专利名称：：鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法及其疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及疫苗
技术领域：
，具体涉及鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法及其疫苗。
背景技术：
：鲟鱼为软骨硬鳞鱼，具有很高的经济价值，有"黑色黄金"之称。随着其野生资源的减少，人工增养殖相继出现，与之相关的商品规模化养殖相继开展。由于鲟鱼骨板坚硬，鳃部分裸露，在人工环境下进行高密度养殖，相互磨伤而容易受到感染，病害也逐渐增加，但有关其病害病原的分离、鉴定以及防治的研究资料极少。因此，疾病防治的研究是当务之急，这是保证鲟鱼养殖持续、稳定发展的关键之一。鲟鱼细菌性疾病的发生目前已成为鲟鱼养殖业的瓶颈，鲟鱼的细菌性疾病主要有细菌性肠炎、细菌性败血症和细菌性出血病(肿嘴病)，病原主要是气单胞菌，具有极强的传染性，患病鲟鱼死亡率高，给生产造成了很大的损失。在鲟鱼疾病防治时多采用药物防治，但药物防治容易污染水质，造成药物残留现象，药量过大还会对鲟鱼的生长产生负面影响。此外，大多数药物的长期使用还造成了病原性细菌耐药性的产生，最终给疾病的防治造成了困难。近年来，免疫防治在水产病害防治中的应用已日益广泛。利用疫苗等，活化或加强动物自身的特异性免疫和非特异性免疫功能，提高抗病能力，被公认为是目前防治病害最为有效的方法之一。国内外已应用的渔用疫苗有20余种。水产病害的疫苗防治是今后的发展方向，疫苗防治既可克服治疗困难影响疗效的弊病，又可避免药物残留现象。目前关于鲟鱼细菌病的疫苗防治尚未见报道，我国对鲟鱼病的预防治疗主要还是依靠药物手段，因此开发病原菌疫苗将是鲟鱼细菌病有效的防治方法之一。
发明内容本发明所要解决的技术问题提供了一种鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法。为此，本发明公开了一种鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法，包括下列步骤a)培养和收集以嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)为出发菌株，扩大培养，收集；b)灭活福尔马林对嗜水气单胞菌菌株灭活，获得灭活疫苗；c)无活菌检验将步骤b制备的灭活疫苗进行细菌培养，结果为无菌生长，即可判定灭活菌液合格；d)安全性检测将步骤C判定合格的灭活疫苗接种于鲟鱼，设实验组和对照组，饲养观察15d，如发现实验组鱼患细菌性败血征，而对照组鱼为阴性，则该批灭活疫苗为不合格产品，反之则该批灭活疫苗合格；e)效力检验将步骤d判定合格的灭活疫苗接种于鲟鱼，设实验组和对照组，饲养30d，在用嗜水气单胞菌活菌液接种攻毒，饲养观察15d，记录各组的死亡鱼数，计算免疫保护率，免疫保护率在65%以上的灭活疫苗为合格品；f)分装与保存；g)留样待检。在一些实施方式里，所述嗜水气单胞菌菌株可为XI(登录号EU669667)或嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号X74676.1)。在一些实施方式里，所述灭活步骤中，福尔马林的重量百分比浓度为0.1%0.8%，处理条件为4°C3°C，312h;其中优选O.1%福尔马林，3°C，3h。在一些实施方式里，所述无活菌检验为在无菌条件下，取10ml灭活疫苗，用生理盐水将待检疫苗稀释10倍，吸取0.2ml分别接种到肉汤蛋白胨液体培养基、厌气肉肝汤培养基上各一管，在3t:条件下培养48h，均应无菌生长。如有菌体生长，则为灭活不彻底，为不合格产品；在一些实施方式里，所述安全性检测步骤中，灭活疫苗接种量5.OX108CFU;在一些实施方式里，所述效力检验中，灭活疫苗接种量3.0X1()8CFU，活菌液接种量3.0X108CFU;在一些实施方式里，所述保存条件为4t:环境下冷藏备用，有效期为90d。在一些实施方式里，本发明所述鲟鱼细菌性疾病可为鲟鱼细菌性肠炎、鲟鱼细菌性败血症或鲟鱼细菌性出血病，最优为鲟鱼细菌性败血症。