以NIPAM 和GMA的共聚物为壳，得到表面带有环氧基团的复合微球；然后，微 球表面的环氧基团可以在常温下用过量的氨基试剂开环，得到表面带 有氨基的纳米复合微球；最后，用叶酸和复合微球表面的氨基反应， 叶酸分子上的羧基和氨基反应生成酰胺键，从而将叶酸分子接到微球 表面，最终得到具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体。
所述的四氧化三铁纳米粒子为超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子， 通过化学共沉淀法制得。
在上述方案的基础上，第一步中，采用超顺磁性的四氧化三铁纳 米粒子，亲油改性为将四氧化三铁纳米粒子表面通过亲油剂改性得到 磁流体，所述的亲油剂为油酸、油胺或三正辛基氧磷(T0P0)等。
在上述方案的基础上，第二步中，所述的复合种子微球中四氧化 三铁纳米粒子与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体的质量比为1: 5 15，获得的复合种子微球的粒径在80 120mn。
其中，四氧化三铁纳米粒子与N-异丙基丙烯酰胺单体的质量比 可以具体为l: 5， 6, 8， 10， 12， 13或15;粒径分布可以在80， 90,100， 110， 120nm。
复合种子微球的细乳液聚合制备方法具体可以为
将第一步四氧化三铁纳米粒子改性中获得的磁流体洗涤后，加入 溶剂乙酸丁酯和偶氮二异丁腈(AIBN)，分散均匀后，和十二垸基苯 磺酸钠(SDBS)溶液混合，超声形成稳定乳液；
再将N-异丙基丙烯酰胺单体(NIP颜)和N， N，-亚甲基双丙烯酰 胺(MBA)溶解，与所述稳定溶液混合，进行四氧化三铁纳米粒子与 NIPAM单体的聚合；
反应过程条件为先通氮气20 50分钟，再在反应温度70 80 'C下反应3 6小时。
具体的，通氮气的时间可以为20， 30， 40或50分钟；反应温度 可以为70， 72， 75， 78或8(TC，反应时间可以为3， 4， 5或6小时。
在上述方案的基础上，第三步中，所述的纳米复合微球的粒径在 180 220nm。具体的粒径分布可以在180， 190， 200， 210， 220nm。
通过沉淀聚合方法在种子微球外包覆N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM) 和甲基丙烯酸脱水甘油酯(GMA)的共聚物获得纳米复合微球的具体 可以为
在第二步中获得的复合种子微球分散液中加入N-异丙基丙烯酰 胺单体(NIPAM),甲基丙烯酸脱水甘油酯(GMA)， N，N，-亚甲基双丙 烯酰胺(MBA)交联剂，先通氮气20 50分钟，加入过硫酸钾引发剂， 再在反应温度70 8(TC下反应3 6小时。
通氮气的时间具体可以为20， 30， 40或50分钟；反应温度可以 为70， 72， 75， 78或8(TC，反应时间可以为3， 4， 5或6小时。
在上述方案的基础上，第四步中，使纳米复合微球表面带上氨基
的方法为纳米复合微球与氨基试剂反应，所述的氨基试剂为己二胺、乙二胺、丁二胺或巯基乙胺等。加入氨基试剂后常温下搅拌过夜，产 物用磁分离，并用水洗涤多次后待用。
在上述方案的基础上，第五步中，先将叶酸、l-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 在溶剂中混合，如二甲基亚砜(DMS0)中混合进行活化反应，再与带 氨基的纳米复合微球上的反应。
将叶酸与EDC. HC1和NHS混合搅拌活化0. 5 2小时， 一般情况 下，叶酸与EDC. HC1、 NHS的混合摩尔比为1: 1.5 2. 5: 1. 5 2. 5， 具体可以为l: 1.5， 1.8， 2， 2.2或2. 5: 1.5， 1.8， 2， 2.2或2. 5， 优选l: 2: 2。事先对叶酸进行活化更有利于之后叶酸分子上的羧基
与纳米复合微球上的氨基反应生成酰胺键，从而将叶酸分子接到微球表面。
针对上述的制备方法获得的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳 米药物载体，所述的温敏纳米药物载体具有空腔结构，以四氧化三铁
为核，以聚N-异丙基丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸 脱水甘油酯的共聚物为壳，表面修饰有叶酸靶向分子，粒径在180 220nm。具体的粒径分布可以在180， 190， 200， 210， 220nm。这种 纳米药物载体具有较快的磁响应速度，在一定温度下会发生体积相转 变，并且在水中可以稳定分散。
在上述方案的基础上，温敏纳米药物载体的磁饱和强度范围为 5emu/g 40emu/g;相转变温度为32 42°C 。
