专利名称：：牛蒡子提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种牛蒡子提取物；此外，本发明还涉及该牛蒡子提取物的制备方法和用途。
背景技术：
：目前，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重威胁人类健康的疾病，被WHO列为世界三大顽症之一。若没有及时诊断、正规治疗可引起多种慢性并发症。据统计，一半以上的糖尿病患者并发神经病变；约有30%的糖尿病患者并发增生性视网膜病，其中每年有1.2%可能发展到失明；30%-40%的I型糖尿病患者和15%-20%的II型糖尿病患者并发糖尿病肾病(DN)，可由最初出现蛋白尿发展到高血压、肾病综合征等，严重者最终导致肾衰和死亡。鉴于糖尿病并发症的巨大危害，寻找相应的治疗药物具有重大的经济价值和社会意义。多元醇旁路的激活是糖尿病各种慢性并发症的发病机理之一，其中，醛糖还原酶(aldosereductase,AR)起了关键的作用。醛糖还原酶是聚醇代谢通路中的关键限速酶，可以将葡萄糖和半乳糖转化为相应的还原产物山梨醇和半乳糖醇。当血糖浓度维持在正常的生理水平时，AR并不被激活。在糖尿病发生时，AR则被激活，促使体内的葡萄糖转化成山梨醇，由于山梨醇不易通过细胞膜，所以在胞内造成了山梨醇的聚积。目前，大量前沿研究已经证实，长期的糖尿病并发症如眼部组织疾病、神经病变、肾脏病变等，都与体内山梨醇的蓄积有关。牛蒡子为《中国药典》2000年版一部收载的中药，原属于辛凉解表类中药，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功能，用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛等症，用量6-12g/日。
发明内容本发明所要就解决的技术问题之一是对牛蒡子原药材进行加工提取，提出一种牛蒡子提取物，并对其活性部位进行了准确的定位；另外，本发明还要提出该牛蒡子提取物的制备方法和用途。该牛蒡子提取物具有显著的醛糖还原酶抑制作用，可用于治疗糖尿病并发症。本发明提出的牛蒡子提取物，木脂素类化合物的重量含量为64-90%(紫外分光光度法测定)。优选地，该提取物中，牛蒡苷元的重量含量为3-6%(高效液相色谱法测定)，牛蒡苷的重量含量为32-45%(高效液相色谱法测定)，牛蒡苷和牛蒡苷元两者的总重量含量为35%-51%，其余木脂素类化合物(罗汉松脂素、L即pao1A、L即pao1C、L即pao1F、La卯ao1H和ArctignanE)的重量含量为13%-55%(紫外分光光度法测定)。本发明提出的牛蒡子提取物的制备方法，包括如下步骤称取牛蒡子原药材，粉碎成粗粉，加8倍重量浓度为95%(重量浓度，以下称3wt%)的乙醇，回流提取2次，每次3h，过滤，合并滤液后，减压浓縮至无醇味；将所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，下层流浸膏加入浓度为20%(wt%)的乙醇，搅拌，使其充分混悬，再加水稀释成浓度为20%(wt%)的混悬液，上D101型大孔吸附树脂柱；用TLC检查流出液，直至产生与对照样品色谱相应的斑点时停止上样；先用水洗至水洗液Monish反应呈阴性，再依次用重量浓度为30%、50%、75%和95%的乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，每个浓度梯度吸脱4BV，合并重量浓度为50%、75%和95%的乙醇洗脱液，减压浓縮成流浸膏后，在-0.lMPa、6(TC的条件下真空干燥至恒重，即得。随后的试验将证明按上述方法制备的牛蒡子提取物中可检出牛蒡苷(arctiin)，牛蒡苷兀(arctigenin)，罗汉松月旨素(matairesinol)，LappaolA，LappaolC，LappaolF，L即paolH和ArctignanE8种木脂素类化合物。本发明所述的牛蒡子提取物，经药理试验证明，具有显著的醛糖还原酶抑制作用，可以用于制备防治糖尿病并发症的药物，如糖尿病性白内障、视网膜病变、角膜病变和/或糖尿病周围神经病变。图1为本发明牛蒡子提取物的UPLC/MS色谱图。