专利名称：他汀类物质在制备脂肪肝防治药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药学领域，具体地说，本发明涉及他汀类药物以孤儿核受体Nur77为 靶点的调节作用。
背景技术：
脂肪肝(Fatty Liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪沉积过多的病变。 正常肝内脂肪占肝重3-4% ，如果脂肪含量超过肝重的5 %即为脂肪肝，严重者脂肪量可达 40-50%。肝内脂质过度沉积会影响正常的肝功能，部分患者最终导致发展为脂肪性肝炎， 甚至脂肪性肝硬化。脂肪性肝病正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大 肝病，已被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。 到目前为止，尚无防治脂肪肝的有效药物。 一般常选用保护肝细胞、去脂药物及抗 氧化剂等，如维生素B、 C、 E、卵磷脂、熊去氧胆酸、水飞蓟素、肌苷、辅酶A、还原型谷胱甘肽、 牛磺酸、肝泰乐，以及某些降脂药物(例如肝旨清)等等。上述药物对脂肪肝的治疗作用 分子机制不明，大多仍需要进一步验证其疗效以及安全性。 他汀类药物具有降低血脂的功能，被广泛地应用于治疗心血管系统疾病(LaRosa JC， He J， Vupputuri S. Effect of statins on risk of coronary disease. JAMA 1999 ; 282 :2340-6)，并且已经发现他汀类药物除了具有降低血脂功能外，还具有抗炎、降压等 多向性效应。现已有5种他汀类药物可供临床选用(l)洛伐他汀(lovastatin)，常见 药物有美降之、罗华宁、洛特、洛之特等，血脂康的主要成分也是洛伐他汀。(2)辛伐他汀 (simvastatin)，常见药物为舒降之、理舒达、京必舒新、泽之浩、苏之、辛可等。(3)普伐他 汀(pravastatin)，常用药有普拉固、美百乐镇。(4)氟伐他汀(f luvastatin)，常见药有来 适可。(5)阿托伐他汀(atorvastatin)，常见药为立普妥、阿乐。普伐他汀(pravastatin) 为3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-C0A还原酶)的竞争性抑制剂，HMG-C0A还 原酶是胆固醇生物合成初期阶段的限速酶。可逆性地抑制HMG-C0A还原酶，从而抑制胆固 醇的生物合成。主要从二方面发挥其降脂作用，第一是通过可逆性抑HMG-COA还原酶的活 性使细胞内胆固醇的量有一定程度的降低，导致细胞表面低密度脂蛋白(LDL)受体数的增 加，从而加强了由受体介导的LDL-C的分解代谢及血液中LDL-C的清除，第二，是通过抑制 LDL-C的前体一极低密度脂蛋白(VLDL-C)在肝脏中的合成从而抑制LDL-C的生成。
尽管目前已知他汀类药物的一些用途，然而本领域还有必要研究这些药物是否还 有其它的作用机制以及其它方面的药用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供他汀类物质的新用途，用于上调细胞中孤儿受体Nur77的 表达。 在本发明的第一方面，提供一种他汀类物质的用途，用于制备上调细胞中孤儿受 体Nur77的表达的组合物。
在另 一 优选例中，所述的他汀类物质选自普伐他汀(Pravastatin)或其 药学上可接受的盐，辛伐他汀(Simvastatin)或其药学上可接受的盐，阿托伐他汀 (Atorvastatin)或其药学上可接受的盐，或它们的组合。 在另一优选例中，所述的他汀类物质是普伐他汀或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制细胞中脂质沉淀。
在另一优选例中，所述的组合物还用于减缓细胞的脂肪变。
在另一优选例中，所述的组合物还用于防治脂肪肝。
在另一优选例中，所述的细胞是肝细胞。 在本发明的第二方面，提供一种制备上调细胞中孤儿受体Nur77的表达的组合物
的方法，所述方法包括将有效量的他汀类物质与药学上可接受的载体混合。
在另一优选例中，所述的他汀类物质选自普伐他汀或其药学上可接受的盐，辛伐
他汀或其药学上可接受的盐，阿托伐他汀或其药学上可接受的盐，或它们的组合。 在本发明的第三方面，提供一种非治疗性地上调细胞中孤儿受体Nur77表达的方