具体的，温敏纳米药物载体的磁饱和强度范围可以为5， 10， 15， 20， 25， 30， 35或40emu/g;相转变温度可以为32， 35， 38， 40或 42°C。
针对上述的温敏纳米药物载体的用途，用于装载抗癌药物阿霉素。温敏纳米药物载体可以在水溶液中通过氢键作用或者物理吸附作 用，装载阿霉素药物分子，其包封率以及载药率可以方便地用pH值
加以控制。阿霉素的释放过程可以通过调节环境的温度和pH值加以 控制，在高温和低pH值条件下展现出较快的释放速度。通过将载有 药物的上述纳米药物载体和带有叶酸受体的癌细胞一起培养进行细 胞实验，纳米药物载体体现出了很好的靶向特性。
在上述方案的基础上，所述抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分 比为3 60%。具体的，载药率可以为3， 5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40, 45， 50， 55或60%。
本发明的优异效果是-
本发明制备工艺清晰全面，得到的纳米药物载体具有磁靶向性， 叶酸耙向性，温度敏感性以及空腔结构等多种功能。载体的磁靶向性 使得载体能在磁场的控制下在特定的部位聚集；叶酸靶向性使得载体 对癌细胞具有特异的目标识别功能；载体的温度敏感性可以用来实现 所装载的药物的可控释放，能通过温度刺激对于药物分子的释放加以 控制；而载体的空腔结构则使载体能够装载更多的药物分子从而提高 药物传递的效率和降低副作用；本发明在细胞实验中表现出了很好的 应用效果，是一种较为理想的药物载体。
以上设计思路基本覆盖了药物传递领域所关心的一些基本问题， 因此产品具有较好的全面性。
具体实施方法
一下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施实例不限 制本文的保护范围。
一种具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，包括下述步骤
第一步将四氧化三铁纳米粒子表面亲油改性-
将一定量的氯化铁和氯化亚铁(摩尔比2: 1)溶解在水中，通 氮气半小时，升温到60°C，加入适量的氢氧化钠溶液，制成四氧化 三铁纳米粒子；
然后缓慢的向反应体系中滴加适量油酸，所得到的反应体系稳定 IO分钟之后，加热到9(TC反应半个小时，反应自然冷却到常温后，
用lmol/L的盐酸溶液调节反应体系pH到4。然后用磁铁吸引分离， 产物用水洗涤5次，接着再分别用无水乙醇和丙酮各洗涤三次，最终 得到的产物用环己垸分散保存，得到稳定的磁流体。 第二步在四氧化三铁纳米粒子表面包覆聚N-异丙基丙烯酰胺，制 成具空腔结构的复合种子微球-
四氧化三铁纳米粒子和NIPAM单体投料质量比为1: 10。
将0.625g磁流体(固含量5.6%)经丙酮和无水乙醇洗涤后，加 入0.5g溶剂乙酸丁酯和10mg AIBN，分散均匀后，和SDBS溶液 (75mg/30ml)混合，超声形成稳定乳液；
取0. 35g NIPAM， 0. 047g MBA溶解在30ml水中，和上述乳液混 合均匀，放入100ml四颈瓶，通氮30min后，在76。C下反应4小时 停止，产物复合种子微球用水洗涤后再次分散保存。 第三步在Fe3OJPNIPAM复合种子微球表面包覆N-异丙基丙烯酰胺 和甲基丙烯酸脱水甘油酯的共聚物，制得纳米复合微球
将25g复合种子微球分散液中加入0.064g NIPAM， 0.02 GMA， 0. Olg MBA，通氮30min后，加入4mg过硫酸钾引发剂，在76。C下反 应4个小时，产物用磁分离，用水洗涤后待用。 第四步使纳米复合微球表面带上氨基制备好的Fe3OJPNIPAM-co-PGMA纳米复合微球分散液中，加入过 量的己二胺常温下搅拌过夜，产物用磁分离，并用水洗涤多次后待用； 第五步将带氨基的纳米复合微球与叶酸结合，得到温敏纳米药物载 体
摩尔比为1: 2: 2的叶酸，NHS， EDC溶于一定量的二甲基亚砜 (DMS0)中，搅拌活化l小时，然后将上述溶液加入到事先准备好的 微球分散液中，加入三乙胺催化剂，避光反应过夜，产物用磁分离， 用水洗涤后，并透析除去未反应的分子。 应用例
取实施例中制得的温敏纳米药物载体5mg，加入5mg的阿霉素， 配成10ml的溶液，将溶液调节到一定pH5 10后，常温下搅拌过夜， 产物用离心分离，冷冻干燥，制成装载有抗癌阿霉素的温敏纳米药物 载体，抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分比为5 50%。
权利要求