图2-9为牛蒡子所含8种木脂素类化合物的UPLC/MS色谱图。图10为牛蒡苷对照品的HPLC图谱。图11为牛蒡子提取物的牛蒡苷含量测定HPLC图谱。图12为牛蒡苷元对照品的HPLC图谱。图13为牛蒡子提取物的牛蒡苷元含量测定HPLC图谱。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。实施例1(制备牛蒡子提取物)取牛蒡子原药材50kg(牛蒡子原药材购自徐州医药股份有限公司药材分公司，产地江苏徐州)，粉碎成粗粉，加400L浓度为95%(wt%)乙醇，回流提取2次，每次3h，过滤，合并滤液后，减压浓縮至浓縮浸膏无醇味。所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，将其下层流浸膏加20%(wt%)乙醇搅拌，使其充分混悬，再加水稀释成浓度为20%(wt%)的混悬液，上D皿型大孔吸附树脂柱。用TLC检查流出液，至产生与对照样品色谱相应的斑点时停止上样。先水洗至水洗液Monish反应呈阴性，再依次用30%、50%、75%和95%(wt%)的乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，每个浓度梯度洗脱4BV，合并50%、75%和95%的乙醇洗脱液，减压浓縮成流浸膏后，在-0.lMPa、6(TC的条件下真空干燥至恒重，即得牛蒡子提取物7.5kg。实施例2(牛蒡子提取物的成分鉴别)将实施例1制得的牛蒡子提取物，采用UPLC/MS分析方法，根据分子量，定性鉴别其所含的化合物，具体操作如下1.仪器Waters公司AcquityUltraPerformance型液相色谱，Waters公司MicromassZQ型质谱检测器，Masslynx色谱工作站，试剂均为色谱纯(美国Fisher公司)。2.实验方法2.l试验样品的制备称取牛蒡子提取物样品适量，用流动相配制成2mg/ml溶液，备用。2.2.UPLC色谱条件色谱柱AcquityUPLCBEHC-18(1.7iim，2.ImmX50mrn，5iim);流速0.21ml/min;流动相为水-甲醇(6:4);柱温40°C;检测波长280nm，进样量0.5yl。2.3MS条件电喷雾电离源(ESI)，正、负离子检测，电离电压2.6kV(+)、2.9kV(-);离子源温度120°C;锥孔电压30V;脱溶剂气温度300。C(+)、250°C(-);脱溶剂气(N2)流速:500L/h(+)、600L/h(-)。二极管矩阵检测器(PDA)与质谱串联，两者之间的滞后时间约为O.lmin。3.实验结果为了确定牛蒡子提取物中各组分，采用二极管矩阵(PDA)和正、负离子检测，结果显示牛蒡子提取物中存在8种组分(如图1所示)，各组分的UV最大吸收波长均为280nm，除了牛蒡苷和罗汉松脂素外，各组分的正、负离子检测方式均能检出特征离子峰，即M+Na、M-H。根据其质谱特征，确定各组分依次为牛蒡苷、牛蒡苷元、罗汉松脂素、L即pao1A、LappaolC、Lappao1F、Lappao1H、ArctignanE(如图2-9所不)。实施例3将实施例1制得的牛蒡子提取物，采用紫外分光光度法，以牛蒡苷元为外标，于280nm波长处测定其总木脂素类的含量，相应得出该提取物中其他成分的百分含量。具体操作如下1.材料牛蒡苷元对照品购自Sigma公司。2.方法2.l对照品溶液的制备精密称取牛蒡苷元对照品适量，加甲醇制成每ml含30iig的溶液，即得。2.2供试品溶液的制备称取实施例1制得的牛蒡子提取物约10mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液lml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。3.含量测定分别取对照品和供试品溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)，在280nm波长处测定吸光度，计算，即得。经过对多批样品的含量测定，实施例1制得的牛蒡子提取物中总木脂素类化合物及牛蒡苷的含量为64%_90%，则其它成分的含量为10%-36%。5实施例4将实施例1制得的牛蒡子提取物，采用高效液相色谱法，以牛蒡苷、牛蒡苷元为外标，通过积分面积比，测定其牛蒡苷元和牛蒡苷的含量。