法，所述方法包括给予需要上调的对象有效量的他汀类物质。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1是随着油酸浓度的升高诱导肝H印G2细胞脂质沉积作用逐渐增强的显微细胞 图，其中红色越多表示脂质越多。 图2是普伐他汀抑制肝H印G2细胞中脂质沉积作用的显微细胞图，其中红色越多 表示脂质越多。 图3A是Western Blot检测法测定普伐他汀诱导肝H印G2细胞中孤儿核受体 Nur77表达的电泳结果。 图3B是Western Blot检测法测定他汀类药物诱导肝H印G2细胞中孤儿核受体 Nur77表达的电泳结果。 图4是转染GFP-Nur77的肝H印G2细胞显示出脂质沉积减少的显微细胞图。其中， 箭头所指为绿色荧光蛋白表达。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现他汀类物质具有上调细胞内孤儿受 体Nur77表达水平的作用。因此，他汀类物质可用于制备细胞内孤儿受体Nur77低表达或 不表达所导致的疾病；或用于通过调节孤儿受体Nur77表达来发挥调节细胞增殖、分化发 育和凋亡的作用，或调节细胞内脂质代谢和能量代谢。 他汀类物质 本文所用的术语"他汀类物质"指一类3-羟基3_甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMG-COA还原酶)抑制剂的总称。所述的"他汀类物质"具有接近的化学结构式。所述的 "他汀类物质"包括普伐他汀(Pravastatin)，辛伐他汀(Simvastatin)，阿托伐他汀，洛伐 他汀，美伐他汀等。
本发明还包括上述化合物的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前 体，只要它们也具有调节孤儿受体Nur77表达等作用。所述的"药学上可接受的盐"是指 一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限 于)(l)与如下无机酸形成的盐如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐， 如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金 属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的"前体药物"的形式。化 合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映 异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
本文所用的术语"异构体"包括几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反 异构体，构象异构体)。 所述的"化合物的前体"指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进
行代谢或化学反应而转变成一种他汀类化合物，或他汀类化合物的盐或溶液。
作为本发明的一种优选方式，所述的他汀类物质选自普伐他汀(I)或其药学上
可接受的盐，辛伐他汀(II)或其药学上可接受的盐，阿托伐他汀(III)或其药学上可接受
的盐，或它们的组合。更优选地，所述的他汀类物质选自普伐他汀(I)或其药学上可接
受的盐，辛伐他汀(II)或其药学上可接受的盐，这两种他汀类物质具有非常接近的化学结
构。
<formula>formula see original document page 5</formula> 作为本发明的一种更优选的方式，所述的他汀类物质是普伐他汀或其药学上可接 受的盐；本发明人意外地发现，普伐他汀或其药学上可接受的盐具有比其它他汀类物质具 有更优异的上调孤儿受体Nur77表达的效果。 本领域人员应理解，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发 明的他汀类物质或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体，比如化学合成 或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。此外，所述的他汀 类物质也可通过商购的途径获得。
合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合 物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R. Larock， Comprehensive OrganicTransformations, VCH Publishers(1989) ;T.W.Greene and P.G.M. Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Ed. ， John Wiley and Sons(1999); L Fieser and M. Fieser， Fieser and Fieser' s Reagents for Organic Synthesis, JohnWiley and Sons(1994); 禾口 L Paquette， ed. ， Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis， John Wiley and Sons (1995)中者瞎公开。