1、一种具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括下述步骤第一步将四氧化三铁纳米粒子表面亲油改性；第二步在四氧化三铁纳米粒子表面包覆聚N-异丙基丙烯酰胺，制成具空腔结构的复合种子微球；第三步在复合种子微球表面包覆N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸脱水甘油酯的共聚物，制得纳米复合微球；第四步使纳米复合微球表面带上氨基；第五步将带氨基的纳米复合微球与叶酸结合，得到温敏纳米药物载体。
2、 根据权利要求1所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物 载体的制备方法，其特征在于第一步中，采用超顺磁性的四氧化三 铁纳米粒子，亲油改性为将四氧化三铁纳米粒子表面通过亲油剂改 性，所述的亲油剂为油酸、油胺、三正辛基氧磷中的一种。
3、 根据权利要求1所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物 载体的制备方法，其特征在于第二步中，所述的复合种子微球中四 氧化三铁纳米粒子与N-异丙基丙烯酰胺单体的质量比为1: 5 15，粒径在80 120nm。
4、 根据权利要求1或3所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米 药物载体的制备方法，其特征在于第二步中，复合种子微球的制备 方法为将第一步四氧化三铁纳米粒子改性中获得的磁流体洗涤后，加入 溶剂和偶氮二异丁腈，分散均匀后，和十二烷基苯磺酸钠溶液混合， 超声形成稳定乳液；再将N-异丙基丙烯酰胺单体和N, N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解， 与所述稳定溶液混合，进行四氧化三铁纳米粒子与N-异丙基丙烯酰 胺单体的聚合；反应过程条件为先通氮气20 50分钟，再在反应温度70 80 'C下反应3 6小时。
5、 根据权利要求1所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物 载体的制备方法，其特征在于第三步中，所述的纳米复合微球的粒 径在180 220nm。
6、 根据权利要求1所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物 载体的制备方法，其特征在于第四步中，使得纳米复合微球表面带上氨基的方法为纳米复合微球与氨基试剂反应，所述的氨基试剂为己二胺、乙二胺、丁二胺、巯基乙胺中的一种。
7、 根据权利要求1所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物 载体的制备方法，其特征在于第五步中，先将叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺在溶剂中混合进行活化反应，再与带氨基的纳米复合微球反应。
8、 针对权利要求1 7之一所述的制备方法获得的具有磁性和叶酸双 重耙向的温敏纳米药物载体，以四氧化三铁为核，以N-异丙基丙烯 酰胺与甲基丙烯酸脱水甘油酯的共聚物为壳的空腔结构，表面修饰有 叶酸靶向分子，粒径在180 220nm。
9、 根据权利要求8所述的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物 载体，其特征在于温敏纳米药物载体的磁饱和强度范围为5emu/g 40emu/g;相转变温度为32 42°C 。
10、 针对权利要求8或9所述的温敏纳米药物载体的用途，用于装载 抗癌药物阿霉素，抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分比为3 60%。
全文摘要
本发明涉及一种具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，包括下述步骤将四氧化三铁纳米粒子表面亲油改性；在四氧化三铁纳米粒子表面包覆聚N-异丙基丙烯酰胺，制成具空腔结构的复合种子微球；在复合种子微球表面包覆N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸脱水甘油酯的共聚物，制得纳米复合微球；使纳米复合微球表面带上氨基；将带氨基的纳米复合微球与叶酸结合，得到温敏纳米药物载体。产品相转变温度为32～42℃，用于装载抗癌药物阿霉素。优点是制备工艺清晰全面，得到的纳米药物载体具有磁靶向性，叶酸靶向性，温度敏感性以及空腔结构等多种功能，并且在细胞实验中表现出了很好的应用效果，是一种较为理想的药物载体。
文档编号A61K47/34GK101411877SQ20081020278
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者汪长春, 陈立波 申请人:复旦大学