专利名称：：联合疫苗在肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及联合疫苗的新用途，具体涉及联合疫苗在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是一类严重危害人类生命健康的疾病，现有的治疗方法主要有手术切除、化疗、放疗、免疫治疗和基因治疗。但是，这些方法在不同方面都存在这缺陷。例如，手术切除创伤性大且无法阻止癌细胞的扩散或转移；化疗药物的选择性差，在'取得治疗效果的同时，常出现不同程度的毒副作用；放疗具有远期毒性反应，且只适用于区域敏感性肿瘤；免疫治疗着眼于提高患者的抗肿瘤免疫能力，从而达到治疗、控制肿瘤的效果和目的，但某些肿瘤的免疫原性太低或丧失，这种全身性的治疗手段并不能发挥很好的作用；而基因治疗是从基因水平调控细胞的基因表达过程，被认为是较理想和根本的治疗手段，但目前仍处于试验阶段，有许多问题未能克服。因此，有必要开发出更多的肿瘤治疗药物和方法，以为临床治疗提供更多的选择。
发明内容本发明的目的在于提供联合疫苗在治疗肿瘤的新用途。所述联合疫苗包含两种或两种以上选自重组乙肝疫苗、卡介苗、百日咳疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗的疫苗。在优选的实施方式中，所述百日咳疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗是百白破三联疫苗。在优选的实施方式中，所述麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗是麻风腮三联疫苗。在优选的实施方式中，所述联合疫苗使用磷酸铝或氢氧化铝作为吸附剂。在优选的实施方式中，所述吸附剂中的铝离子浓度为0.5-1.25mg/mL。在优选的实施方式中，所述联合疫苗为冻干剂型，其使用蔗糖、氯化钾、氯化钠或谷氨酸钠作为支持剂。在优选的实施方式中，所述联合疫苗可制成脂质体，其含有磷脂和胆固醇，可以为粉剂、膏剂、溶液剂等多种剂型。在优选的实施方式中，所述联合疫苗中还包含中性表面活性剂，例如吐温20、吐温80或曲通X-100。在优选的实施方式中，所说联合疫苗的最终pH为6.0-7.5。根据免疫效果的不同，疫苗接种后在体内引发细胞或体液免疫，产生记忆性淋巴细胞及抗体。当病原再次入侵时，其引发特异性的免疫反应，清除病原体，预防疾病。在接种疫苗后，不仅可以产生特异性的免疫反应，还可以产生广泛的非特异性的免疫反应，增强机体的免疫力。本发明中的联合疫苗除水痘疫苗外均为我国免疫计划疫苗，同时也是儿童常规接种的疫苗。我国经过多年的计划免疫推广，在大多数青少年及成人体内存在疫苗的抗体，当体内再次出现病原后，能够在局部产生特异性的免疫反应。发明人惊讶地发现，该特异性的免疫反应可以应用于肿瘤治疗中。由于体内存在抗体及致敏的淋巴细胞，在肿瘤局部注射计划免疫疫苗，会在该位置产生抗原抗体中和反应、抗原复合物清除反应，机体致敏淋巴细胞迅速活化，在肿瘤局部聚集大量的吞噬细胞等免疫细胞。局部细胞因子增多，促进细胞坏死，增强了抗原提呈细胞对肿瘤抗原的识别，诱发抗肿瘤反应，并且由于淋巴细胞活化产生的非特异性免疫反应可以增强机体免疫力，因而加强了抗肿瘤作用。由于有的疫苗使用灭活菌体，有的疫苗使用减毒活菌，因而产生的抗体保护时间不同，单独使用一种疫苗瘤内注射的效果较差，而应用多种疫苗联合制剂可以有效的避免免疫力不足的弱点，能产生良好的抗肿瘤效果。具体实施例方式重组乙型肝炎疫苗，是由重组酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，经纯化加佐剂吸附后制成，其用于预防乙型肝炎。每安瓿为0.5ml，每次人用剂量0.5ml(含HBsAg5路)。卡介苗(通常为皮内注射用卡介苗)，是用卡介菌种在综合培养液中培养后，收集菌膜，混悬于适宜的灭菌的保护液内，经冷冻干燥制成。所得到的活菌制剂，预防严重的结核病。每安瓿含0.5mg0.75mg菌体。百日咳疫苗、白喉疫苗和破伤风疫苗，通常制成无细胞型百日咳白喉破伤风联合疫苗(即，百白破二联疫苗)，由无细胞百日咳疫苗、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成，用于预防百日咳、破伤风及白喉。