用途 基于本发明人的新发现，本发明提供了他汀类物质或其异构体、外消旋体、药学上 可接受的盐、水合物或前体的用途，用于制备上调细胞中孤儿受体Nur77的表达的组合物； 或用于制备通过上调细胞中孤儿受体Nur77的表达来抑制细胞中脂质沉淀的组合物；或用 于制备通过上调细胞中孤儿受体Nur77的表达来减缓细胞的脂肪变的组合物；或用于制备 通过上调细胞中孤儿受体Nur77的表达来防治脂肪肝的组合物。 孤儿受体Nur77又称为TR3或NGFI-B，是核受体超家族的重要成员，它也是一种 立刻早期基因，其表达可以被血清、生长因子、十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)以及钙信号 迅速诱导(Zhang XK. et. al. ， Expert 0pin Ther Tar 2007 ;11 :69_79 ;Moll UM， et. al.， Oncogene 2006;25:4725-43)。它参与调节多种重要不同的生物学功能，涉及细胞增殖、 分化发育和凋亡过程。有研究提示Nur77调控了骨骼肌细胞中脂质和能量代谢所涉及 的关键基因，如AMP-激活蛋白激酶Y3(AMPKY3)，解偶联蛋白(UCP) 3， CD36，脂质素受 体2(adiponectinrec印tor 2)，葡萄糖转运体4 (GLUT4)，以及小窝蛋白3 (caveolin-3) (M. A. Maxwell, M. E. Cleasby， Nur77 regulates lipolysis in skeletal muscle cells. Evidencefor cross—talk between the beta-adrenergic and an orphan nuclear hormonerec印tor pathway, J. Biol. Chem. 2005 ;280 :12573-12584)。已经发现Nur77在棕 色和白色脂肪组织上有表达。众所周知，这两种脂肪组织在能量代谢平衡上起着不同作用， 前者在小型哺乳类动物主司非战栗性产热，因此只有少数基因会同时表达。该实验用低温 暴露的方法诱导小鼠Nur77表达，发现其可以抑制UCP1增强子的转录激活(Kanz 1 eiter T， Schneider T， Walter I， Bolze F等，Evidence for Nr4al as a cold-induced effector of brown fat thermogenesis. PhysiolGenomics 2005 ;24 :37-44) 。 2006年Bonta又有
报导NR4A亚家族成员在人类动脉粥样硬化斑块处的巨噬细胞上有表达；并发现高表达
NR4A因子的THP-1和U937细胞比敲除了 Nur77或NOR-1的细胞明显减少了氧化脂质颗 粒的摄取，与脂质摄入相关的基因SR(清道夫受体)-A、 CD36和CDllb mRNA的表达也降 低了约2倍(Bonta PI， van Tiel CM， Vos M， et al. Nuclear rec印tors Nur77， Nurrl， and N0R—1 expressed in atherosclerotic lesion macrophages reduce lipidloading and inflammatory responses. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006 Oct ;26(10): 2288-94)。 基于所述的他汀类物质可以上调Nur77的表达，它们对于任何Nur77表达过低或 不表达导致的失调、紊乱及相关疾病都是有用的。包括但不限于通过调节孤儿受体Nur77 表达来发挥调节细胞增殖、分化发育和凋亡的作用，或调节细胞内脂质代谢和能量代谢。例 如，所述的他汀类物质可用于癌症的防治。
本发明人首次发现他汀类物质可以诱导细胞内Nur77的高表达，并通过Nur77的 介导减少细胞中脂质沉积的量。并且，还发现他汀类物质可以用于治疗脂肪肝。他汀类物 质通过调控孤儿核受体Nur77的表达从而抑制肝细胞的脂质沉积并减缓细胞的脂肪变。他 汀类物质对肝细胞的脂质沉积的抑制与对调控孤儿核受体Nur77的高表达密切相关。从而 为他汀类物质开发出了一个新的应用领域，扩展了其商业开发前景，并进一步为其参与治 疗脂肪肝提供了 一个分子靶点。
组合物 如本文所用，术语"本发明的组合物"通常是药物组合物，其含有他汀类物质或其 异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体作为上调细胞孤儿受体Nur77表达的 活性成分；以及药学上可接受的载体或赋形剂。所述的组合物也可以是一种食物组合物。