另一方面，本发明还公开了上面任一项所述制备方法所制备的鲟鱼细菌性疾病全菌灭活疫苗。本发明首次公开了鲟鱼细菌性疾病全菌灭活疫苗的制备方法，所制得疫苗安全有效，为鲟鱼细菌性病害的有效防治提供可靠的基础。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。实施例1:1.致病菌的分离与鉴定1.1致病菌的分离选取具有典型自然发病症状的濒死西伯利亚鲟，用75%的酒精棉反复擦拭病鱼体表后，无菌操作取病鱼的肝、肾等病灶组织以及少量腹水，分别于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基平板上划线分离，于2『C下培养24h后，挑取优势单菌落划线纯化，并接种于TSA培养基斜面上，于4t:冰箱保存。1.2致病菌的人工回归感染试验用无菌生理盐水分别刮下斜面保藏的各分离菌株的菌苔，并将其菌悬液浓度稀释为2.2Xl(fcfu/mL，然后分别对健康的西伯利亚鲟进行胸鳍基部注射感染，每尾注射剂量为0.2mL。以注射等量无菌生理盐水的健康西伯利亚鲟作为对照。每注射组实验鱼各8尾，水温为19°C22°C。连续7d观察并记录实验鱼的病症及死亡数目，同时对人工回归感染发病濒死的实验鱼进行病原菌再分离，观察再分离的菌株与原分离菌株在形态与理化特性等方面是否一致。1.3致病菌株毒力测定将分离的致病菌株菌悬液分别稀释成2.2X104cfu/mL、2.2X105cfu/mL、2.2X106cfu/mL、2.2X107cfu/mL，然后分别对健康的西伯利亚鲟进行胸鳍基部注射感染，每尾注射剂量为0.2mL。以注射等量无菌生理盐水的健康的西伯利亚鲟作为对照。每注射组实验鱼各8尾，水温为19°C22°C。连续7d观察并记录实验鱼的死亡数目，并用概率单位图解法计算半数致死浓度(LC5。)。1.4病原菌的鉴定方法将分离的致病菌株接种在兔血琼脂平板上，于2『C下培养24h，观察有无溶血圈产生；同时将新鲜培养的致病菌株进行革兰氏染色，并用透射电镜对其形态进行观察。此外，用ATB细菌鉴定仪对分离的致病菌株进行生理生化鉴定，并测定其16SrDNA序列，在NCBI中利用BLASTN软件与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中已知的16SrDNA序列进行同源性比较，选取同源性较高的序列并利用BioEdit7.0和Mega4.0软件进行多重比较后构建系统发育树。2.致病菌的分离与结果2.1致病菌的分离从自然发病的西伯利亚鲟体内分离到4株优势菌株，分别暂命名为XI、X2、X3、X4，经过人工回归感染试验，仅菌株XI对西伯利亚鲟具有致病性，人工注射感染西伯利亚鲟后7天，西伯利亚鲟的死亡率高达100%(表l)，实验病鱼也表现出肛门红肿，腹部充满血水，肠道充血、出血等病症，而且从人工回归感染濒死的病鱼体内又可分离到与菌株X1形态特征及理化特性一致的菌株。根据建立的实验鱼死亡率(％)与菌液浓度对数(log(rfu/mU)的关系曲线y=36.25x-158.58，菌株X1对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC5。)为5.62X105cfu/mL，根据Devesa对鱼类致病菌毒力的划分标准，可判定菌株XI对西伯利亚鲟具有较强的毒力。表1人工回归感染结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.2病原菌的鉴定结果菌株X1为革兰氏阴性杆菌，大小约为1.0iim1.2iimX2.1iim2.4iim，周生侧鞭毛，在兔血琼脂平板上可产生明显的P-溶血圈。ATB细菌鉴定仪对菌株X1的生理生化鉴定结果表明(表2)，菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，鉴定结果的可信度为99%。通过NCBI网站搜索与菌株X1的16SrDNA序列同源性高的各种菌的16SrDNA序列，结果表明(表3)，菌株X1的16SrDNA序列与GenBank基因库中细菌菌株的同源性比较最为接近的菌株均为气单胞菌属(Aeromonas)，构建的系统发育树结果进一步表明，菌株X1(登录号EU669667)与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号X74676.1)的亲缘关系最近，其同源性为99%。