每安瓿0.5ml，含百日咳效价不低于4.0IU;白喉效价不低于30IU;破伤风效价不低于40IU。麻疹疫苗、腮腺炎疫苗和风疹疫苗，通常制成麻疹腮腺炎风疹联合减毒疫苗(即，麻风腮三联疫苗)，由麻疹减毒株、腮腺炎病毒株、风疹减毒株三种病毒混合、冻干而成，能诱导产生95%的麻瘆血凝抑制(111)抗体、96%腮腺炎中和抗体和99。/。风疹血凝抑制(HI)抗体，用于预防麻疹、腮腺炎、风疹。甲型肝炎减毒活疫苗，由甲肝病毒减毒株接种人二倍体细胞，经培养、收获病毒液而制成，用于预防甲型肝炎。每支1ml，所含活病毒量不低于6.5LgCCID50。冻干水痘减毒活疫苗，由水痘带状疱疹病毒Oka减毒株接种人二倍体细胞，经培养、收获病毒液后冻干制成。其通过刺激机休产生抗水痘带状疱疹病毒的免疫力，从而用于预防水痘。每支所含活病毒量不低于2000PFU。2003年12月10日公布的CN1460521号申请公开了一种重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗；2002年12月4日公布的CN1383384号申请公开了一种含有白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳和HBsAg的四价联合疫苗(DTwPH);2008年9月IO日公布的CN101259269号申请公开了一种冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗。通过引用将这些文献合并至此文中。本发明的联合疫苗可单独使用，也可在临床使用过程中配合其他制剂共同使用。在肿瘤治疗中，可以在治疗前进行外周免疫，促进抗体产生，增强免疫记忆，促进抗原提呈细胞成熟。本发明的联合疫苗的给药途径可以是瘤内直接多点注射对于表浅的肿瘤，可进行瘤内的直接注射；对于深部或脏器肿瘤，可在影像学技术引导下进行穿刺注射。而且，在优选的方案中，药物注射可以伴随肿瘤的手术或微创治疗同时进行。本发明的联合疫苗选用目前国家计划免疫疫苗，经过吸附联合处理，各组成成分安全，制剂稳定性好，便于携带保存，抗肿瘤效果显著。以下举例说明本发明的实施方式及效果。实施例I重组乙型肝炎疫苗及卡介苗联合疫苗一、重组乙型肝炎疫苗及卡介苗联合疫苗的制备按CN1460521号申请公开的内容制备重组乙型肝炎疫苗及卡介苗联合疫苗，或者按以下方法制备所述联合疫苗将氢氧化铝凝胶加到磷酸盐缓冲液中从而制成氢氧化铝溶液，加入商购乙肝疫苗在4"C时充分混合15h。HBs抗原氢氧化铝溶液5-10jig/ml氯化钠0.8-0.9mg/ml2-苯氧基乙醇4.0-6.0mg/ml吐温200.4-0.06mg/ml5将以上组分在20-4(TC阵摇1-4h，调整强度氯化钠含量至0.8-0.9mg/ml和pH至7.0-8.0，得到乙肝氢氧化铝凝胶。乙肝氢氧化铝凝胶1-2ml卡介苗250-500吗明胶8-1.0mg蔗糖8-12mg氯化钾0.8-1.2mg谷氨酸钠0.8-1.2mg氯化钠0.8-0.9mg其余为注射用水将以上组分在20-40。C阵摇1-4h，调整强度氯化钠含量至0.8-0.9mg/ml和pH至6.0-7.5。分装，每支0,2mg，冷冻干燥，干燥箱一40。C，预冻3-4小时，一4(TC冷冻7-8小时，逐渐升温真空干燥8-10小时，30-35。C恒温真空干燥7-8小时。二、试验方案1.动物实验，以昆明小鼠造模，肿瘤模型为S180肉瘤。2.细胞培养将冻存的细胞迅速放入38'C水浴中，并不时摇动，在l分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。1000r/min离心510分钟，弃去上层液，加入10X新生牛血清+RPMI-1640，接种浓度1X1()9/L，37°C5%(302培养箱1天换液，传代计数，取0.5ml细胞小鼠腹腔注射传代。3.瘤细胞接种抽取S180小鼠腹水，生理盐水无菌条件下制成单细胞悬液，调整细胞数为iX107+/ml，计数活细胞数>95%，于小鼠背部皮下接种0.1ml。4.动物分组40只昆明小鼠随机按下方案随机分组，每组10只。将联合疫苗制剂配成混悬液。