本发明中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。 因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"中。 本发明中，"药学上可接受的"成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应 (如毒性、剌激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。 本发明中，"药学上可接受的载体"是用于将本发明的他汀类物质或其异构体、外 消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶 剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括 (但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。 本发明还提供了制备上调细胞中孤儿受体Nur77的表达的组合物的方法，所述方 法包括将有效量的他汀类物质与药学上可接受的载体混合。活性成分在组合物中的重量 比例例如可以是0. 0001-50wt% ;较佳地可以是0. 001-20wt%。 本发明所述的组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到 达哺乳动物体内(如肝组织上)的剂型都是可以的。所述的剂型例如可选自溶液、悬浮 液、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆。当所述化合物或其组合物用于上述用途时，它们与一种 或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给 药片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0. 05_5%悬浮剂)、糖浆(含有如 约10-50%糖)、和酏剂(含有约20-50%乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在 等渗介质中含有约0. 05-5%悬浮剂)进行非肠胃给药。 所用的活性成分的有效施用剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾 病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的他汀类物质每天以约0. 01-1000mg/kg动物 体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以l-3次分开的剂量给予，或以 缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为l-6000mg，较佳地约为 10-1000mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每 天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点在于 (1)本发明人首次发现他汀类物质可以诱导Nur77的表达，并且可以减少细胞中
脂质沉积的量，为他汀类物质提供了一个新的应用途径，增强了其商业价值。 (2)基于本发明的新发现，他汀类物质可用于防治细胞内孤儿受体Nur77低表达
或不表达所导致的疾病；或用于通过调节孤儿受体Nur77表达来发挥调节细胞增殖、分化发育和凋亡的作用，或调节细胞内脂质代谢和能量代谢。 (2)本发明提供的孤儿核受体Nur77可以用于指导筛选其他药物及中草药的活性 成分，通过模拟他汀类物质和孤儿核受体Nur77的作用，从而指导筛选其他药物及中草药， 从中获得具有治疗脂肪肝的活性成分。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。 在本发明的下述实施例中，使用的试剂如下 油酸Oleic acid(简写为0A， Sigma)溶于二甲基亚砜(DMS0)，制成终浓度为1M/ L，保存于-2(TC。 oil red O(bio basic inc)染液将100ml异丙醇倒入三角瓶中，再加入0. 5g油 红0，于水浴中慢慢加热使之溶解，待完全溶解后取出。冷却至室温后过滤，装于棕色小磨 砂口瓶中保存。临用前取6ml滤液加4ml蒸馏水，混合后静止10min，过滤。室温下染色 15min。Harris氏苏木素液 甲液苏木素lg，无水酒精10ml ;乙液硫酸铝钾20g，蒸馏水200ml ;丙液一氧化
汞0. 5g。先将甲液加热溶解后，密封待用，再将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸
腾状态时再将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最
后，将一氧化汞缓慢倾入溶液中。此时液体变为深紫色，待一氧化汞全部放入后，再将溶液
加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，并缓缓地连续摇晃至溶液完全冷却为止。
隔夜后过滤，加入冰醋酸(按5%比例)混匀，再过滤后保存于冰箱内备用。 在本发明的下述实施例中，油红0染色的方法如下吸去24孔板中的培液，冷冻
PBS洗3次。10%多聚甲醛固定10min，冷冻PBS洗3次，油红0染色15min，冷冻PBS洗3
次，85%丙二醇浸渍3min，水洗3次，苏木素复染0. 5-lmin，水洗3次，甘油封片。 在本发明的下述实施例中使用的质粒GFP-Nur77按Zhang XK等提供的方法
(Zhang XK， et al. ， Molecular and Cellular Biology, 23 (23) :8651-8667,2003)构建获得。 在本发明的下述实施例中使用的普伐他汀溶液是由普伐他汀钠片(中美上海施 贵宝制药有限公司)溶于二甲基亚砜(匿SO)，制备成不同浓度的溶液。 在本发明的下述实施例中使用的辛伐他汀溶液由辛伐他汀溶于二甲基亚砜 (DMS0)，制备成不同浓度的溶液。 在本发明的下述实施例中使用的阿托伐他汀溶液由阿托伐他汀溶于二甲基亚砜 (DMS0)，制备成不同浓度的溶液。 实施例1、随着油酸含量依次增高肝H印G2细胞中的脂质沉积逐渐增加
将在含10%小牛血清(杭州四季青)的DMEM(Gibco)中培养的H印G2细胞(ATCC， HB-8065)按7X 103个/孔的密度均匀铺于24孔板，之前将lcmX lcm的玻片放入制作细胞 爬片。过2h，等细胞基本贴壁后每孔补加500mllOXDMEM，培养过夜。将培养过夜的H印G2细胞加入油酸处理12h或24h。油酸浓度分别为O. 125mM，0. 25mM，0. 5mM，1.0mM。不同的浓 度和时间均设置2个孔。 加药处理24h后，在显微镜下观察，发现用油酸处理后的细胞与没有经过任何处 理的对照组相比形态发生明显变化，如细胞变圆，变大，围绕细胞核的胞质中有很多透明 颗粒，为脂肪颗粒。且随着油酸浓度的升高，时间的加长这种现象更加明显。收细胞进行油 红O染色，再用苏木素染细胞核。荧光显微镜下观察。结果如图l所示。
根据图1的结果，油酸可以明显诱导H印G2细胞中的脂质沉积(染色显示红色)， 且油酸浓度越高，效果越明显。此结果说明油酸诱导H印G2细胞脂肪变性可以作为本次研 究的模型，将1. OmM的油酸处理24h定为诱导H印G2细胞脂肪变的最佳浓度。
实施例2、普伐他汀可降低油酸诱导的肝H印G2细胞中的脂质沉积
H印G2细胞按7 X 103个/孔的密度均匀铺于在24孔板，之前将lcmX lcm的玻片放 入制作细胞爬片。过2h，等细胞基本贴壁后每孔补加500mllOXDMEM，培养过夜。培养过夜 后普伐他汀和油酸共同加药处理如下对照(Con，正常培养，不加药)，1. OmM油酸，10—7mol/ L普伐他汀+l. OmM油酸，10—6mol/L普伐他汀+l. OmM油酸，10—5mol/L普伐他汀+1. OmM油酸。 在24孔板中取细胞生长状态良好的10个孔进行加药，不同的处理设2个孔。
加药处理24h后，显微镜下观察，可以看到加入1. OmM油酸的孔中细胞变圆，变大， 胞质中围绕细胞核有很多透明颗粒。同时加入普伐他汀处理的细胞，10—^01/L普伐他汀 +1. OmM油酸的孔中有类似的形态变化，10—6mol/L普伐他汀+1. OmM油酸的孔中形态变化不 是很明显，10—5mol/L普伐他汀+1. OmM油酸的孔中细胞状态与对照(Con)相似，几乎没有变 化。收细胞进行油红O染色，再用苏木素染细胞核。荧光显微镜下观察。结果如图2所示。
根据图2的结果，普伐他汀可以降低因油酸引起的H印G2细胞的脂质沉积。其作 用效果呈浓度依赖性。此结果说明，普伐他汀的确可以抑制H印G2细胞的脂肪变。
实施例3、他汀类药物对肝H印G2细胞中孤儿核受体Nur77蛋白表达的调控
本实施例中使用的免疫蛋白印迹检测(Western Blot)的方法参考《分子克隆实验 室手册》，具体方案如下 将肝H印G2细胞，均匀接种于6cm细胞板中，于37t:，5X的二氧化碳箱中，培养 过夜。待细胞生长至对数期后，换成无血清的DMEM培养基饥饿24h，然后用浓度分别为0、 10—7mol/L (12h， 24h) 、 10—6mol/L (12h， 24h) 、 10—5mol/L (12h， 24h)的他汀类药物(分别选用普 伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀)处理H印G2细胞24h后，用0. 5%的胰酶消化细胞，用细胞 裂解液裂解消化好的细胞，得到蛋白样品。 用60ii g的上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，测定裂 解液蛋白浓度，接着用转膜仪把蛋白用电转方法转移到PVDF膜上。