综合形态与生理生化特性鉴定以及16SrDNA序列分析结果，菌株X1可鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)。表2ATB细菌鉴定仪对菌株XI的鉴定结果测定项目结果测定项目结果测定项目结果氧化酶OX+柠檬酸盐CIT一蔗糖SAC+D-葡萄糖+组氨酸HIS+麦芽糖MAL+水杨素SAL+2-酮葡萄糖酸盐2KG—衣康酸ITA一D-蜜二糖—3-羟基-丁酸盐30BU_辛二酸盐—L-岩藻糖一5-酮基-葡萄糖酸盐_丙二酸盐—D-山梨醇一3-羟基-苯甲酸盐—乙酸盐ACE一L-阿拉伯糖+鼠李糖RHA+DL-乳酸盐+丙酸盐PROP_N-乙酰葡萄糖胺+L-丙氨酸+癸酸盐CAP—L-脯氨酸PRO+糖原GLYG+戊酸盐+肌醇INO—甘露醇MAN+L-丝氨酸SER+注"+"表示阳性，"_"表示阴性Note:"+，，denotespositivity，"_，，denotesnegativity表3菌株XI的16SrDNA序列同基因库中细菌菌株同源性的比较6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:致病菌株全菌灭活疫苗制备——灭活条件的研究不同浓度福尔马林在不同温度下对菌株X1的灭活效果结果表明(表4)，在4。C和3(TC条件下，0.1%福尔马林在3h即可灭活菌株XI的菌细胞。表4不同浓度福尔马林在不同温度下对菌株XI的灭活效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"_"表示无菌生长；"+"表示有菌生长，下同实施例3:无活菌检验在无菌条件下，取10ml灭活后的疫苗，用生理盐水将待检疫苗稀释IO倍，吸取0.2ml分别接种到肉汤蛋白胨液体培养基、厌气肉肝汤培养基上各一管，在37t:条件下培养48h，均应无菌生长。如有菌体生长，则为灭活不彻底，为不合格产品。实施例4:安全性检测4.1试验容器4.1.1选用容积为(12)m3的水泥池或水簇箱等容器。容器需配有控温和通气增氧装置。4.1.2容器在使用前用万分之一的漂白粉水溶液消毒24h，消毒后用自来水冲洗干净，并放入适量经活性碳处理的自来水曝气24h后待用。4.2试验鱼种选用体重为100g左右，体质健壮，游动活泼，无任何损伤和疾病的鲟鱼，在试验前用2%的食盐水浸浴(510)min，将鱼种放入符合5.l条规定的容器中，于(2830)t:水温下饲养，观察15d，所有鱼均应活动正常。如发现有鱼种出现有细菌性败血征症状，则该批鱼种不得使用。4.3安全性试验取符合5.2条规定的鲟鱼60尾，设实验组和对照组，各30尾鱼。将疫苗用无菌注射器对实验组鱼种作胸腔注射，注射剂量为0.5ml/尾(疫苗浓度1.OX109CFU/ml)。对照组注射等量生理盐水。将鱼种在(2528)t:水体中饲养，观察15d，如发现实验组鱼患细菌性败血征，而对照组鱼为阴性，则该批疫苗为不合格产品。实施例5:效力检验5.1鱼种免疫5.1.1按5.1条规定准备试验容器，按4.2条规定选择试验鱼种。5.1.2将符合安全试验的待检样品用无菌生理盐水稀释成含菌量为1.OX109CFU/ml，用无菌注射器对鱼种进行免疫注射，每尾腹腔注射剂量为0.3ml，试验鱼种不少于30尾。第三天再用同剂量疫苗强化免疫，注射后的鱼种在(2528)t:的水温下饲养30d，该批鱼种即为免疫鱼种。5.2免疫鱼攻毒在无菌条件下将试管斜面嗜水气单胞菌苔刮下制成菌悬浮液，含菌量为1.0X108CFU/ml。以0.3mL/尾的剂量，分别注射经免疫的试验组鱼种和未经免疫的对照组鱼种(试验组和对照组的鱼种数量相同，每组数量不少于30尾)。攻毒后的鱼种在(2528)°C的水体中观察15d，记录各组的死亡鱼数，计算死亡率。5.3免疫保护率的计算根据5.2条的试验结果，计算其免疫保护率。注免疫保护率在65%以上的制品为合格品实施例6:产品分装与保存将灭活、安全性和效力检测合格的疫苗在无菌条件下，分装于50ml或100ml经消毒处理的玻璃瓶或塑料瓶中，加贴标签，包装产品。产品包装按GB6388的要求执行。疫苗产品置于4t:环境下冷藏备用，有效期为90d。