Sl:联合疫苗制剂0.1ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O.lml腹水瘤细胞及O.lml联合疫苗制剂。观测肿ll生长情况。S2:联合疫苗制剂0.1ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O.lml腹水寧细胞。两周后测量背部肿瘤大小并注射O.lml生理盐水,观测肿瘤生长情况。每周重新给药。S3:联合疫苗制剂O.lml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并注射O.lml联合疫苗制剂,观测肿瘤生长情况。每周重新给药。S4:小鼠不免疫，和同组其余小鼠相同时间接种肿瘤，背部皮下注射0.1ml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并注射O.lml联合疫苗制剂,观测肿瘤生长情况。每周重新给药。最后一次免疫后一周每组取1只小鼠处死，取血清利用免疫沉淀反应检测抗体滴度。瘤体积测定使用卡尺测量小鼠背部瘤块长(a)、短径(b)。瘤体积二ab2/2抑瘤率的测定:给药结束后一周脱颈处死小鼠,剥离完整瘤块,称重并计算抑瘤率。抑瘤率=(l-实验组肿瘤重/对照组肿瘤重)X100%。试验结果见表1和表2测定的小鼠免疫后体内抗体滴度64:1。表l:小鼠抑瘤率试验值试验指标Sl组S2组S3组S4组动物数(只)6666瘤重(g)2.3215±1.0458*6.4006土2.49131.2359±1.0053，4週5±1.9218抑瘤率(％)80.7厶，69.8AA注、免疫对照组比较P〈0.01;与空白对照组比较P〈0.01;"与免疫对照组比较；M与空白对照组比较。表2:试验小鼠每周体积测定肿瘤平均体积(cm3)给药前给药l周给药2周给药3周给药4周Sl组0,2760.2100.4251.1695.560S2组0.0120.2050.1792.18126.125S3组2.7466.3026.8259.59212.125S4组0.483l細1.1835.00024.000从表1和表2可看出，免疫后治疗组与肿瘤细胞同时接种组显示了良好的抑制肿瘤生长的效果。给药组较免疫后盐水组治疗有效果，这种治疗效果在隔周给药组中表现为治疗两周后起效，能更持久控制肿瘤的生长。不免疫治疗组较盐水组有效，但与免疫治疗组比较，不免疫组控制肿瘤能力差，组内小鼠易出现转移及腹水。实施例II水痘一麻疹_卡介苗三联疫苗一、将水痘疫苗、麻疹疫苗、卡介苗疫苗各一安培，使用lml灭菌注射水溶解，并混合按下述方法制作三联疫苗脂质体。二、实验方案1.动物实验，以昆明小鼠造模，肿瘤模型为腹水型肝癌细胞H22。2.细胞培养将冻存的细胞迅速放入38。C水浴中，并不时摇动，在l分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。1000r/min离心510分钟，弃去上层液，加入10X新生牛血清+RPMI-1640，接种浓度1X109/1」，37°C5%002培养箱1天换液，传代计数，取0.5ml细胞小鼠腹腔注射传代。3.瘤细胞接种抽取H22小鼠腹水，生理盐水无菌条件下制成单细胞悬液，调整细胞数为1Xl(f个/ml，计数活细胞数>95%，于小鼠背部皮下接种0.1ml。4.动物分组40只昆明小鼠随机按下方案随机分组，每组10只。将联合疫苗制剂配成混悬液。Sl:联合疫苗制剂0.1ml腹腔免疫，采用相同剂暈l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O.lral腹水瘤细胞及O.lml联合疫苗制剂。观测肿瘤生长情况。S2:联合疫苗制剂0.1ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O:lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续二天注射O.lml生理盐水，观测肿瘤生长情况。S3-联合疫苗制剂0.1ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7大免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续三天注射O.lml联合疫苗制剂,观测肿瘤生长情况。