之后，用含5%奶粉的 TBST溶液，于室温封闭lh，然后加入l : 1000稀释的兔抗Nur77多克隆抗体(Santa Cruz) 作为一抗，4t:孵育过夜，吸掉一抗后，用TBST洗涤3次，每次洗涤5min ;然后加入l : 10000 稀释的偶联辣根过氧化物酶的抗兔二抗(Pierce)，于室温摇床孵育1小时后，吸掉二抗，用 TBST洗涤3次，每次洗涤5min。用ECL试剂盒(Thermo)显色，在压片盒中压片，然后显影， 定影得到胶片。结果如图3A和图3B所示。 根据图3A的结果，表明普伐他汀能够诱导孤儿核受体Nur77蛋白在H印G2细胞中 的高表达，且加药时间越长表达量越高。
根据图3B的结果，表明多种他汀类药物都能够诱导孤儿核受体Nur77蛋白在
H印G2细胞中的高表达，其中普伐他汀诱导效果最佳。 实施例4、转染GFP-Nur77的肝H印G2细胞中脂质沉积减少 H印G2细胞按7X 103个/孔的密度均匀铺于在24孔板，之前将lcmX lcm的玻片 放入制作细胞爬片。过2h，等细胞基本贴壁后每孔补加500mllOXDMEM，培养过夜。将培 养过夜的H印G2细胞，换无血清培养基培养lh，之后转染质粒GFP-Nur77。转染6小时后使 用新的无血清DMEM培养基进行换液，待细胞生长24h后，加入1. OmM的油酸处理24h。收 细胞，油红染色，水洗3次，以lii g/ml DAPI(Sigma)30。C避光染色10min，水洗3次。封片。 用荧光显微镜观察细胞形态。结果如图4所示。 根据图4的结果，与同视野内没有被转染的细胞相比，转染GFP-Nur77的H印G2细 胞中脂质沉积有所减少。说明孤儿核受体Nur77的高表达具有抑制肝H印G2细胞中脂质沉 积的作用。 肝H印G2细胞作为研究肝脂肪代谢已被作为一个公认的研究工具，除了利用 H印G2细胞外，本发明人还在原代培养的肝细胞中同样发现上述现象。 综上所述，普伐他汀可显著抑制肝细胞中的脂质沉积；其机制是通过诱导孤儿核 受体Nur77蛋白表达介导的。 本发明提供的孤儿核受体Nur77靶点可以用于指导筛选治疗脂肪肝的药物，指导
筛选其他他汀类药物和中草药，从中获得能够治疗脂肪肝的活性成分。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独
引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种他汀类物质的用途，用于制备上调细胞中孤儿受体Nur77的表达的组合物。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的他汀类物质选自普伐他汀或其药学 上可接受的盐，辛伐他汀或其药学上可接受的盐，阿托伐他汀或其药学上可接受的盐，或它 们的组合。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的他汀类物质是普伐他汀或其药学上 可接受的盐。
4. 如权利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于抑制细胞中脂 质沉淀。
5. 如权利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于减缓细胞的脂肪变。
6. 如权利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于防治脂肪肝。
7. 如权利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的细胞是肝细胞。
8. —种制备上调细胞中孤儿受体Nur77的表达的组合物的方法，所述方法包括将有 效量的他汀类物质与药学上可接受的载体混合。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的他汀类物质选自普伐他汀或其药学 上可接受的盐，辛伐他汀或其药学上可接受的盐，阿托伐他汀或其药学上可接受的盐，或它 们的组合。
10. —种上调细胞中孤儿受体Nur77表达的方法，所述方法包括给予需要上调的对象 有效量的他汀类物质。
全文摘要
本发明涉及他汀类物质在制备脂肪肝防治药物中的用途。本发明首次发现他汀类物质具有上调细胞内孤儿受体Nur77表达水平的作用。因此，他汀类物质可用于防治细胞内孤儿受体Nur77低表达或不表达所导致的疾病；或用于通过调节孤儿受体Nur77表达来发挥调节细胞增殖、分化发育和凋亡的作用，或调节细胞内脂质代谢和能量代谢。
文档编号A61K45/00GK101745113SQ20081020390
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者储瑞蔼, 张晓坤, 曾锦章, 郎园园 申请人:中国科学院上海生命科学研究院;上海生茂投资有限公司