在疫苗保存期间，应不定期进行无活菌检验，以保障疫苗的安全性。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。权利要求一种鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法，包括下列步骤a)培养和收集以嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)菌株(编号BYKAH-X1或简称为X1)为原始菌种，扩大培养，收集；b)灭活福尔马林对嗜水气单胞菌菌株X1灭活，获得灭活疫苗；c)无活菌检验将步骤b制备的灭活疫苗进行细菌培养，结果为无菌生长，即可判定灭活菌液合格；d)安全性检测将步骤c判定合格的灭活疫苗接种于鲟鱼，设实验组和对照组，饲养观察15d，如发现实验组鱼患细菌性败血征，而对照组鱼为阴性，则该批灭活疫苗为不合格产品，反之则该批灭活疫苗合格；e)效力检验将步骤d判定合格的灭活疫苗接种于鲟鱼，设实验组和对照组，饲养30d，在用嗜水气单胞菌菌株X1活菌液接种攻毒，饲养观察15d，记录各组的死亡鱼数，计算免疫保护率，免疫保护率在65％以上的灭活疫苗为合格品；f)分装与保存；g)留样待检。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述嗜水气单胞菌菌株可为上海海洋大学国家水生动植物病原库编号为XI的嗜水气单胞菌或编号为ATCC35654的嗜水气单胞菌。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在所述灭活步骤中，处理条件为重量百分比浓度为0.1%0.8%福尔马林，4"3°C，312h。4.如权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述灭活步骤中，处理条件为O.1%福尔马林，3。C，3h。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述无活菌检验为在无菌条件下，取10ml灭活疫苗，用生理盐水将待检疫苗稀释10倍，吸取0.2ml分别接种到肉汤蛋白胨液体培养基、厌气肉肝汤培养基上各一管，在3t:条件下培养48h，均应无菌生长。如有菌体生长，则为灭活不彻底，为不合格产品。6如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述安全性检测步骤中，灭活疫苗接种量5.0X108CFU。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述效力检验中，灭活疫苗接种量3.0X108CFU，活菌液接种量3.0X108CFU。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述保存条件为4t:环境下冷藏备用，有效期为90d。19.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述鲟鱼细菌性疾病可为鲟鱼细菌性肠炎、鲟鱼细菌性败血症或鲟鱼细菌性出血病。10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述鲟鱼细菌性疾病为鲟鱼细菌性败血症。11.如权利要求i-io任一项所述制备方法所制备的鲟鱼细菌性疾病全菌灭活疫苗。全文摘要本发明涉及疫苗
技术领域：
，具体涉及鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法。本发明公开了一种鲟鱼细菌性败血综合征全菌灭活疫苗的制备方法，包括下列步骤嗜水气单胞菌培养和收集；灭活；无活菌检验；安全性检测；效力检验；分装与保存；留样待检。本发明首次公开了鲟鱼细菌性疾病全菌灭活疫苗的制备方法，所制得疫苗安全有效，为鲟鱼细菌性病害的有效防治提供可靠的基础。文档编号A61P31/04GK101732702SQ20081020281公开日2010年6月16日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者姜有声,曹海鹏,李圆圆,杨先乐,邱军强申请人:上海海洋大学