将实施例3中所测得的总木脂素类及牛蒡苷的含量减去本实施例中测得的牛蒡苷元和牛蒡苷的总含量，即得该提取物中其余总木脂素类的含量。具体操作如下1.试齐[J牛蒡苷元对照品(Sigma公司)，牛蒡苷对照品(自制，经UV、IR、MS、NMR完成结构鉴定，HPLC含量测定，纯度为98.5%)。试剂均为色谱纯(美国TEDIA公司)。2.方法2.1色谱条件2.1.1牛蒡苷色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇_水(45:55)为流动相；检测波长为280nm。理论塔板数按牛蒡苷峰计算应不低于6000。2.1.2牛蒡苷元色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-水(20:20:60)为流动相；检测波长为280nm。理论塔板数按牛蒡苷元峰计算应不低于5000。2.2对照品溶液的制备2.2.1牛蒡苷精密称取牛蒡苷对照品适量，加甲醇制成每ml含40iig的溶液，即得。2.2.2牛蒡苷元精密称取牛蒡苷元对照品适量，加甲醇制成每ml含5iig的溶液，即得。2.3供试品溶液的制备称取实施例1制得的牛蒡子提取物20mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。3.含量测定分别取对照品和供试品溶液，照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定牛蒡苷对照品的HPLC图谱如图10所示，牛蒡苷元对照品的HPLC图谱如图12所示；该提取物中牛蒡苷含量测定的HPLC图谱如图ll所示，该提取物中牛蒡苷元含量测定的HPLC图谱如图13所示。经过对多批样品的含量测定，测得该提取物中牛蒡苷的含量在32%_45%，牛蒡苷元的含量在3%-6%，牛蒡苷和牛蒡苷元两者的总含量在35%-51%。根据实施例3中所测得的总木脂素类及牛蒡苷的含量为64%_90%，减去本实施例中测得的牛蒡苷元和牛蒡苷的总含量35%_51%，即得该提取物中其余总木脂素类的含量为13%-55%。实施例5将实施例1制得的牛蒡子提取物用于进行体外醛糖还原酶抑制实验，实验证明，该提取物具有显著的醛糖还原酶抑制作用。1.材料和方法1.1主要试剂NADPH、DL-苷油醛(sigma公司产品)，2-巯基乙醇(中国医药集团上海化学试剂公司化学纯)，Li2S04(国药集团化学试剂有限公司)，酶标仪(BioTekInstruments,Inc，USA)，匀桨机(IKAT10basic)，牛蒡子提取物，磷酸钾缓冲溶液(0.lM、ph6.2)(磷酸二氢钾、磷酸氢二钾国药集团化学试剂有限公司)，依帕司他片剂(南京金陵制药有限公司)。1.2鼠醛糖还原酶的提取冻存的大鼠晶状体4t:解冻，取30只于10ml4°C的磷酸钾缓冲溶液(0.lM、ph6.2)中匀浆，4°C、4400rpm离心30mins，取上清液，1.5ml/管分装，-7(TC冻存。整个操作都在4°C以下进行。1.3醛糖还原酶提取物蛋白含量的测定以牛血清白蛋白为标准，用考马斯亮兰法，于595nm处测定吸光度(0D)值，由回归方程计算出AR粗提取物中蛋白含量。1.4体外酶促反应体系的建立及酶活性的检测酶促反应在96孔板上进行，整个体系体积为250ul，初定各物质浓度为Li2S04400mmol/L，磷酸钾缓冲溶液0.67mmol/L，2-巯基乙醇5mmol/L，NADPHO.3mmol/L，DL-苷油醛3mmol/L，粗酶提取液50ul。首先将没有底物的板置于25。C中保温10分钟，最后加底物启动反应的进行。用酶标仪340nm下监测10min以不含底物的样品为空白对照，扣除空白对照体系中NADPH自然氧化所造成的吸光度变化。将25t:时吸光度每分钟变化0.001单位的酶定义为一个酶活性单位。1.5酶促反应体系的验证选择已上市的醛糖还原酶抑制剂——依帕司他对本反应体系进行验证。在依帕司他浓度一定的条件下，加入不同浓度的底物溶液测定酶活力，而后改变依帕司他的量，得出一系列不同底物浓度条件下的酶活力，绘制1/[S]1/v双倒数曲线，确定其抑制类型与文献对比。