S4:小鼠不免疫，和问组其余小鼠相问时间接种肿瘤，背部皮下注射0.1ml8腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续三天注射O.lml联合疫苗制剂,观测肿瘤生长情况。S5:卡介苗0.1ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射O.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续三天注射O.lml卡介苗,观测肿瘤生长情况。结果如下表3和4所示表3:试验小鼠每周体积测定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表中可看出，免疫后治疗组比较单纯瘤内给药组及免疫后瘤内注射盐水组，显示了良好的抑制肿瘤生长的效果。且联合疫苗与单独使用卡介苗组相比，在同样的试验条件下，联合疫苗的抗肿瘤作用更强。实施例m.脂质体的制备本发明的脂质体含以下组分和比例磷脂1-80%胆固醇1-50%表面活性剂0-50%抗氧化剂0-20%防腐剂0-5%类脂溶液的制备按上述比例将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中，使脂类的浓度在1-50g/ml之间，有机溶剂选自乙醇，氯仿和乙醚。疫苗溶液将如实施例1制备的联合疫苗制剂溶于缓冲液或生理盐水，缓冲液选自醋酸钠缓冲液，枸橼酸钠缓冲液，乳酸缓冲液，磷酸盐缓冲液和酒石酸缓冲液。制备混合疫苗脂质体按常规，将类脂溶液和联合疫苗溶液混合制成脂质体溶液，并可进一步制成干粉制剂。溶液剂将联合疫苗脂质体干粉直接溶于缓冲液或生理盐水制成即可，缓冲液选自醋酸钠缓冲液，枸橼酸钠缓冲液，乳酸缓冲液，磷酸盐缓冲液和酒石酸缓冲液，其中联合疫苗脂质体浓度为0.01ml-0.lml/ml。乳膏剂由油相，水相，乳化剂及促透明剂组成，其中油相材料选自凡士林，石蜡或者液状石蜡，羊毛脂，硅酮，蜂蜡，氢化植物油，硬脂酸甘油酯，高级脂肪醇，占基质20%-70%;水相成分选自聚乙二醇，甘油，丙二醇，占基质20-70%;乳化剂选自新生皂类，吐温类，司盘类，十二垸基硫酸钠，占基质0.1-5%;促透剂选自薄荷脑，冰片，樟脑，水杨酸甲酯，氮酮，丙二醇，N-甲基吡咯烷酮，占基质0-9%。联合疫苗脂质体乳膏剂由联合疫苗脂质体和基质组成，其中联合疫苗脂质体占5-25%，基质可以是水包油型或油包水型；其制备方法为将油相，水相分别加热至7(TC左右，在混合搅匀乳化，冷却后加入联合疫苗脂质体，搅匀即可。凝胶剂由联合疫苗脂质体，高分子基质材料，溶剂，保湿剂和防腐剂组10成，亦可含有中和剂和促透剂。高分子基质材料选自卡波普，羧甲基纤维素钠，羟丙甲纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯垸酮；溶剂为水；保湿剂为甘油，防腐剂为羟苯乙酯或硫硫汞；中和剂为氢氧化钠或三乙醇胺；促透剂选自薄荷脑，樟脑，氮酮，柠檬烯，丙二醇，N甲基吡咯烷酮。各组分的重量百分比为联合疫苗脂质体1-20%，高分子基质材料0.1-5%，保湿剂5-15%，防腐剂0.01-0.5%，中和剂0-6%，促透剂0-20%，溶剂35-70%。制备方法将高分子基质材料加水溶解，按上述配比分别加入保湿剂，防腐剂，中和剂和促透剂，加水至规定量，调整pH值5.5-7.2之间，加入联合疫苗脂质体，搅匀即可。为进一步详细描述本发明脂质体的制备方法，现举例具体说明。1.旋转薄膜超声法制备联合疫苗普通脂质体将卵磷脂0.5g和胆固醇0.05g溶于30ml乙醚中，待完全溶解后，加入维生素E0.lg的类脂溶液，将类脂溶液置于磨口梨形烧瓶中，将梨形瓶置于旋转蒸发仪减压条件下去除有机溶剂。然后向烧瓶中充氮气，完全除去有机溶剂，再向烧瓶中加入10ul/ml联合疫苗制剂磷酸盐缓冲液5ml，35"C下用旋转蒸发仪转动洗膜，待形成的类脂薄膜水合形成牛奶状脂质体混悬液。以三乙醇胺调节pH值在7左右。以孔径为0.22um的过滤器滤过的联合疫苗普通脂质体溶液，冷冻干燥的得粉剂。2.