1.6醛糖还原酶抑制剂的体外筛选将Li^04、2-巯基乙醇溶于磷酸钾缓冲溶液(0.1M、ph6.2)中配置成一定浓度的溶液称之为试剂A，将牛蒡子提取物溶于试剂A并稀释成6个含量梯度12.5、25、50、100、200、400iig/ml，加入酶促反映体系测定其抑制率。抑制率=(1-加药后活性/未加药活性)X100%2.试验结果2.1AR粗粗酶蛋白含量的测定AR粗酶蛋白浓度为2.2mg/ml。2.2依帕斯他对酶促反应体系的验证通过依帕司他对AR抑制作用的1/[S]1/v双倒数曲线，确定为依帕斯他对AR的抑制作用是反竞争性的，与文献报道相符，证明此体系的可靠性(见表1)。2.3试验结果表1.牛蒡子总木脂素的醛糖还原酶抑制率7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>an=3.试验结果表明，本发明牛蒡子提取物具有显著的醛糖还原酶抑制活性，当浓度为200iig/mL时，其对醛糖还原酶的抑制活性与已上市的醛糖还原酶抑制剂——依帕司他相似，且其抑制活性表现出良好的量效关系。众所周知，多元醇旁路的激活是糖尿病各种慢性并发症的发病机理之一，其中，醛糖还原酶(aldosereductase，AR)起了关键的作用。醛糖还原酶是聚醇代谢通路中的关键限速酶，可以将葡萄糖和半乳糖转化为相应的还原产物山梨醇和半乳糖醇。当血糖浓度维持在正常的生理水平时，AR并不被激活。在糖尿病发生时，AR则被激活，促使体内的葡萄糖转化成山梨醇，由于山梨醇不易通过细胞膜，所以在胞内造成了山梨醇的聚积。目前，大量前沿研究已经证实，长期的糖尿病并发症如眼部组织疾病、神经病变、肾脏病变等，都与体内山梨醇的蓄积有关。故本发明牛蒡子提取物，可应用于制备防治糖尿病并发症，如糖尿病性白内障、视网膜病变、角膜病变和糖尿病周围神经病变的药物。权利要求一种牛蒡子提取物，其特征在于，木脂素类化合物的含量为64-90％(wt％)。2.根据权利要求1所述的牛蒡子提取物，其特征在于，牛蒡苷元的含量为3-6%(wt%)，牛蒡苷的含量为32-45%(wt%)，其余木脂素类化合物的含量为13-55%(wt%)。3.根据权利要求2所述的牛蒡子提取物，其特征在于，其余木脂素类化合物为罗汉松月旨素、Lappao1A、Lappao1C、Lappao1F、Lappao1H禾卩ArctignanE。4.根据权利要求1或2或3所述的牛蒡子提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤称取牛蒡子原药材，粉碎成粗粉，加8倍重量浓度为95%(wt%)的乙醇，回流提取2次，每次3h，过滤，合并滤液后，减压浓縮至无醇味；将所得流浸膏静置至室温，倾除其上层液态部分，下层流浸膏加入浓度为20%(wt%)的乙醇，搅拌，使其充分混悬，再加水稀释成浓度为20%(wt%)的混悬液，上D101型大孔吸附树脂柱；用TLC检查流出液，直至产生与对照样品色谱相应的斑点时停止上样；先用水洗至水洗液Monish反应呈阴性，再依次用浓度为30%、50%、75%和95%(wt%)的乙醇洗脱，洗脱流速2BV/h，每个浓度梯度吸脱4BV，合并浓度为50%、75%和95%的乙醇洗脱液，减压浓縮成流浸膏后，在-0.lMPa、6(TC的条件下真空干燥至恒重，即得。5.权利要求1或2或3所述的牛蒡子提取物在制备防治糖尿病并发症的药物中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，糖尿病并发症是糖尿病性白内障、视网膜病变、角膜病变和/或糖尿病周围神经病变。全文摘要本发明涉及一种牛蒡子提取物及其制备方法和应用，该提取物中总木脂素类化合物的重量含量占64％-90％。其中，牛蒡苷元的重量含量占3％-6％，牛蒡苷的重量含量占32％-45％，其余木脂素类化合物的重量含量占13％-55％。药理试验结果表明，本发明中的牛蒡子提取物具有较强的醛糖还原酶抑制作用，可以用于制备防治糖尿病并发症——如糖尿病性白内障、视网膜病变、角膜病变和糖尿病周围神经病变的药物。文档编号A61K36/28GK101766668SQ20081020824公开日2010年7月7日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者冯怡,徐朝晖,贾伟申请人:上海中医药大学