制备联合疫苗脂质体乳膏剂联合疫苗脂质体10ml甘油50g十二垸基硫酸钠9g十八醇81g薄荷脑1g亚硫酸钠3g液体石蜡60ml硫柳荥白凡士林蒸馏水150g满Og制备过程将白凡士林，十八醇，液体石蜡放入不锈钢桶中加热至7(TC，加入硫柳汞，薄荷脑溶解，另取tt油及水加热至75°C，加入亚硫酸钠，十二烷基硫酸钠溶解，两项混合，加入联合疫苗制剂，搅匀即可。或者按如下比例配制联合疫苗脂质体牟-硬脂酸甘油酯甘油硬脂酸三乙醇胺羟苯乙酯蒸馏水10ml20g50g]67g10glg冊0g制备过程将甘油溶于水中，加热保持温度约70°C，另取硬脂酸，但硬脂酸甘油酯加热熔化，加入羟苯乙酯溶解，但温度约7(TC，加入水相中，并不断搅拌至乳化完全，以三乙醇胺调pH值在5.5-7.2之间，加入联合疫苗脂质体，搅匀即可。3.制备联合疫苗脂质体凝胶剂:聚乙烯吡咯烷酮联合疫苗脂质体甘汕羟苯乙酯三乙醇胺蒸馏水加至2g10ml8ml0.1g10g100g制备过程将聚乙烯吡咯垸酮加30倍重量的蒸馏水充分溶账，按上述配比分别加入甘油，羟苯乙酯，以三乙醇胺调PH值在5.5-7.2之间，搅拌均匀，然后加入联合疫苗脂质体，补加蒸馏水至100g，搅匀即可。或者按如下比例配制羟丙甲纤维素1.5g联合疫苗脂质体10ml甘油10ml羟苯乙酯O.lg氮酮5ml内二醇15ml氢氧化钠lg蒸馏水加至100g制备过程将羟丙甲纤维素加30倍重量的蒸馏水充分溶账，按上述配比分别加入甘油，氮酮，丙二醇，羟苯乙酯，以氢氧化钠调PH值在5.5-7.2之间，搅拌均匀，然后加入联合疫苗脂质体，加蒸馏水至100g，搅匀即可。1权利要求1.联合疫苗在制备治疗肿瘤药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述联合疫苗包含两种或两种以上选自重组乙肝疫苗、卡介苗、百日咳疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗的疫苗。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述百日咳疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗是百白破三联疫苗。4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗是麻风腮三联疫苗。5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述联合疫苗使用磷酸铝或氢氧化铝作为吸附剂。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述吸附剂中的铝离子浓度为0.5-1.25mg/mL。7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述联合疫苗为冻干剂型。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述冻干剂型使用蔗糖、氯化钾、氯化钠或谷氮酸钠作为支持剂。9.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述联合疫苗为脂质体。10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述联合疫苗的最终pH为6.0-7.5。11.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述联合疫苗包含中性表面活性剂。12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20、吐温80或曲通X-100。全文摘要本发明提供联合疫苗在治疗肿瘤的新用途。所述联合疫苗包含两种或两种以上选自重组乙肝疫苗、卡介苗、百日咳疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗的疫苗。本发明可以有效的避免免疫力不足的弱点，能产生良好的抗肿瘤效果。文档编号A61K47/26GK101513526SQ20081021996公开日2009年8月26日申请日期2008年12月15日优先权日2008年12月15日发明者孙丽斌,张积仁,胡喜钢申请人:张积仁;孙丽斌